專利名稱：一株伯克霍爾德氏菌及利用該菌發(fā)酵合成pha的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株聚輕基脂肪酸酯合成菌伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-Ol及利用該菌通過(guò)兩步發(fā)酵法合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(PHA)是某些原核微生物在失去營(yíng)養(yǎng)平衡時(shí)，即氮源缺失、碳源豐富的情況下，在體內(nèi)合成并積累的貯存碳源和氮源的顆粒狀物質(zhì)；在環(huán)境條件恢復(fù)平衡的情況下，PHA又可被微生物分解利用，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，屬于生物可降解性材料。聚羥基脂肪酸酯(PHA)，是很多微生物體內(nèi)合成的一種細(xì)胞內(nèi)線性聚酯，是一種天然的高分子生物材料，PHA不僅具有良好的生物相容性、生物可降解性和可塑性，并被應(yīng)用到生物醫(yī)用材料和生物可降解包裝材料，更有著非線性光學(xué)性、壓電性、氣體隔離性等很多高附加值性能。PHA的生產(chǎn)是一種低能耗和低二氧化碳排放的生產(chǎn)，不僅對(duì)于環(huán)境保護(hù)、促進(jìn)工業(yè)與環(huán)境和諧發(fā)展有著重要意義，而且使PHA的工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)提供了可能性，有著十分重要的應(yīng)用意義。然而，目前制約PHA規(guī)?；瘧?yīng)用的主要原因是制備成本高，其經(jīng)濟(jì)性無(wú)法與石油基材料抗衡。因此，必須設(shè)法得到高產(chǎn)菌株，降低PHA生產(chǎn)成本，提高PHA規(guī)模化應(yīng)用的可能性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一株新發(fā)現(xiàn)的聚羥基脂肪酸酯合成菌伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG_01o本發(fā)明的聚輕基脂肪酸酯合成菌伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG_01分離自天津市南開(kāi)大學(xué)生物樓前的丁香樹(shù)根系土壤。該菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。LB培養(yǎng)基的組成為蒸餾水1000ml，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaC15g，pH7.0-7.2。菌落呈圓形半透明，表面突起，質(zhì)地光滑，邊緣整齊。其16S rDNA基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為1424bp。使用BLAST對(duì)伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.) CG-01的16S rDNA基因和GenBank中已登錄細(xì)菌進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該株菌與已報(bào)道的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)的16S rDNA基因序列相似性最高。于是，命名該菌為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-O10該菌已于2013年3月19日保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.7329。伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.) CG-OI, CGMCC N0.7329的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開(kāi)利用上述們克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-OI, CGMCCN0.7329菌株以單一碳源——葡萄糖大量合成聚羥基脂肪酸酯的方法。本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:將菌種接種到5ml種子培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm ;培養(yǎng)11-13小時(shí)后，按照5%的接種量接種到200ml發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm ;培養(yǎng)24小時(shí)后，菌液離心，磷酸緩沖溶液洗滌，再離心，離心后的菌體全部轉(zhuǎn)入200ml PHA發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速120_180rpm，30°C下?lián)u瓶發(fā)酵36-72小時(shí)；離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥；將干燥菌體轉(zhuǎn)入IOOml三角瓶中，按25ml/g的量加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時(shí)，過(guò)濾去除菌體殘?jiān)瑢V液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入濃縮后剩余物40倍體積的冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物過(guò)夜，收集沉淀，真空干燥，保存，稱重。該菌株伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCC N0.7329能以單一碳源——葡萄糖大量合成聚羥基脂肪酸酯PHB，即聚3-羥基丁酸酯。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的突出優(yōu)點(diǎn):以該菌合成聚羥基脂肪酸酯PHA尚屬首次報(bào)道；野生的伯克霍爾德氏菌CG-Ol，CGMCC N0.7329能以葡萄糖為碳源合成PHB，在未經(jīng)優(yōu)化的條件下，PHB含量占菌體干重達(dá)37.55% ;由于該菌株能在超過(guò)100余種碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這為今后進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高收率，降低PHA生產(chǎn)成本留有很大的發(fā)展空間。


