專利名稱：一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
豬瘟(CSF)是豬的一種重要的傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際獸疫局將豬瘟列入A類法定傳染病之一，自1833年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)后，此病便遍及全世界，雖然很多國(guó)家目前已經(jīng)消滅了豬瘟，但豬瘟仍然是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的第一大傳染病。豬瘟病毒(CSFV)屬于黃病毒科，瘟病毒屬。該病毒是一種有囊膜的正鏈RNA病毒，電鏡下，豬瘟病毒粒子的形態(tài)呈圓形，直徑約為70nm。其中內(nèi)部是電子致密的核心，直徑約為40nm，有時(shí)呈六角形，外有包膜包裹。表面有6-8nm的流蘇樣結(jié)構(gòu)，外包宿主細(xì)胞源的脂質(zhì)囊膜，內(nèi)部呈二十面體對(duì)稱的核衣殼，脂蛋白囊膜上，存在著病毒基因組編碼的囊膜糖蛋白EO、El和E2，組成核衣殼蛋白的C蛋白與病毒基因組相連，以維持核酸的穩(wěn)定性。豬瘟病毒(CSFV)囊膜糖蛋白E2 (即gp55蛋白)是目前研究最為清楚的一種結(jié)構(gòu)蛋白，在豬瘟病毒(CSFV)編碼的蛋白中，E2是最容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的一種蛋白，但又是豬瘟病毒(CSFV)的主要保護(hù)性抗原結(jié)構(gòu)域蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。E2蛋白有ORF編碼的370個(gè)氨基酸殘基組成，在感染細(xì)胞中，其分子量為56kD，主要以同源二聚體或異源二聚體的形式存在于感染細(xì)胞或病毒粒子的表面，這主要是因?yàn)镋2蛋白的羧基端有一段長(zhǎng)達(dá)約40個(gè)疏水性氨基酸殘疾的跨膜區(qū)。利用這個(gè)E2蛋白的各種單抗，人們已經(jīng)鑒定出豬瘟病毒(CSFV) E2蛋白具有四個(gè)主要抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C和D，其中A、B、C含有中和性抗原表位，這些抗原結(jié)構(gòu)域位于E2蛋白近N端的1/2部分，且處于兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單位。人們的這些研究 為以后制備豬瘟抗原提供了方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法，所用合成基因如SEQ IDN0.1所示。上述方法，包括以下步驟:
第一步，給合成基因加上基因引物得目的基因，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物回收；
第二步，將目的基因?qū)胼d體中，形成重組載體；
第三步，重組載體導(dǎo)入原核細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)。步驟(I)中所用基因引物為BamHI酶切位點(diǎn)和Hind III酶切位點(diǎn)，其中在5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)，3’端加上Hind III酶切位點(diǎn)。
步驟(2)中所用載體為質(zhì)粒pET28a，所用原核細(xì)菌為大腸桿菌，較好的選用大腸桿菌BL21。本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有的豬瘟病毒E2基因的主要抗原區(qū)進(jìn)行了整合，并針對(duì)不同株型的特異性進(jìn)行兼并性分析，同時(shí)避開大腸桿菌中的稀有密碼子，以此合成全序列長(zhǎng)度為360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)。采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行表達(dá)，方法操作簡(jiǎn)單，方便，所得抗原蛋白具有強(qiáng)的特異免疫原活性，為今后開發(fā)基因工程亞單位疫苗、診斷檢測(cè)豬瘟抗體和制備檢測(cè)豬痕病的單克隆抗體的研究提供了良好的基礎(chǔ)。


圖1為誘 導(dǎo)表達(dá)豬瘟E2蛋白SDS-PAGE電泳圖，圖中，第一泳道為MarkerProteinRuler I，第二泳道CK為未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21菌株的全蛋白，1、2、3分別是用IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21全蛋白序列。CK中無(wú)目的條帶，1、2、3在15KD左右有明顯的目的條帶；
圖2為N1-NTA親和層析柱純化后豬瘟E2蛋白SDS-PAGE電泳圖，圖中，第I泳道為洗脫柱子時(shí)收集的第I毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖;第2泳道為洗脫柱子時(shí)收集第2毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖；第3泳道為洗脫柱子時(shí)收集第3毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖；第4泳道為洗脫柱子時(shí)收集第4毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖；第5泳道為洗脫柱子時(shí)收集第5毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖；第6泳道為洗脫柱子時(shí)收集第6毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖；第7泳道為洗脫柱子時(shí)收集第7毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖；第8泳道為洗脫柱子時(shí)收集第8毫升洗脫液的目的蛋白純化效果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此。實(shí)施例1
