一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟：1）經(jīng)過預處理的魚皮混合液加入復合蛋白酶進行酶解；其中所述復合蛋白酶至少包含木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中兩種；2）將得到的酶解液進行離心處理，取上清液；3）將上清液超濾濃縮后進行鹽析；4）再次進行超濾脫鹽并濃縮；其中，魚皮混合液的濃度為2.0～8.0wt%，pH為2～6，所述復合蛋白酶的添加量為魚皮混合液重量的2.0～8.0wt%。本發(fā)明方法安全性高，無副作用，所制備得到的活性膠原蛋白具有提取率、純度和熱變性溫度等優(yōu)點。
【專利說明】一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物化學領(lǐng)域，尤其涉及膠原蛋白的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0003]國內(nèi)目前對利用復合酶提取活性膠原蛋白的研究剛剛起步，國內(nèi)數(shù)所高校進行了復合酶提取活性膠原蛋白的研究，在蛋白酶的選擇、酶解工藝等方面取得一定的進展。目前采用酶解法提取活性膠原蛋白，應(yīng)用的蛋白水解酶較為單一，主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。對于大多數(shù)活性膠原蛋白的生物活性來說，其工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的難度，主要是因為酶在膠原蛋白水解過程中容易變性，分離和提純難度大，檢測手段和技術(shù)不夠成熟。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:針對上述現(xiàn)有存在的問題和不足，本發(fā)明的目的是提供了一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法。
[0005]技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟:1)經(jīng)過預處理的魚皮混合液加入復合蛋白酶進行酶解；其中所述復合蛋白酶至少包含木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中兩種；2)將得到的酶解液進行離心處理，取上清液；3)將上清液超濾濃縮后進行鹽析；4)再次進行超濾脫鹽并濃縮；其中，魚皮混合液的濃度為2.0~8.0wt%, pH為2~6，所述復合蛋白酶的添加量為魚皮混合液重量的2.0~
8.0wt%o
[0006]作為優(yōu)選，步驟I)的酶解溫度為4~16°C，時間為6~10h，反應(yīng)時體系的pH控制在5.0~9.0。
[0007]作為優(yōu)選，步驟I)中還加入抑制劑。
[0008]作為優(yōu)選，步驟2)中離心轉(zhuǎn)速為4000~5000r/min。
[0009]作為優(yōu)選，步驟3)超濾濃縮的操作壓力為0.15-0.35MPa，溫度4_10°C，pH 2_6，超濾膜孔徑為10-50nm。
[0010]作為優(yōu)選，步驟3)中鹽析處理時，膠原蛋白溶液濃度為2.5-5.5%，NaCl濃度為10-30%, pH 值為 2-6，溫度為 4-10°C。
[0011]作為優(yōu)選，步驟4)超濾濃縮的操作條件如下:操作壓力0.5_1.0Mpa，溫度為4-10°C，pH2-6，超濾膜孔徑為 100-200nm。
[0012]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明利用單因素試驗和正交試驗對復合蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化，建立了 pH、酶解溫度、酶解時間、酶與底物的比例、底物濃度與酶水解度的關(guān)系，得到復合蛋白酶的最佳水解條件為:胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例為1-3:1，復合蛋白酶的用量為魚皮混合液質(zhì)量的2.0-8.0wt%,底物濃度2.0-8.0wt%, pH5.0-9.0，在4_16°C條件下酶解6_10h，其最高膠原蛋白提取率達到91.2%。

【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0014]一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，將2.0~8.0%的魚皮混合液中，調(diào)節(jié)PH到2~6進行預處理，然后加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的復合蛋白酶，加入量與魚皮含量相同，并控制溫度在10~12°C，酶解8h，在此過程中控制pH在5~9之間。然后將酶解后的上清液進行離心處理，轉(zhuǎn)速在4500r/min左右。
[0015]將離心后的溶液進行第一次超濾濃縮，操作壓力為0.15-0.35MPa，溫度4_10°C，pH 2-6，超濾膜孔徑為10-50nm ;然后進行鹽析:膠原蛋白溶液濃度為2.5-5.5%，NaCl濃度為10-30%，pH值為2-6，溫度為4-10°C ;最后進行第二次超濾:操作壓力0.5-1.0Mpa，溫度為 4-10°C，pH2-6，超濾膜孔徑為 100-200nm。
[0016]本發(fā)明利用單因素試驗和正交試驗對復合蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化，建立了pH、酶解溫度、酶解時間、酶與底物的比例、底物濃度與酶水解度的關(guān)系，得到復合蛋白酶的最佳水解條件為:胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例為1-3:1，復合蛋白酶的用量為魚皮混合液質(zhì)量的2.0-8.0wt%，底物濃度2.0-8.0wt%,pH5.0-9.0，在4_16°C條件下酶解6_10h，其最高膠原蛋白提取率達到91.2%。
[0017]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明又系統(tǒng)優(yōu)化和篩選了超濾濃縮、鹽析、透析脫鹽、超濾去除小分子等工藝條件，與前面的復合蛋白酶的水解條件相配套，建立了一套完整的復合蛋白酶提取活性膠原蛋白的方法。
[0018]本發(fā)明方法安全性高，無副作用，所制備得到的活性膠原蛋白具有提取率、純度和熱變性溫度等優(yōu)點。
【權(quán)利要求】
1.一種利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟: 1)經(jīng)過預處理的魚皮混合液加入復合蛋白酶進行酶解；其中所述復合蛋白酶至少包含木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中兩種； 2)將得到的酶解液進行離心處理，取上清液； 3)將上清液超濾濃縮后進行鹽析； 4)再次進行超濾脫鹽并濃縮； 其中，魚皮混合液的濃度為2.0~8.0wt%,pH為2~6，所述復合蛋白酶的添加量為魚皮混合液重量的2.0~8.0wt%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟O的酶解溫度為4~16°C，時間為6~10h，反應(yīng)時體系的pH控制在5.0~9.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟1)中還加入抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟2)中離心轉(zhuǎn)速為4000~5000r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟3)超濾濃縮的操作壓力為0.15-0.35MPa，溫度4_10°C，pH 2-6，超濾膜孔徑為10_50nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟3)中鹽析處理時，膠原蛋白溶液濃度為2.5-5.5%,NaCl濃度為10_30%，pH值為2_6，溫度為4-10 °C。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用復合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟4)超濾濃縮的操作條件如下:操作壓力0.5-1.0Mpa，溫度為4_10°C，pH2_6，超濾膜孔徑為100_200nmo
【文檔編號】C12P21/06GK104073537SQ201310096815
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月25日
【發(fā)明者】程張軍, 郁帥陸, 黃榮醒, 陳美娟 申請人:林琳