圖1是伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01, CGMCC N0.7329的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施方案在下面的實(shí)施例中，所用菌種均為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01,CGMCC N0.7329。實(shí)施例中所用的不同培養(yǎng)基配方如下:(I)分離培養(yǎng)基蒸懼水1000ml,牛肉膏IOg,蛋白胨10g, NaC15g,葡萄糖20g,瓊脂粉15g_20g,pH7.0-7.2和0.2ml尼爾紅溶液；該尼爾紅溶液是用25mg尼爾紅染料加入IOOml 二甲亞砜配制而成的。⑵種子培養(yǎng)基蒸餾水1000ml，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸出粉5g，(NH4)2S045g，調(diào)節(jié)ρΗ7.2。(3)發(fā)酵合成培養(yǎng)基蒸餾水1000ml，Na2HP043.8g，ΚΗ2Ρ042.65g，MgSO40.2g 或 MgS047H200.41 lg，NH4Cl0.36g，葡萄糖10-20g,微量元素Iml ;微量元素成分為:0.lmol/L HCl 1000ml,CoCl2.6Η200.218g, CaCl27.8g, CrCl36H200.105g, NiCl26H200.118g, CuS045H200.156g,FeCl39.7g ;濾菌膜過(guò)濾除菌，調(diào)pH至7.0。實(shí)施規(guī)！篩選分離伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于天津市南開(kāi)大學(xué)生物樓旁丁香樹(shù)根系土壤。具體實(shí)施步驟如下:稱取Ig土樣，加入99ml無(wú)菌生理鹽水(10_2)，攪拌20分鐘，使其充分混勻，靜置片刻，取上清液，用生理鹽水以10倍梯度稀釋，分別稀釋為10_3-10_5并將其涂布于固體篩選分離培養(yǎng)基平板上，30°c培養(yǎng)48小時(shí)，312nm紫外光照下觀察，標(biāo)記橘紅色突光的菌落，挑取該菌落，于固體篩選分離培養(yǎng)基平板上劃線以純化，30°C培養(yǎng)24小時(shí)，挑取橘紅色菌落保存于甘油管中。經(jīng)16S rDNA基因序列分析以及B10L0G鑒定，確定該菌為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)屬，并且命名為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)CG-01。該菌已保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.7329。實(shí)施例2伯克霍爾德氐菌(Burkholderia sp.)CG-01，CGMCC N0.7329發(fā)酵合成PHA具體步驟如下:將菌種接種到5ml種子培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)11小時(shí)后，按照5%的接種量接種到200ml發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)24小時(shí)后，菌液離心，磷酸緩沖溶液洗滌，再離心，離心后的菌體全部轉(zhuǎn)入200ml PHA發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中，葡萄糖濃度為10g/L，轉(zhuǎn)速180rpm，30°C下?lián)u瓶發(fā)酵36小時(shí)；離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥；將干燥菌體轉(zhuǎn)入IOOml三角瓶中，按25ml/g的量加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時(shí)，過(guò)濾去除菌體殘?jiān)瑢V液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物過(guò)夜，收集沉淀，真空干燥，保存，稱重，計(jì)算產(chǎn)率為27.93%。實(shí)施例3伯克霍爾德氐菌(Burkholderia sp.)CG-01, CGMCC N0.7329發(fā)酵合成PHA具體步驟如下:將菌種接種到5ml種子培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)12小時(shí)后，按照5%的接種量接種到200ml發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)24小時(shí)后，菌液離心，磷酸緩沖溶液洗滌，再離心，離心后的菌體全部轉(zhuǎn)入200ml PHA發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中葡萄糖濃度為15g/L，轉(zhuǎn)速150rpm，30°C下?lián)u瓶發(fā)酵48小時(shí)；離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥；將干燥菌體轉(zhuǎn)入IOOml三角瓶中，按25ml/g的量加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時(shí)，過(guò)濾去除菌體殘?jiān)瑢V液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物過(guò)夜，收集沉淀，真空干燥，保存，稱重，計(jì)算產(chǎn)率為37.55%。