專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻的白葉枯病抗性的鑒定方法及miRNA1318基因位點(diǎn)的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種水稻的白葉枯病抗性的鑒定方法及miRNA1318基因位點(diǎn)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是我國(guó)最主要的糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，以亞洲稻區(qū)發(fā)生為重。白葉枯病發(fā)病率高、傳染快，發(fā)病稻田減產(chǎn)20-30%，甚至能夠達(dá)到50%。培育并利用抗病品種是解決白葉枯病造成的糧食減產(chǎn)最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段，因此，需要對(duì)所栽培的水稻白葉枯病抗性進(jìn)行鑒定。目前，鑒定水稻白葉枯病的方法通常采用DNA (Deoxyribonucleic acid,脫氧核糖核酸)分子標(biāo)記,利用DNA連鎖標(biāo)記的原理,鑒定水稻是否帶有白葉枯病抗性基因，與傳統(tǒng)應(yīng)用的常規(guī)遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有不受季節(jié)、環(huán)境限制、不存在表達(dá)與否及基因組DNA變異及其豐富等優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題:即便患病的植株中存在抗性基因也不代表該抗性基因具有活性，如果該抗性基因沉默了，那么在生產(chǎn)時(shí)依舊會(huì)表現(xiàn)為感病，干擾實(shí)驗(yàn)人員的判斷，若直接投入到生產(chǎn)中，會(huì)給糧食生產(chǎn)帶來(lái)?yè)p失。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決利用DNA分子標(biāo)記鑒`定水稻是否抗白葉枯病不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種水稻的白葉枯病抗性的鑒定方法及miRNA1318基因位點(diǎn)的應(yīng)用。所述技術(shù)方案如下:一方面，本發(fā)明提供了一種水稻的白葉枯病抗性的鑒定方法，包括以下步驟:接種待測(cè)水稻和感病水稻；分離所述待測(cè)水稻和所述感病水稻中的miRNA基因；檢測(cè)所述miRNA基因中的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)；根據(jù)所述miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，判定所述待測(cè)植株是否抗白葉枯病。具體地,所述miRNA1318基因位點(diǎn)的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。具體地，將白葉枯菌系P6接種于所述待測(cè)水稻和所述感病水稻上。進(jìn)一步地，所述接種的部位為所述待測(cè)水稻和所述感病水稻的葉片。具體地，接種后第84-108小時(shí)，分離所述miRNA基因。進(jìn)一步地，采用miRNA基因分離試劑盒分離所述miRNA基因。具體地，采用液相Northern雜交法檢測(cè)所述miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)。進(jìn)一步地,所述液相Northern雜交法所用的探針的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述探針的5’端標(biāo)記有熒光素FITC。具體地，判定所述待測(cè)植株是否抗白葉枯病的方法為:若所述感病水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)和所述待測(cè)水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)相等，則所述待測(cè)水稻感病；若所述感病水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)大于所述待測(cè)水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)，則所述待測(cè)水稻抗病。另一方面，本發(fā)明提供了一種miRNA1318基因位點(diǎn)在鑒定水稻的白葉枯病抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是:miRNA基因與普通RNA基因不一樣，其序列較短，不容易降解，因此，已經(jīng)在人類(lèi)疾病如癌癥檢測(cè)中得到了應(yīng)用，但利用miRNA基因檢測(cè)與診斷植物疾病例子很少，主要是因?yàn)橹参飉iRNA基因的研究相對(duì)落后于人類(lèi)miRNA基因的研究，通過(guò)大量樣本的水稻miRNA基因與白葉枯抗性關(guān)系的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miRNA1318基因的表達(dá)與白葉枯抗性密切相關(guān)，由此首次提出miRNA1318基因具有檢測(cè)水稻白葉枯抗性的能力，本發(fā)明檢測(cè)待測(cè)水稻和感病水稻中miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)，通過(guò)結(jié)果的比對(duì)，鑒定待測(cè)水稻是否抗白葉枯病，本發(fā)明利用miRNA1318基因位點(diǎn)鑒定水稻是否具有白葉枯病抗性，并獲得了成功，本發(fā)明提供的miRNA1318基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄是建立在表達(dá)水平上的檢測(cè)，避免了由白葉枯病的抗性基因沉默而造成的誤判，本發(fā)明未利用常規(guī)的DNA連鎖標(biāo)記法，避免了由于DNA連鎖不緊密造成的誤判，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免了不必要的生產(chǎn)損失。


