專利名稱：豬鏈球菌胞壁水解酶、其編碼基因及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種豬鏈球菌胞壁水解酶、其編碼基因和應用。技術背景
豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原，可以引起腦膜炎、關節(jié)炎、心內膜炎、敗血癥、肺炎、休克和突然死亡等。該菌按莢膜多糖抗原差異可分為33個血清型，其中2型(SS2)是流行最廣，致病性最強，豬群攜帶率較高的病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失，對公共衛(wèi)生尤其是從業(yè)人員的生命安全亦構成嚴重威脅。荷蘭、英國、美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、比利時、巴西、丹麥、挪威、芬蘭、西班牙、德國、愛爾蘭、日本、中國臺灣及大陸等先后報道了該病。
豬鏈球菌病2型感染后一般采取抗生素治療，但近年來抗生素的濫用，使豬鏈球菌2型產生了嚴重的耐藥性，給該病的防控帶來困難。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種豬鏈球菌胞壁水解酶，能夠有效殺滅豬鏈球菌。
本發(fā)明的另一目的是提供豬鏈球菌胞壁水解酶的基因。
本發(fā)明的再一目的是提供豬鏈球菌胞壁水解酶在殺滅豬鏈球菌方面的應用。
本發(fā)明的目的采用如下技術方案實現(xiàn):
一種豬鏈球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
編碼所述豬鏈球菌胞壁水解酶的基因。所述基因的序列如SEQ ID NO:2所示?？梢岳斫獾氖牵捎诎被崦艽a子的簡并性，本發(fā)明中編碼豬鏈球菌胞壁水解酶的基因除了SEQ ID N0.2所示的序列，還包括編碼上述氨基酸序列的其他核酸分子。
含有豬鏈球菌胞壁水解酶的基因的重組表達載體。所述豬鏈球菌胞壁水解酶的基因序列可以為SEQ ID N0.2所示。所述重組表達載體是將豬鏈球菌胞壁水解酶的基因插入pET-32a (+)的EcoR I和Xho I酶切位點之間。
含有豬鏈球菌胞壁水解酶的基因的重組菌。所述豬鏈球菌胞壁水解酶的基因序列可以為SEQ ID N0.2所示。
一種制備豬鏈球菌胞壁水解酶的方法，通過培養(yǎng)所述重組菌并進行純化后得到所述豬鏈球菌胞壁水解酶。
所述豬鏈球菌胞 壁水解酶在殺滅豬鏈球菌方面的應用。
本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供的豬鏈球菌胞壁水解酶，能夠有效殺滅豬鏈球菌，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及嗜水氣單胞桿菌。
本發(fā)明豬鏈球菌胞壁水解酶的基因可以在重組大腸桿菌中高效表達，所得豬鏈球菌胞壁水解酶活性和穩(wěn)定性高，能夠有效殺滅豬鏈球菌，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及嗜水氣單胞桿菌。采用本發(fā)明重組菌進行制備豬鏈球菌胞壁水解酶，方法簡單，成本低廉。


圖1為重組表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中:1、對照菌的菌體裂解液；2、無IPTG誘導培養(yǎng)的BL21-pET32a-LytA的菌體裂解液；3_6、IPTG誘導培養(yǎng)的BL21-pET32a-LytA的菌體裂解液，誘導時間分別為2h、3h、4h和5h ;7、純化后的重組表達蛋白；M、蛋白分子marker。圖2為驗證重組表達蛋白胞壁水解酶活性的酶譜實驗圖,其中:1、純化的重組表達蛋白；2、對照菌裂解液；M、蛋白分子marker。圖3為重組表達蛋白的Western-blotting分析電泳圖,其中:1、對照菌的菌體裂解液；2、純化后的重組表達蛋白；M、蛋白分子marker。圖4是重組表達蛋白對豬鏈球菌2型HA9801株的平板溶菌試驗照片，其中紙片I上滴加的是純化的重組表達蛋白，紙片2上滴加的是經IPTG誘導培養(yǎng)的含空載體pET32a的BL21裂解液，紙片3上滴加的是PBS緩沖液。圖5是重組表達蛋白對豬鏈球菌2型ZY05719株的平板溶菌試驗照片，其中紙片I上滴加的是純化的重組表達蛋白，紙片2上滴加的是經IPTG誘導培養(yǎng)的含空載體pET32a的BL21裂解液，紙片3上滴加的是PBS緩沖液。圖6是重組表達蛋白對豬鏈球菌2型T15株的平板溶菌試驗照片，其中紙片I上滴加的是純化的重組表達蛋白，紙片2上滴加的是經IPTG誘導培養(yǎng)的含空載體pET32a的BL21裂解液，紙片3上滴加的是PBS緩沖液。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，未注明具體條件的實驗方法、工作原理，通常按照常規(guī)條件進行。本發(fā)明的保護范圍不先于下述的實施例。豬鏈球菌2型T15株的公開信息:Vecht，U.，J.P.Arends, etal.(1989)."Differences in virulence between two strains of Streptococcus suistype II after experimentally induced infection of newborn germ-free pigs."Am JVet Res50(7):1037-1043。