實(shí)施避U伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.) CG-01，CGMCC N0.7329發(fā)酵合成PHA具體步驟如下:將菌種接種到5ml種子培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)13小時(shí)后，按照5%的接種量接種到200ml發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)24小時(shí)后，菌液離心，磷酸緩沖溶液洗滌，再離心，離心后的菌體全部轉(zhuǎn)入200mlPHA發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中葡萄糖濃度為20g/L，轉(zhuǎn)速120rpm，30°C下?lián)u瓶發(fā)酵72小時(shí)；離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥；將干燥菌體轉(zhuǎn)入IOOml三角瓶中，按25ml/g的量加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時(shí)，過(guò)濾去除菌體殘?jiān)?，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入40倍體積冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物過(guò)夜，收集沉淀，真空干燥，保存，稱重，計(jì)算產(chǎn)率為22.58%。實(shí)施例5產(chǎn)物PHA的結(jié)構(gòu)單體分析稱取IOmg產(chǎn)物PHA于水解罐中，加入2ml氯仿，混合溶解后，加入1.7ml甲醇和
0.3ml濃硫酸，置于100°C烘箱中水解140min使PHA水解為單體并甲酯化。水解液冷卻后轉(zhuǎn)入試管中，加入4ml蒸餾水，充分混勻，靜置一段時(shí)間，取下層有機(jī)相保存于EP管中。氣-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)水解樣品 ，以確定單體種類。對(duì)于實(shí)施例2-4的PHA產(chǎn)物檢測(cè)，經(jīng)確認(rèn)，均為PHB，即聚3-羥基丁酸酯。
權(quán)利要求
1.一株聚羥基脂肪酸酯合成菌伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.) CG-Ol，CGMCCN0.7329。
2.利用伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)CG_01，CGMCC N0.7329發(fā)酵合成聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征在于包括如下步驟:將菌種接種到5ml種子培養(yǎng)基，30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm ;培養(yǎng)11-13小時(shí)后，按照5%的接種量接種到200ml發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm;培養(yǎng)24小時(shí)后，菌液離心，磷酸緩沖溶液洗滌，再離心,離心后的菌體全部轉(zhuǎn)入200ml PHA發(fā)酵合成培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速120_180rpm, 30°C下?lián)u瓶發(fā)酵36-72小時(shí)；離心發(fā)酵液，棄上清，收集菌體冷凍干燥；將干燥菌體轉(zhuǎn)入IOOml三角瓶中，按25ml/g的量加入氯仿充分?jǐn)嚢?8小時(shí)，過(guò)濾去除菌體殘?jiān)瑢V液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，力口入濃縮后剩余物40倍體積的冷甲醇沉淀PHA產(chǎn)物過(guò)夜，收集沉淀，真空干燥，保存，稱重。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用伯克霍爾德氏菌Burkholderiasp.CG-Ol，CGMCCN0.7329發(fā)酵合成聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征在于所用的培養(yǎng)基配方如下: (1)種子培養(yǎng)基 蒸餾水1000ml，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸出粉5g，(NH4) 2S045g,調(diào)節(jié)ρΗ7.2 ； (2)發(fā)酵合成培養(yǎng)基蒸餾水 1000ml，Na2HP043.8g，KH2P042.65g, MgSO40.2g 或 MgS047H200.41 lg, NH4Cl0.36g,葡萄糖 10-20g，微量元素 Iml ;微量元素成分為:0.lmol/L HCl 1000ml，CoCl2.6Η200.218g，CaCl27.8g, CrCl3.6H200.105g, NiCl2.6H200.118g, CuSO4.5H200.156g, FeCl39.7g ;濾菌膜過(guò)濾除菌，調(diào)p H至7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株伯克霍爾德氏菌Burkholderia sp.CG-01，CGMCC No.7329及利用該菌發(fā)酵合成聚羥基脂肪酸酯的方法。該野生菌能以葡萄糖為碳源合成PHB，在未經(jīng)優(yōu)化的條件下，PHB含量占菌體干重達(dá)37.55％；由于該菌株能在超過(guò)100余種碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這為今后進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高收率，降低PHA生產(chǎn)成本留有很大的發(fā)展空間。
文檔編號(hào)C12P7/62GK103232955SQ201310100700
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者宋存江, 崔迪, 關(guān)晗曄, 王淑芳, 王科, 谷燕燕, 李奕臻, 馮俊, 范旭, 張?chǎng)瓮?申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)