專利名稱：一種hek-293t細(xì)胞的懸浮馴化和無血清馴化方法
—種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化和無血清馴化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，具體地涉及一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化和無血清馴化的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥企業(yè)下游通用技術(shù)之一，其在該行業(yè)發(fā)揮極為重要的作用。該項技術(shù)的關(guān)鍵在于實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞的懸浮，無血清培養(yǎng)，從而提高產(chǎn)能，降低成本。因為小規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)時的通常做法是在培養(yǎng)基中添加血清，而血清化學(xué)成分不確定，且質(zhì)量不穩(wěn)定，有批間差，用此種細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品，質(zhì)量難以控制，很難通過食品藥品監(jiān)督管理局的審批，而且懸浮培養(yǎng)相對常見的貼壁培養(yǎng)來說，單位體積能長更多的細(xì)胞，從而能生產(chǎn)更多的生物制品。HEK-293T的中文名為人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞系(human embryonickidney293cell),細(xì)胞系作為高轉(zhuǎn)染和高表達的細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于科研和工業(yè)領(lǐng)域?，F(xiàn)有的HEK-293T的培養(yǎng)是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)中添加5_10%牛血清(FBS)，進行貼壁培養(yǎng)。其缺陷在于:1.血清質(zhì)量不穩(wěn)定，有批間差，且血清的化學(xué)成分不確定，如果用此種細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品，質(zhì)量難以控制，很難通過食品藥品監(jiān)督管理局的審批；2.由于其貼壁的性質(zhì)，相對懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞來說，單位體積能生長的細(xì)胞數(shù)目少，所以難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。而使貼壁細(xì)胞懸浮生長的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，在Gabriela D.C.等人的專利(HIGH YIELD SUSPENSION CELL LINE, system, and method for makesame;US20120171724Al)中，通過馴化，使多種哺乳動物細(xì)胞從貼壁狀態(tài)成為可懸浮生長于含血清的培養(yǎng)基中的細(xì)胞系，使得單位體積能長更多的`細(xì)胞，從而生產(chǎn)更多的生物制品但現(xiàn)有的懸浮馴化技術(shù)缺陷在于:1.有的無法實現(xiàn)完全無血清培養(yǎng)，2.—般采用兩步走的方法，先血清斷奶再懸浮培養(yǎng)。由于血清斷奶所采用的培養(yǎng)基通常為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清，基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分較弱，馴化過程中貼壁培養(yǎng)表面積/體積比通常較小，限制了營養(yǎng)的攝入，整個馴化過程耗時長。因此，需要對HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化和無血清馴化方法進一步研究，并克服以上兩方面缺陷。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化和無血清馴化方法，使該細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定、分散性好，適用規(guī)模化培養(yǎng)。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案:一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化方法，其特征在于包括以下步驟:a、接種HEK-293T細(xì)胞于含IOml DMEM完全培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天達到100%匯合狀態(tài)；
b、棄除培養(yǎng)基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T細(xì)胞消化脫離培養(yǎng)皿表面，然后加入3ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；C、將上述消化后的細(xì)胞用移液管吸取，并轉(zhuǎn)移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心lmin，沉降收集HEK-293T細(xì)胞，并用IOmlDMEM完全培養(yǎng)基重懸收集的細(xì)胞，再將全部細(xì)胞接種于IOcm康寧培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中；d、步驟c中放入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞每培養(yǎng)2天重復(fù)步驟b和C，重復(fù)7-9次，直至培養(yǎng)皿中同時出現(xiàn)貼壁細(xì)胞和懸浮生長的細(xì)胞團；吸取及轉(zhuǎn)移過程中注意勿打散細(xì)胞團；e、將最后一次培養(yǎng)的全部細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至搖瓶中培養(yǎng)，每兩天按照0.3 X IO6/ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細(xì)胞團至分散狀態(tài)，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2X107 ml細(xì)胞，活力95%以上，即得可連續(xù)傳代95-105代，并可達到最高密度1.1 X 107/ml的，適應(yīng)10%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞，命名該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為HEK-293TS細(xì)胞，以3X 106/ml密度凍存即可。