專利名稱：一種富油微藻的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻生物能源領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾年，隨著化石燃料儲(chǔ)量日益降低，化石燃料的枯竭和不可再生性及其燃燒導(dǎo)致的全球變暖、環(huán)境污染等問題，迫使世界各國尋找可以替代化石燃料的綠色、可持續(xù)發(fā)展的新能源。生物質(zhì)能可以利用光合作用將太陽能以化學(xué)能的形式儲(chǔ)存在生物體內(nèi)，是地球上最普遍的環(huán)保型可再生能源。在眾多的生物質(zhì)能中，生物柴油已為了世界上發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的綠色新能源，受到了廣泛的關(guān)注。生物柴油的主要成份是脂肪酸甲酯，有著與石化柴油相近的性能，且具有優(yōu)良的燃燒性能、環(huán)保性和可再生性。其主要原料來源于植物油脂(大豆油、菜籽油、玉米油、麻風(fēng)樹油、棕櫚油和花生油等)、動(dòng)物油脂(動(dòng)物脂肪酸)和廢棄食用油(地溝油)。然而，現(xiàn)有生物柴油發(fā)展的瓶頸在于原料價(jià)格高、供應(yīng)嚴(yán)重不足，且加大生物柴油的生產(chǎn)勢(shì)必會(huì)與其他農(nóng)作物爭(zhēng)奪土地，導(dǎo)致糧食供應(yīng)問題。因此，亟需尋求低成本、大規(guī)模、可持續(xù)供應(yīng)的油脂原料來源。與其他生物柴油的原料相比，以微藻油脂生產(chǎn)生物柴油有著明顯的優(yōu)勢(shì)。微藻的含油量高、生長周期短、油脂產(chǎn)率要遠(yuǎn)高于普通的產(chǎn)油作物。微藻培養(yǎng)不與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)沖突，可以在鹽堿地、灘涂、荒漠地區(qū)及鹽堿水、海水和廢水等非農(nóng)用水中進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。微藻除了用于提取油脂外，還可開發(fā)高附加值產(chǎn)品(活性蛋白、活性多糖、天然色素、沼氣、飼料、表面活化劑等)，用以降低微藻生物柴油的成本。微藻生物柴油規(guī)?；a(chǎn)的首要任務(wù)是篩選油脂含量高、生長迅速和抗逆性強(qiáng)的藻株，而微藻的培養(yǎng)方式在富油藻種的選育中起到重要的作用。微藻的培養(yǎng)方式主要分為自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合培養(yǎng) 三種方式。自養(yǎng)培養(yǎng)是以無機(jī)碳化合物為碳源，利用微藻的光合作用將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為生物能的營養(yǎng)方式。其操作簡(jiǎn)單、成本較低，但得到的細(xì)胞密度低、光合效率低，規(guī)模培養(yǎng)時(shí)微藻收獲困難，難以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。異養(yǎng)培養(yǎng)是在無光照條件下利用有機(jī)碳源作為能源和碳源，可以進(jìn)行藻類的高密度培養(yǎng)并大大提高微藻的油脂產(chǎn)率，這相應(yīng)的降低了采收的難度和提取成本，但異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)成本和能耗均較高?；旌吓囵B(yǎng)是指微藻利用無機(jī)物和有機(jī)物作為碳源的培養(yǎng)方式，能同時(shí)利用藻類光能自養(yǎng)和異養(yǎng)生長的能力，據(jù)報(bào)道其比生長速率約等于自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的總和，可以實(shí)現(xiàn)自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，故混合培養(yǎng)是一種比較適合的培養(yǎng)方式。此外，傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法測(cè)定微藻油脂含量存在耗時(shí)費(fèi)力、所需試劑和樣品量大、毒性試劑會(huì)對(duì)人體和環(huán)境造成危害等問題，難以滿足富油微藻篩選過程中高通量測(cè)定油脂含量的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了篩選能進(jìn)行混合培養(yǎng)的富油藻種，并解決現(xiàn)有微藻有機(jī)溶劑提取法存在耗時(shí)費(fèi)力、所需試劑和樣品量大、毒性試劑會(huì)對(duì)人體和環(huán)境造成危害，難以滿足微藻篩選中高通量測(cè)定油脂含量的需要的問題，而提供一種富油微藻的高通量篩選方法。本發(fā)明的一種富油微藻的高通量篩選方法，是通過以下步驟實(shí)現(xiàn):一、取微藻樣品加入到培養(yǎng)基A中富集培養(yǎng)15 30天，得藻液；二、取步驟一得到的藻液，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養(yǎng)基A中,在溫度為25°C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天；三、重復(fù)步驟二 2 3次，得藻液A ;四、取步驟三得到的藻液A，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養(yǎng)基B中，在溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天，得藻液B ;五、取步驟四得到的藻液B以無菌水按10'10_2、10_3、10_4、10_5和10_6的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將10_5 10_6倍數(shù)稀釋后的藻液均勻涂布于固體培養(yǎng)基C平板上，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)藻落；六、在無菌環(huán)境中，挑取單藻落，轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基B中，在溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天；七、重復(fù)步驟五至步驟六3 4次，即完成藻株的分離，得到微藻液；八、取3 IOmL步驟七得到的微藻液，用超聲波進(jìn)行破碎，在破碎后的藻液中加入尼羅紅溶液，混勻后，測(cè)定藻液的熒光強(qiáng)度，選擇熒光強(qiáng)度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；其中，步驟一和步驟二中所述的培養(yǎng)基A按重量份數(shù)是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸和0.005 0.01份微量元素組成的；步驟四和步驟六中所述的培養(yǎng)基B按重量份數(shù)是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、0.005 0.01份微量元素和5 50份葡萄糖組成的；步驟五中所述的固體培養(yǎng)基C按重量份數(shù)是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、0.005 0.01份微量元素、5 50份葡萄糖和5 20份瓊脂組成的；步驟八中所述的 藻液與尼羅紅溶液的體積比為3:1000。本發(fā)明包含以下有益效果:本發(fā)明采用一種熒光染色的方法，避免了冗繁的傳統(tǒng)油脂檢測(cè)步驟，克服了藻種大規(guī)模篩選缺乏快速、高通量的篩選方法的瓶頸問題。表I為有機(jī)溶劑提取法與熒光法的比較，由表可知，本發(fā)明的方法具有所需樣品量小、測(cè)定快速、耗時(shí)少、對(duì)人和環(huán)境無毒性等優(yōu)點(diǎn)。表I有機(jī)溶劑提取法與熒光法比較表