實施例1豬鏈球菌胞壁水解酶、其編碼基因的獲得通過酶譜試驗分析了豬鏈球菌2型T15株的胞壁水解酶，發(fā)現(xiàn)該菌株中存在一種豬鏈球菌胞壁水解酶，其分子量約為25kDa，溶解細胞壁活性很強。通過對豬鏈球菌2型T15株的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)如SEQ ID N0:2所示的序列與化膿鏈球菌噬菌體相關胞壁水解酶存在同源性，我們將SEQ ID NO: 2所示的序列命名為LytA。當豬鏈球菌2型T15株缺失LytA后，其酶譜試驗發(fā)現(xiàn)，丟失25kDa處的溶解條帶，說明了 LytA就是豬鏈球菌胞壁水解酶的編碼基因。所述豬鏈球菌胞壁水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。雖然，以上提供了從豬鏈球菌2型T15株中獲得LytA，但是，本領域內技術人員根據(jù)本發(fā)明公開的基因序列，采用其他方法，如合成法，同樣能夠得到LytA，這是顯而易見的。
實施例2豬鏈球菌胞壁水解酶的表達及純化:一.豬鏈球菌胞壁水解酶LytA基因的克隆根據(jù)豬鏈球菌胞壁水解酶基因LytA設計引物進行PCR擴增。上游引物LytA-F包含 EcoR I 酶切位點，序列為 GCGGAATTCATGACAACAGTAAATGAAGTAGTTAAITTTGCCAAAG (SEQIDNO: 3 )。下游引物 LytA-R 包含 Xho I 酶切位點，序列為 GCTCTCGAGCTATTTAAACGTACCATAAGGCACGAC (SEQ ID NO:4)。PCR擴增體系為:2XPfu PCR MasterMix (天根生化科技(北京)有限公司)12.5 μ L、10 μ M/L 的 LytA-Fl μ LUOy M/L 的 LytA-Rl μ L、豬鏈球菌 2 型 T15 株基因組0.5 μ L、雙蒸水 10 μ L。PCR 擴增程序為:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 50s，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin取5 μ L的PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余PCR產物用膠回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)回收。二.重組表達載體的構建用限制性內切酶EcoR I和Xho I (TaKaRa)對PCR擴增產物進行雙酶切，37°C溫育4h，瓊脂糖電泳回收酶切產物。用限制性內切酶EcoR I和Xho I對pET32a載體進行雙酶切，37°C溫育4h，瓊脂糖電泳回收酶切產物。

雙酶切反應體系如下:
權利要求
1.一種豬鏈球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.編碼權利要求1所述豬鏈球菌胞壁水解酶的基因。
3.根據(jù)權利要求2所述基因，其特征在于:所述基因的序列如SEQID N0:2所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體。
5.根據(jù)權利要求4所述重組表達載體，其特征在于該重組表達載體是將豬鏈球菌胞壁水解酶的基因插入PET - 32a的I和沿ο I酶切位點之間。
6.含有權利要求2或3所述基因的重組菌。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌是將權利要求5所述重組表達載體轉化大腸桿菌BL21所得。
8.一種制備豬鏈球菌胞壁水解酶的方法，其特征在于:通過培養(yǎng)權利要求6或7所述重組菌并進行純化后得到所述豬鏈球菌胞壁水解酶。
9.權利要求1所述豬鏈球菌胞壁水解酶在殺滅豬鏈球菌方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供豬鏈球菌胞壁水解酶、其編碼基因及應用，涉及生物技術領域。豬鏈球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明還公開了豬鏈球菌胞壁水解酶的編碼基因及含有豬鏈球菌胞壁水解酶的基因的重組表達載體和重組菌。提供了制備豬鏈球菌胞壁水解酶的方法，通過培養(yǎng)所述重組菌并進行純化后得到所述豬鏈球菌胞壁水解酶。本發(fā)明豬鏈球菌胞壁水解酶，能夠有效殺滅豬鏈球菌，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及嗜水氣單胞桿菌。豬鏈球菌胞壁水解酶的基因可以在重組大腸桿菌中高效表達，所得豬鏈球菌胞壁水解酶活性和穩(wěn)定性高，能夠有效殺滅豬鏈球菌，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及嗜水氣單胞桿菌。
文檔編號C12N9/36GK103146666SQ20131008917
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月20日 優(yōu)先權日2013年3月20日
發(fā)明者陸承平, 張煒, 琚存祥 申請人:南京農業(yè)大學