如上所述的步驟a-e中的百分比濃度均為體積濃度。一種上述方法馴化后的HEK-293TS懸浮細(xì)胞的無血清馴化方法，其特征在于包括以下步驟:a、用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至密度為1.2X107ml，活力95%以上，收集細(xì)胞于離心管中，于IOOOrpm離心2min沉降，留沉淀；b、用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的細(xì)胞團，并在此過程中震蕩離心管，使細(xì)胞均勻分布；C、加入5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化作用，并重懸步驟b得到的HEK-293TS 細(xì)胞，按照 0.3X 106/ml 傳代；d、每兩天重復(fù)a-c步驟一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；e、分步將DMEM培養(yǎng)基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%,重復(fù)步驟a_c，每兩天傳代一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上，即得適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293TS細(xì)胞；f、將適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293Ts細(xì)胞每兩天按照0.3 X IO6/ml傳代一次，擴大培養(yǎng)到50ml培養(yǎng)體積，至兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；g、對適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293Ts細(xì)胞進行70 u m細(xì)胞篩過濾處理，觀察并記錄過濾后的HEK-293TS細(xì)胞團數(shù)量及大??；h、傳代g步驟中過濾后的HEK-293TS細(xì)胞于含25%293FFreestyle SFM及75%DMEM的混合培養(yǎng)基中，該DMEM中含1.0%FBS,每兩天傳代一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力90%以上；1、按照50%、75%和100%的比例增加混合培養(yǎng)基中293FFreestyle SFM的比率，增加293F Freestyle SFM比率的同時按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養(yǎng)基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養(yǎng)基依次傳代培養(yǎng)步驟h所得的HEK-293TS細(xì)胞，直至所述的HEK-293TS細(xì)胞于含100%293F Freestyle SFM且無FBS存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞密度，活力90%以上，且細(xì)胞無結(jié)團現(xiàn)象；
j、以3X 106/ml密度凍存i步驟得到的適應(yīng)100%293F Freestyle SFM懸浮培養(yǎng)生長條件的HEK-293TS于_80°C醫(yī)用低溫冰箱中，次日轉(zhuǎn)移凍存管至液氮罐中保存。如上所述的步驟a-j中的百分比濃度均為體積濃度。本發(fā)明中的HEK-293T細(xì)胞具有鑒定為美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)編號為CRL-11268的細(xì)胞系的特征，市售可得。本發(fā)明中的HEK-293TS細(xì)胞為適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞。 本發(fā)明中的DMEM完全培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基成品。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點:本發(fā)明培養(yǎng)出的HEK-293T細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，分散性好，完全適應(yīng)在無血清且化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，能夠規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)描述:本發(fā)明提供了一種高效、高適應(yīng)性的HEK-293T細(xì)胞懸浮馴化和無血清馴化的新方法。本發(fā)明分兩步進行，先HEK-293T細(xì)胞由貼壁培養(yǎng)馴化為在帶血清的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，再對適應(yīng)含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞降血清馴化至無血清馴化。