權(quán)利要求
1.一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于富油微藻的高通量篩選方法是通過以下步驟實(shí)現(xiàn):一、取微藻樣品加入到培養(yǎng)基A中富集培養(yǎng)15 30天，得藻液；二、取步驟一得到的藻液，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養(yǎng)基A中，在溫度為25°C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天；三、重復(fù)步驟二 2 3次，得藻液A ;四、取步驟三得到的藻液A，按體積百分含量為10%的接種量接種于培養(yǎng)基B中，在溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天，得藻液B;五、取步驟四得到的藻液B以無菌水按10'10_2、10_3、10_4、10_5和10_6的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將10_5 10_6倍數(shù)稀釋后的藻液均勻涂布于固體培養(yǎng)基C平板上，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)藻落；六、在無菌環(huán)境中，挑取單藻落，轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基B中，在溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 14天；七、重復(fù)步驟五至步驟六3 4次，即完成藻株的分離，得到微藻液；八、取3 IOmL步驟七得到的微藻液，用超聲波進(jìn)行破碎，在破碎后的藻液中加入尼羅紅溶液，混勻后，測(cè)定藻液的熒光強(qiáng)度，選擇熒光強(qiáng)度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株； 其中，步驟一和步驟二中所述的培養(yǎng)基A按重量份數(shù)是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸和0.005 0.01份微量元素組成的； 步驟四和步驟六中所述的培養(yǎng)基B按重量份數(shù)是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、0.003 0.012份檸檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、0.005 0.01份微量元素和5 50份葡萄糖組成的； 步驟五中所述的固體培養(yǎng)基C按重量份數(shù)是由0.1 1.5份硝酸鈉、0.018 0.09份硫酸鎂、0.02 0.08份磷酸氫二鉀、0.009 0.054份氯化鈣、0.01 0.06份碳酸鈉、.0.003 0.012份 檸 檬酸、0.003 0.012份檸檬酸鐵銨、0.0005 0.01份乙二胺四乙酸、.0.005 0.01份微量元素、5 50份葡萄糖和5 20份瓊脂組成的； 步驟八中所述的藻液與尼羅紅溶液的體積比為3:1000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟一中所述的微藻樣品為小球藻、柵藻、娃藻、隱甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻、金藻中的一種或幾種按任意比混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟一和步驟二中所述的培養(yǎng)基A按重量份數(shù)是由I份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素組成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟四和步驟六中所述的培養(yǎng)基B按重量份數(shù)是由0.5份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、.0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖組成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于步驟五中所述的固體培養(yǎng)基C按重量份數(shù)是由0.5份硝酸鈉、0.075份硫酸鎂、0.04份磷酸氫二鉀、0.036份氯化鈣、0.02份碳酸鈉、0.006份檸檬酸、0.006份檸檬酸鐵銨、0.001份乙二胺四乙酸、.0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份瓊脂組成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或5所述的一種富油微藻的高通量篩選方法，其特征在于所述的微量元素為0.00286重量份的硼酸、0.00181重量份的氯化錳、0.00039重量份的鑰酸鈉、.0.000222重量份 的 硫酸鋅、0.000079重量份的硫酸銅和0.000049重量份的硝酸鈷。
全文摘要
一種富油微藻的高通量篩選方法，它涉及微藻生物能源領(lǐng)域。本發(fā)明要解決現(xiàn)有微藻有機(jī)溶劑提取法存在耗時(shí)費(fèi)力、所需試劑和樣品量大、毒性試劑會(huì)對(duì)人體和環(huán)境造成危害，難以滿足微藻篩選中高通量測(cè)定油脂含量的需要的問題。本發(fā)明的方法如下一、取微藻富集培養(yǎng)，培養(yǎng)7～14天；二、重復(fù)2～3次；三、接種后，培養(yǎng)7～14天；四、進(jìn)行稀釋后涂布，培養(yǎng)至出現(xiàn)藻落；五、挑取生長較快、較大的單藻落，培養(yǎng)7～14天；六、重復(fù)步驟四至步驟五3～4次；八、超聲波進(jìn)行破碎后加入尼羅紅溶液，選擇熒光強(qiáng)度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；本發(fā)明避免了冗繁的傳統(tǒng)油脂檢測(cè)步驟，克服了藻種大規(guī)模篩選缺乏快速、高通量篩選方法的瓶頸問題。
文檔編號(hào)C12N1/12GK103146582SQ201310096030
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者任南琪, 任宏宇, 劉冰峰, 謝國俊, 趙磊, 馬超 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)