1、用DNAMAN軟件對(duì)GenBank中18株E2基因進(jìn)行比對(duì)分析，選取豬瘟病毒E2基因的主要抗原區(qū)，其中涵蓋了 E2基因A、B、C、D所有的抗原區(qū)，并針對(duì)不同株型的特異性進(jìn)行兼并性分析，同時(shí)避開大腸桿菌中的稀有密碼子，以此合成全序列長(zhǎng)度為360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)。2、根據(jù)合成的基因序列設(shè)計(jì)引物:5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)5’ -TTTGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3’ ；3’ 端加上 Hind III酶切位點(diǎn) 5’-CCCAAGCTTACCGTTCAACAAGGTTG-3’。所得基因?yàn)槟康幕颍肁xyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒(購(gòu)自Axygen公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收，接著對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系=BamHI和Hind III各I微升，回收產(chǎn)物 30 微升，Buffer Tango (購(gòu)自 Thermo Scientific 公司,Lot:00097285) 4微升，無(wú)菌雙蒸水4微升，酶切三個(gè)小時(shí)。3、對(duì)質(zhì)粒pET28a用BamHI和Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切體系=BamHI和Hind III各I微升，質(zhì)粒 10 微升，Buffer Tango (購(gòu)自 Thermo Scientific 公司，Lot:00097285) 4 微升，無(wú)菌雙蒸水24微升，酶切三個(gè)小時(shí)。并與上述雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，酶連體系為:目的基因4微升，質(zhì)粒I微升，T4連接酶I微升，10*T4連接酶Buffer (購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Lot:G20924)l微升，無(wú)菌雙蒸水3微升。16°C，反應(yīng)0.5小時(shí)，得到重組新載體 pET28a_xE2。4、重組質(zhì)粒pET28a_xE2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS表達(dá)菌株中。取I微升重組質(zhì)粒pET28a-xE2加入到100微升大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min, 42°C水浴90s熱激，冰上放置2min，加入Iml LB液體培養(yǎng)基，37°C，220r/min培養(yǎng)Ih0之后室溫25°C,8000r/min離心2min,棄上清留100微升液體,混勻,涂布在100 μ g/ml卡那霉素的固體LB平板上。5、37°C倒置培養(yǎng)12h_16h，用10微升無(wú)菌槍頭挑取平板上單菌落加入到還有Iml含100 μ g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min培養(yǎng)5h.取500微升菌液測(cè)序(華大基因負(fù)責(zé)測(cè)序)分析。6、確定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),在200ml 100 μ g/ml卡那霉素液體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，接種量為2%，37°C 200r/min培養(yǎng)至菌體濃度為0.20D_，然后用濃度
0.4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)豬瘟E2蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖1所示。7、誘導(dǎo)結(jié)束后室溫25°C、10000r/min離心IOmin棄去上清液，然后用IOml生理鹽水復(fù)懸，用35%強(qiáng)度，間隔5s超聲波對(duì)菌體進(jìn)行30min破碎，將破碎并離心(25 °C，10000r/min離心IOmin)后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，在15kD，有目的蛋白。N1-NTA親和層析柱純化后豬瘟E2蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖2所示。實(shí)施例2
1、用DNAMAN對(duì)GenBank中18株E2基因進(jìn)行比對(duì)分析，選取豬瘟病毒E2基因的主要抗原區(qū)，其中涵蓋了 E2基因A、B、C、D所有的抗原區(qū)，并針對(duì)不同株型的特異性進(jìn)行兼并性分析，同時(shí)避開大腸桿菌中的稀有密碼子，以此合成全序列長(zhǎng)度為360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)。2、根據(jù)合成的基因序列設(shè)計(jì)引物:5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)5’ -TTTGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3’ ；3’ 端加上 Hind III酶切位點(diǎn) 5’-CCCAAGCTTACCGTTCAACAAGGTTG-3’。所得基因?yàn)槟康幕?