具體為:一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化方法，其包括以下步驟:a、接種HEK-2 93T細(xì)胞于含IOml DMEM完全培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天達到100%匯合狀態(tài)；b、棄除培養(yǎng)基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T細(xì)胞消化脫離培養(yǎng)皿表面，然后加入3ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；C、將上述消化后的細(xì)胞用移液管吸取，并轉(zhuǎn)移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心lmin，沉降收集HEK-293T細(xì)胞，并用IOmlDMEM完全培養(yǎng)基重懸收集的細(xì)胞，再將全部細(xì)胞接種于IOcm康寧培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中；d、步驟c中放入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞每培養(yǎng)2天重復(fù)步驟b和C，重復(fù)7-9次，直至培養(yǎng)皿中同時出現(xiàn)貼壁細(xì)胞和懸浮生長的細(xì)胞團；吸取及轉(zhuǎn)移過程中注意勿打散細(xì)胞團；e、將最后一次培養(yǎng)的全部細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至搖瓶中培養(yǎng)，每兩天按照0.3 X IO6/ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細(xì)胞團至分散狀態(tài)，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2X 107ml細(xì)胞，活力95%以上，即得可連續(xù)傳代95-105代，并可達到最高密度1.1 X 107/ml的，適應(yīng)10%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞，命名該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為HEK-293TS細(xì)胞，以3X 106/ml密度凍存即可。上述步驟a-e中的百分比濃度均為體積濃度。HEK-293TS細(xì)胞是能夠懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞。對上述馴化后的HEK-293TS懸浮細(xì)胞的無血清馴化方法，其包括以下步驟:a、用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至密度為1.2X 106/ml，活力95%以上，收集細(xì)胞于離心管中，于IOOOrpm離心2min沉降，留沉淀；b、用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的細(xì)胞團，并在此過程中震蕩離心管，使細(xì)胞均勻分布；
C、加入5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化作用，并重懸步驟b得到的HEK-293TS 細(xì)胞，按照 0.3X 106/ml 傳代；d、每兩天重復(fù)a-c步驟一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；e、分步將DMEM培養(yǎng)基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%,重復(fù)步驟a_c，每兩天傳代一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上，即得適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293TS細(xì)胞；f、將適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293Ts細(xì)胞每兩天按照0.3 X IO6/ml傳代一次，擴大培養(yǎng)到50ml培養(yǎng)體積，至兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；g、對適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293Ts細(xì)胞進行70 y m細(xì)胞篩過濾處理，觀察并記錄過濾后的HEK-293TS細(xì)胞團數(shù)量及大??；h、傳代g步驟中過濾后的HEK-293TS細(xì)胞于含25%293FFreestyle SFM及75%DMEM的混合培養(yǎng)基中，該DMEM中含1.0%FBS,每兩天傳代一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力90%以上；1、按照50%、75%和100%的比例增加混合培養(yǎng)基中293FFreestyle SFM的比率，增加293F Freestyle SFM比率的同時按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養(yǎng)基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養(yǎng)基依次傳代培養(yǎng)步驟h所得的HEK-293TS細(xì)胞，直至所述的HEK-293TS細(xì)胞于含100%293F Freestyle SFM且無FBS存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后能達到
1.2 XlOVml細(xì)胞密度，活力90%以上，且細(xì)胞無結(jié)團現(xiàn)象；j、以3X 10 6/ml密度凍存i步驟得到的適應(yīng)100%293F FreestyleSFM懸浮培養(yǎng)生長條件的HEK-293TS于_80°C醫(yī)用低溫冰箱中，次日轉(zhuǎn)移凍存管至液氮罐中保存。上述步驟a-j中的百分比濃度均為體積濃度。本發(fā)明從HEK-293T細(xì)胞適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)后繼續(xù)馴化時，擴大培養(yǎng)體積，以便于后續(xù)過細(xì)胞篩操作，過篩后，檢測HEK-293Ts細(xì)胞團數(shù)量及大小以去除成團細(xì)胞，得到分散性良好的細(xì)胞。本發(fā)明中，對降血清程序、最終生長培養(yǎng)基選擇及去除細(xì)胞團的過程進行了整體優(yōu)化，一個月時間左右馴化HEK-293T達到1.5%FBS血清濃度下正常傳代，一個月時間左右馴化HEK-293T適應(yīng)無血清無動物材料培養(yǎng)基，達到了在含血清培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)同樣或更佳的生長狀態(tài)。最終該細(xì)胞株生長狀態(tài)穩(wěn)定，分散性好，完全適應(yīng)在無血清且化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，可用于規(guī)?