為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明中所用的試劑均為市售試劑。實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)將水稻的miRNA基因與標(biāo)記好miRNA1318基因的探針混合雜交，并通過(guò)非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并將待測(cè)水稻和感病水稻的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而判斷待測(cè)水稻是否抗白葉枯病，其具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下。感病水稻:選取生長(zhǎng)正常且表面沒(méi)有明顯病蟲(chóng)害的，標(biāo)號(hào)為9311的不抗白葉枯病的水稻種子。待測(cè)水稻:選取標(biāo)號(hào)為9311的抗白葉枯病的水稻種子。其中，抗白葉枯病的水稻種子中具有抗性基因Xa23。種子的前處理:用濃度為70%的酒精浸泡2分鐘，再用去離子水洗2次，在30°C的水中浸泡過(guò)夜，在30°C的溫度下對(duì)種子進(jìn)行催芽，待芽長(zhǎng)出來(lái)后，播種于秧田中，秧田管理與普通栽培習(xí)慣相同，待秧苗長(zhǎng)到4-5個(gè)葉片時(shí)，移栽至大田中，大田管理與普通栽培習(xí)慣相同。白葉枯菌系培養(yǎng):選用對(duì)水稻具有強(qiáng)致病性的白葉枯菌系P6 (Xanthomonasoryzae pv.0ryzae Philippine race6),該白葉枯菌系P6來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，將白葉枯菌系P6于培養(yǎng)溫度為30°C的條件下，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato-Dextrose-Agar，PSA)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的成份如下:質(zhì)量體積比為1%的蔗糖、質(zhì)量體積比為1%的蛋白胨、質(zhì)量體積比為0.1%的谷氨酸鹽和質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂。培養(yǎng)時(shí)間為2-5天，將白葉枯菌系P6培養(yǎng)至肉眼可以觀察到的菌濃為止。白葉枯菌濃度測(cè)定:在接種水稻的葉片前，將白葉枯菌系P6溶解于水中，利用分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)測(cè)定600nm處的吸光0D600值，并將菌液稀釋到0D600值為0.5，此時(shí)菌液的濃度大約為5X 108cfu/ml左右，用于接種水稻的葉片。白葉枯菌系接種:在待測(cè)水稻和感病水稻抽穗前，分別接種白葉枯菌系P6，接種方法為剪葉接種，具體地，將剪刀浸入0D600值為0.5的白葉枯菌系P6的菌液中1-2秒，再用沾有菌液的剪刀從距葉片頂部l_2cm處剪去葉片，此時(shí)，計(jì)為接種0小時(shí)，在接種第84-108小時(shí)，分別取待測(cè)水稻和感病水稻接種部位的葉片各0.5克左右，分別裝入容積為
1.5ml的離心管中，并立即投入液氮中保存，且待測(cè)水稻和感病水稻至少分別取3份樣本材料做重復(fù)實(shí)驗(yàn)。miRNA基因的提取:利用miRNA基因分離試劑盒(miRNA基因分離試劑盒為市售，貨號(hào):R6727，生產(chǎn)公司:0mega，該試劑盒具體包括:RNA離心柱、基因組DNA去除離心柱、收集管、MCL裂解緩沖液、XD結(jié)合緩沖液、RNA洗脫液I1、DEPC水)分離待測(cè)水稻和感病水稻葉片中的miRNA基因，具體操作方法如下:從液氨中分別取出待測(cè)水稻和感病水稻的葉片，并將兩組葉片分別置于兩個(gè)研缽中，立即向研缽中倒入液氮，并充分研磨，各取大約IOOmg研磨好的粉未置于1.5ml的離 心管中，加700 u L的裂解液，渦旋30秒以混勻樣品，55° C保溫30分鐘，在離心力為12000 X g的室溫條件下離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至離心柱中離心，用于去除基因組中的DNA，12000 Xg室溫離心2分鐘，并將流出的液體轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mL的離心管中，向液體中加入該液體體積1.1倍的無(wú)水乙醇并渦旋20秒混勻，將液體轉(zhuǎn)移至RNA離心柱中12000 Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 ii L濃度為96-100%的乙醇到RNA離心柱中，再12000 Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 u L XD結(jié)合緩沖液到RNA離心柱中，12000Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入750 u L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，再加入750 ii L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液。將RNA離心柱在大于12000 X g的最大速度下，室溫離心2分鐘，向RNA離心柱中加入30-50 u L DEPC水，室溫下放置5分鐘，大于12000 X g的最大速度下，室溫，離心I分鐘，離心獲得的液體即為miRNA基因溶液，將該溶液保存于-70°C。miRNA基因定量:利用分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)測(cè)定獲得的miRNA基因的濃度。miRNA1318 基因位點(diǎn)的序列:5’ -caggugucaucuccccugaac-3’。miRNA1318基因位點(diǎn)的雜交探針:設(shè)計(jì)miRNA1318基因位點(diǎn)的DNA探針為5’ -gttcaggggagatgacacctg-3’，其中，該探針的5’端標(biāo)記有突光素FITC。該探針標(biāo)記與合成由上海Invitrigen公司完成。
配制雜交緩沖液:其成份如下:30mM pH8.0的磷酸鈉緩沖液，0.3M NaCl溶液和IOmM EDTA,配制好后，用濃度為0.1%的DEPC (diethyl pyrocarbonate ;焦碳酸二乙酯)37°C處理12小時(shí)后，120°C滅菌20分鐘待用。液相Northern雜交:用兩個(gè)PCR管，分別取5 U g的待測(cè)水稻和感病水稻的葉片的miRNA溶液、5 ill的雜交緩沖液和lullOpM/ul的miRNA1318基因位點(diǎn)的雜交探針，混合均勻，制成液相Northern雜交液，在42°C保溫I小時(shí)后加入5ul2000U/ml的核酸外切酶I(由NEB公司生產(chǎn)，商品貨號(hào)為M0303)消化2小時(shí)。其中，采用液相Northern雜交法，在探針的5’端有一個(gè)FITC標(biāo)記，該標(biāo)記在紫外照射下即可發(fā)光，所以，電泳完成后，直接放在紫外線(xiàn)下照射即可看到條帶，并不需要放射自顯影這些麻煩的步驟，也不需要3’端進(jìn)行標(biāo)記，其方法簡(jiǎn)單。另外，那些在 液體中沒(méi)有被雜交上的探針被DNA酶消化掉了，并不影響最后的結(jié)果。