，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒(購(gòu)自Axygen公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收，接著對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系=BamHI和Hind III各I微升，回收產(chǎn)物 30 微升，Buffer Tango (購(gòu)自 Thermo Scientific 公司，Lot:00097285) 4微升，無(wú)菌雙蒸水4微升，酶切三個(gè)小時(shí)。3、對(duì)質(zhì)粒pET30a用BamHI和Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切體系=BamHI和Hind III各I 微升，質(zhì)粒 10 微升，Buffer Tango (購(gòu)自 Thermo Scientific 公司，Lot:00097285) 4 微升，無(wú)菌雙蒸水24微升，酶切三個(gè)小時(shí)。并與上述雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接(酶連體系:目的基因4微升，質(zhì)粒I微升，T4連接酶I微升，10*T4連接酶Buffer (購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Lot:G20924)l微升，無(wú)菌雙蒸水3微升。16°C，反應(yīng)0.5小時(shí))，得到重組新載體 pET30a-xE2o4、重組質(zhì)粒pET30a_xE2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株中。取I微升重組質(zhì)粒pET30a-xE2加入到100微升大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min，42°C水浴90s熱激，冰上放置lmin，加入Iml LB液體培養(yǎng)基，37°C 220r/min培養(yǎng)lh。室溫8000r/min離心2min,棄上清留100微升液體,混勻,涂布在100 μ g/ml卡那霉素的固體LB平板上。5、37°C倒置培養(yǎng)12h_16h ，用10微升無(wú)菌槍頭挑取平板上單菌落加入到還有Iml含100 μ g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min培養(yǎng)5h.取500微升菌液測(cè)序(華大基因負(fù)責(zé)測(cè)序)分析。6、確定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在200ml 100 μ g/ml卡那霉素液體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，接種量為2%，37°C 200r/min培養(yǎng)至菌體濃度為0.20D_，然后用濃度
0.4mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo) 5h 表達(dá)。7、誘導(dǎo)結(jié)束后室溫25°C，10000r/min離心IOmin棄去上清液，然后用1Oml生理鹽水復(fù)懸，用35%強(qiáng)度，間隔5s超聲波對(duì)菌體進(jìn)行30min破碎，取破碎并離心(室溫25°C，10000r/min離心1Omin)后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。在15kD，有目的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法，其特征在于，所用合成基因如SEQ ID N0.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，給合成基因加上基因引物得目的基因； 第二步，將目的基因?qū)胼d體中，形成重組載體； 第三步，重組載體導(dǎo)入原核細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)。
3.如權(quán)利要求2所述一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法，其特征在于，第一步中所述基因引物為BamHI酶切位點(diǎn)和Hind III酶切位點(diǎn)，其中5’端加上BamHI酶切位點(diǎn)，3’端加上Hind III酶切位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求2所述一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法，其特征在于，第二步中所用載體為質(zhì)粒pET28a，所用原核細(xì)菌為大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)方法，其特征在于，所述大腸桿菌為BL21。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬瘟病毒特異性抗原蛋白gp55特定位點(diǎn)原核表達(dá)的方法，該方法合成全序列長(zhǎng)度為360bp的xE2核苷酸序列(即合成的基因序列)，合成基因如SEQIDNO.1所示，給合成基因加上基因引物得目的基因，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物回收；將目的基因?qū)胼d體中，形成重組載體；然后把重組載體導(dǎo)入原核細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，方便，所得抗原蛋白具有強(qiáng)的特異免疫原活性，為今后開發(fā)基因工程亞單位疫苗、診斷檢測(cè)豬瘟抗體和制備檢測(cè)豬瘟病的單克隆抗體的研究提供了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103146718SQ20131009258
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者孫強(qiáng), 魯龍, 曾小宇, 任寶紅, 王朋, 李慧英, 王真, 何宏軒, 路紀(jì)琪, 張如民, 趙林萍 申請(qǐng)人:鄭州中道生物技術(shù)有限公司