用于鑒定人類腺病毒55型的引物對、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定人類腺病毒55型的引物對、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒,包括序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成的特異引物對。所述試劑盒還包括特異探針;所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示,或所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互補序列所示。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)檢測技術(shù)樣本消耗量大、實驗操作繁瑣、檢測靈敏度低、特異性不強等缺點,應(yīng)用特異性高,檢測敏感性可達0.008PFU/反應(yīng)體系,且適用于高通量篩選。本發(fā)明尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學監(jiān)測等工作。
【專利說明】用于鑒定人類腺病毒55型的引物對、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于鑒定人類腺病毒55型的引物對、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人腺病毒(Human Adenovirus, HAdV)是一群無包膜的雙鏈DNA病毒,分為I~55個血清型,分別劃入A~F共6個血清學分組。人腺病毒經(jīng)呼吸道和消化道傳播,引起多種感染,對小兒和免疫缺陷者危害嚴重。腺病毒感染人體可能引發(fā)的疾病包括:急性腺病毒肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎、乳糜瀉和急性間質(zhì)性腎炎等。在兒童急性下呼吸道感染患者中腺病毒感染陽性率可高達4.1%。在最近幾十年的北美、歐洲及亞洲均認為人類腺病毒B組感染是導致急性呼吸系統(tǒng)感染(ARD)的重要因素。
[0003]HAdVlUHAdVH型屬于腺病毒B組,傳統(tǒng)的HAdVll型主要導致腎及泌尿系統(tǒng)的感染,HAdV14則引起人呼吸系統(tǒng)感染。新發(fā)現(xiàn)的人類腺病毒55型(HAdV55),在其現(xiàn)之初命名為HAdVlla,對人有較強的致病性,易在軍隊、學校等密集人群發(fā)生呼吸道傳染病流行,在免疫低下的人群中甚至出現(xiàn)了死亡病例?;蚍治霰砻鱄AdV55是HAdV14與HAdVll的Hexon區(qū)域重組并發(fā)生若干核苷酸突變得到的毒株。
[0004]實時定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種PCR技術(shù),它是在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上添加了熒光染料或具有熒光標記的探針,將熒光信號強弱與PCR擴增情況結(jié)合在一起,通過監(jiān)測PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR反應(yīng)進行的情況。實時PCR技術(shù),解決了傳統(tǒng)PCR難以對擴增起始模板進行定量的難題,避免了傳統(tǒng)檢測技術(shù)樣本消耗量大、實驗操作繁瑣、檢測靈敏度低等缺點,并具有快速、避免交叉污染等特點。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定人類腺病毒55型的引物對、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的第一種輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒,包括序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成的特異引物對。
[0007]本發(fā)明提供的第二種輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒,包括與序列表的序列I所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子和與序列表的序列2所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子組成的特異引物對。
[0008]以上任一所述試劑盒還包括特異探針;所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示,或所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互補序列所示。
[0009]所述特異探針可為TaqMan探針。所述特異探針具體可為在序列表的序列3所示單鏈DNA的5’末端連接熒光基團,3’末端連接淬滅基團得到的探針。所述特異探針具體可為在與序列表的序列3所示單鏈DNA反向互補的單鏈DNA的5’末端連接熒光基團,3’末端連接淬滅基團得到的探針。所述熒光基團具體可為FAM熒光基團,所述猝滅基團具體可為TAMRA熒光猝滅劑。其它熒光基團及猝滅基團也可采用。在探針完整時,熒光基團和淬滅基團在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近,探針5’末端的熒光報告基團產(chǎn)生的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3’端的淬滅基團淬滅,因此檢測不到熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中,引物和探針與模板特異性結(jié)合JaqDNA聚合酶基于模板在引物3’末端合成互補DNA序列;隨著引物的延伸,TaqDNA聚合酶利用其5’ ->3’外切酶活性對互補結(jié)合在模板上的探針進行切割,從而釋放出熒光報告基團,其與探針3’末端淬滅基團的FRET被破壞,報告基團所釋放熒光無法被淬滅基團屏蔽,從而可被檢測到。由于每一條新合成DNA鏈對應(yīng)一條探針及其熒光報告基團的釋放,因此應(yīng)光亮的增加與PCR產(chǎn)物的積累是呈比例關(guān)系的。利用陽性梯度模板如梯度稀釋的病毒DNA或含有病毒特異核酸的質(zhì)粒等循環(huán)閾值(Ct,Threshold Cycler,超過閾值的PCR循環(huán)數(shù))對應(yīng)模板拷貝數(shù)或病毒滴定度制成標準曲線,根據(jù)待測HAdV55型病毒樣品的Ct值即可通過與標準品的Ct值測出樣品的起始拷貝數(shù)或病毒滴度。