濃度為6%的非變性聚丙稀酰胺凝膠的制備:取20mL ACT:Bis=29:1的濃度為30%的非變性聚丙稀酰胺凝膠母液(武漢谷歌生物科技有限公司生產(chǎn))，加濃度為I倍的TBE緩沖液(上海迪申生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)為B1610733)80mL，配制成濃度為6%的非變性聚丙稀酰胺凝膠溶液，取配制好的濃度為6%的非變性聚丙稀酰胺凝膠溶液16mL，加16 y L濃度為10%的過(guò)硫酸銨和160 y L的N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)，其中TEMED的濃度>99.0%，將上述溶液混合均勻后，迅速灌膠于膠板之中(灌膠裝置由北京六一儀器設(shè)備廠生產(chǎn)，型號(hào)為DYCZ-24DN)，并室溫于放置2小時(shí)后即可使用。 電泳檢測(cè):將上述液相Northern雜交液加上2ul 10X的電泳緩沖液(美國(guó)Lifetechnology公司生產(chǎn)，商品貨號(hào)為AM8556)，利用濃度為6%的非變性聚丙稀酰胺凝膠在100V的電壓下電泳30分鐘，于紫外線(xiàn)下觀察并照相，結(jié)果見(jiàn)附圖1。由圖1可知，圖中左側(cè)的條帶為感病水稻，右側(cè)的條帶為待測(cè)水稻，其中，左側(cè)的條帶寬度明顯大于右側(cè)的條帶的寬度，所以，感病水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)大于待測(cè)水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)，則待測(cè)水稻抗病。按前述的方法接種P6白葉枯菌的感病水稻和待測(cè)水稻的在大田中繼續(xù)生長(zhǎng)15天后，測(cè)量枯萎葉片長(zhǎng)度，結(jié)果表明感病水稻枯萎葉片長(zhǎng)度分別大于10cm，而待測(cè)水稻的枯萎葉片長(zhǎng)度分別小于lcm，表明栽種的感病水稻表現(xiàn)為感病，栽種的待測(cè)水稻檢測(cè)出來(lái)為抗
病，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種水稻的白葉枯病抗性的鑒定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 接種待測(cè)水稻和感病水稻； 分離所述待測(cè)水稻和所述感病水稻中的miRNA基因； 檢測(cè)所述miRNA基因中的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)； 根據(jù)所述miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，判定所述待測(cè)植株是否抗白葉枯病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述miRNA1318基因位點(diǎn)的序列如序列表中 SEQ ID NO:1 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將白葉枯菌系P6接種于所述待測(cè)水稻和所述感病水稻上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述接種的部位為所述待測(cè)水稻和所述感病水稻的葉片。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，接種后第84-108小時(shí)，分離所述miRNA基·因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，采用miRNA基因分離試劑盒分離所述miRNA基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用液相Northern雜交法檢測(cè)所述miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述液相Northern雜交法所用的探針的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述探針的5’端標(biāo)記有熒光素FITC。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，判定所述待測(cè)植株是否抗白葉枯病的方法為:若所述感病水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)和所述待測(cè)水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)相等，則所述待測(cè)水稻感??；若所述感病水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)大于所述待測(cè)水稻的miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)，則所述待測(cè)水稻抗病。
10.一種miRNA1318基因位點(diǎn)在鑒定水稻的白葉枯病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻的白葉枯病抗性的鑒定方法及miRNA1318基因位點(diǎn)的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括接種待測(cè)水稻和感病水稻；分離待測(cè)水稻和感病水稻中miRNA基因；檢測(cè)miRNA1318基因位點(diǎn)的表達(dá)；判定待測(cè)植株是否抗白葉枯病。所述的miRNA1318基因位點(diǎn)在鑒定水稻的白葉枯病抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明首次利用miRNA1318基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄鑒定水稻是否具有白葉枯病抗性，并獲得了成功，本發(fā)明提供的miRNA1318基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄是建立在表達(dá)水平上的檢測(cè)，避免了由白葉枯病的抗性基因沉默而造成的誤判，本發(fā)明的鑒定方法未利用常規(guī)的DNA連鎖標(biāo)記法，避免了由于DNA連鎖不緊密造成的誤判，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免了不必要的生產(chǎn)損失。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184288SQ20131009328
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者彭海, 高麗芬, 周俊飛, 章偉雄 申請(qǐng)人:海南廣陵高科實(shí)業(yè)有限公司, 江漢大學(xué)