[0010]本發(fā)明還保護序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成的特異引物對。
[0011]本發(fā)明還保護與序列表的序列I所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子和與序列表的序列2所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子組成的特異引物對。
[0012]本發(fā)明還保護序列表的序列3所示的單鏈DNA分子或與序列表的序列3所示的單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子。
[0013]本發(fā)明還保護以上任一所述所述特異引物對和/或以上任一所述單鏈DNA分子在制備輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還保護以上任一所述所述特異引物對和/或以上任一所述單鏈DNA分子在輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型中的應(yīng)用。
[0015]用本發(fā)明提供的試劑盒檢測待測樣本中是否含有人類腺病毒55型的方法如下:提取待測樣本的基因組DNA,以所述基因組DNA為模板,采用所述特異引物對和所述特異探針進行實時PCR擴增,如果在40個循環(huán)內(nèi)可檢測到熒光信號并得到特異的S型擴增曲線,結(jié)果為陽性(即待測樣品中存在人類腺病毒55型),如果未檢測到特異熒光信號,結(jié)果為陰性(即待測樣本中不含人類腺病毒55型)。
[0016]應(yīng)用本發(fā)明的試劑具有如下優(yōu)點:反應(yīng)過程無須開蓋,反應(yīng)結(jié)束無須電泳,檢測快速,并極大減少了 PCR產(chǎn)物污染所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)檢測技術(shù)樣本消耗量大、實驗操作繁瑣、檢測靈敏度低、特異性不強等缺點,本發(fā)明的應(yīng)用特異性高,檢測敏感性可達0.008PFU/反應(yīng)體系,且適用于高通量篩選。本發(fā)明尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學監(jiān)測等工作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明探針和引物對對于人類腺病毒55型DNA的靈敏度檢測。
[0018]圖2為本發(fā)明探針和引物對對于人類腺病毒55型的定量標準曲線。
[0019] 圖3為本發(fā)明探針和引物對于檢測不同型別腺病毒DNA的特異性。
【具體實施方式】
[0020]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設(shè)置三次重復實驗,結(jié)果取平均值。
[0021]引物和探針由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。實時PCR試劑盒(Premix ExTaq?):大連寶生物(TAKARA)公司,CodeNo:DRR039A。核酸定量儀:美國NanoDrop公司。熒光定量PCR儀(LightCycle? System2.0):德國羅氏(Roche)公司。DNA 提取試劑盒(DNeasy?Blood & Tissue Kit):QIAgen 公司產(chǎn)品,CodeNo:69504。
[0022]人類腺病毒3 型(Human adenovirus3):ATCC, ATCC 編號為 VR-3。
[0023]人類腺病毒5 型(Human adenovirus5):ATCC, ATCC 編號為 VR-5。
[0024]人類腺病毒7 型(Human adenovirus7):ATCC, ATCC 編號為 VR-7。
[0025]人類腺病毒11 型(Human adenovirusll):ATCC, ATCC 編號為 VR-12。
[0026]人類腺病毒14 (Human adenovirusl4):ATCC, ATCC 編號為 VR-15。
[0027]人類腺病毒55型(HAdV55病毒液):參考文獻:利用計算機分析鑒定人類腺病毒55型:一種再次出現(xiàn)的呼吸道傳染病病原體(Cmputat1nal Analysis Identifies HumanAdenovirus Type55as a Re-Emergent Acute Respiratory Disease Pathogen)J ClinMicrob1l.2010,48(3):991-993.。
[0028]實施例1、引物對和探針的制備
[0029]根據(jù)GeneBank公布的人類腺病毒55型基因組序列(GenBank序列號:FJ643676)設(shè)計引物和探針如下:
[0030]HAdV55Hx-F (上游引物,序列 I):5’ -GTACGGCTTACAACTCTC-3’ ;
[0031]HAdV55Hx-R (下游引物,序列 2):5’ -TTGGGAGTCCTTCTTTTG-3’ ;
[0032]HAdV55Hx-Probe (探針,序列 3):5’ -FAM-AAATGGTGAGGAGCGCGTAACA-TAMRA-3,。
[0033]實施例2、引物對和探針的組合物的靈敏度
[0034]一、病毒樣本的制備
[0035]使用1640培養(yǎng)基將人類腺病毒55型的病毒液進行梯度稀釋,得到10種不同濃度的 HAdV55 病毒液(HAdV55 病毒濃度分別為 400000PFU/ml、40000PFU/ml、4000PFU/ml、400PFU/ml、40PFU/ml、4PFU/ml、0.4PFU/ml、0.04PFU/ml、0.004PFU/ml 和 0.0004PFU/ml)。
[0036]樣本1:濃度為400000PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0037]樣本2:濃度為40000PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0038]樣本3:濃度為4000PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0039]樣本4:濃度為400PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0040]樣本5:濃度為40PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0041]樣本6:濃度為4PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0042]樣本7:濃度為0.4PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0043]樣本8:濃度為0.04PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0044]樣本9:濃度為0.004PFU/ml的HAdV55病毒液。
[0045]樣本10:濃度為 0.0004PFU/ml 的 HAdV55 病毒液。
[0046]樣本11:1640培養(yǎng)基。
[0047]二、提取基因組DNA
[0048]采用DNA提取試劑盒并按試劑盒說明書提取100微升待測樣本液(分別將步驟一制備的樣本I至樣本11作為待測樣本液)的基因組DNA,具體方法如下:
[0049]在1.5ml的EP管中加入20 μ I的QIAGEN protease(試劑盒組分),然后加入100 μ I待測樣本液,然后加入200 μ I的Buffer AL (試劑盒組分),振蕩器混勻15秒,56°C放置10分鐘;加入200 μ I無水乙醇,振蕩器混勻15秒后將液體轉(zhuǎn)至濾柱中,8000rpm離心I分鐘;將濾柱轉(zhuǎn)至新的收集管中,加入500 μ I的AWlBuffer (試劑盒組分),8000rpm離心I分鐘;將濾柱轉(zhuǎn)至新的收集管中,加入500 μ I的AW2Buffer(試劑盒組分),HOOOrpm離心3分鐘后棄濾出液,再次離心2分鐘;將濾柱轉(zhuǎn)至新的EP管中,加入100 μ I的無菌水,室溫放置3分鐘,8000rpm離心2分鐘,收集的洗脫液(約100 μ I)即為含有病毒基因組DNA的溶液,-20°C保存。
[0050]三、實時PCR
[0051]取步驟I得到的基因組DNA,采用實時PCR試劑盒進行實時PCR。
[0052]反應(yīng)體系(20 μ I)見表1。
[0053]表1反應(yīng)體系
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒,包括序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成的特異引物對。
2.一種輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒,包括與序列表的序列I所不單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子和與序列表的序列2所不單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子組成的特異引物對。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包括特異探針;所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示,或所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互補序列所示。
4.序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成的特異引物對。
5.與序列表的序列I所不單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子和與序列表的序列2所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子組成的特異引物對。
6.序列表的序列3所示的單鏈DNA分子或與序列表的序列3所示的單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子。
7.權(quán)利要求4所述特異引物對和/或權(quán)利要求6所述單鏈DNA分子在制備輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5所述特異引物對和/或權(quán)利要求6所述單鏈DNA分子在制備輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型的試劑盒中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4所述特異引物對和/或權(quán)利要求6所述單鏈DNA分子在輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5所述特異引物對和/或權(quán)利要求6所述單鏈DNA分子在輔助鑒定和/或定量檢測人類腺病毒55型中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104073570SQ201310098836
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月26日
【發(fā)明者】秦成峰, 姜濤, 劉娟, 鄧永強, 朱舜亞, 秦鄂德 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所