；a(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化方法，其特征在于包括以下步驟: a、接種HEK-293T細(xì)胞于含IOmlDMEM完全培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天達到100%匯合狀態(tài)； b、棄除培養(yǎng)基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T細(xì)胞消化脫離培養(yǎng)皿表面，然后加A 3ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化； C、將上述消化后的細(xì)胞用移液管吸取，并轉(zhuǎn)移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心Imin,沉降收集HEK-293T細(xì)胞，并用IOmlDMEM完全培養(yǎng)基重懸收集的細(xì)胞，再將全部細(xì)胞接種于IOcm康寧培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中； d、步驟c中放入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞每培養(yǎng)2天重復(fù)步驟b和C，重復(fù)7-9次，直至培養(yǎng)皿中同時出現(xiàn)貼壁細(xì)胞和懸浮生長的細(xì)胞團；吸取及轉(zhuǎn)移過程中注意勿打散細(xì)胞團； e、將最后一次培養(yǎng)的全部細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至搖瓶中培養(yǎng)，每兩天按照0.3X 107ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細(xì)胞團至分散狀態(tài)，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 X 106/ml細(xì)胞，活力95%以上，即得可連續(xù)傳代95-105代，并可達到最高密度1.1 X IO7/ml的，適應(yīng)10%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞，命名該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為HEK-293TS細(xì)胞，以3X 106/ml密度凍存即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化方法，其特征在于所述步驟a-e中的百分比濃度均為體積濃度。
3.—種權(quán)利要求1所述方法馴化后的HEK-293TS懸浮細(xì)胞的無血清馴化方法，其特征在于包括以下步驟: a、用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至密度為1.2X 106/ml，活力95%以上，收集細(xì)胞于離心管中，于IOOOrpm離心2min沉降，留沉淀； b、用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的細(xì)胞團，并在此過程中震蕩離心管，使細(xì)胞均勻分布； C、加入5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化作用，并重懸步驟b得到的HEK-293TS 細(xì)胞，按照 0.3X 106/ml 傳代； d、每兩天重復(fù)a-c步驟一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2XlOfVml細(xì)胞，活力95%以上; e、分步將DMEM培養(yǎng)基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%，重復(fù)步驟a_c，每兩天傳代一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上，即得適應(yīng)1.5%FBS DMffl培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293TS細(xì)胞； f、將適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293Ts細(xì)胞每兩天按照0.3X106/ml傳代一次，擴大培養(yǎng)到50ml培養(yǎng)體積，至兩天后能達到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上； g、對適應(yīng)1.5%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293Ts細(xì)胞進行70 y m細(xì)胞篩過濾處理，觀察并記錄過濾后的HEK-293TS細(xì)胞團數(shù)量及大??； h、傳代g步驟中過濾后的HEK-293Ts細(xì)胞于含25%293FFreestyleSFM及75%DMEM的混合培養(yǎng)基中，該DMEM中含1.0%FBS,每兩天傳代一次，直至培養(yǎng)兩天后能達到1.2 X IO6/ml細(xì)胞，活力90%以上； 。1、按照50%、75%和100%的比例增加混合培養(yǎng)基中293FFreestyleSFM的比率，增加293F Freestyle SFM比率的同時按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養(yǎng)基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養(yǎng)基依次傳代培養(yǎng)步驟h所得的HEK-293TS細(xì)胞，直至所述的HEK_293Ts細(xì)胞于含100%293F Freestyle SFM且無FBS存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后能達到1.2 X IO6/ml細(xì)胞密度，活力90%以上，且細(xì)胞無結(jié)團現(xiàn)象； j、以3X 107ml密度凍存i步驟得到的適應(yīng)100%293F FreestyleSFM懸浮培養(yǎng)生長條件的HEK-293TS細(xì)胞于_80°C醫(yī)用低溫冰箱中，次日轉(zhuǎn)移凍存管至液氮罐中保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種HEK-293TS懸浮細(xì)胞的無血清馴化方法，其特征在于所述步驟步驟a-j中的百分比濃度 均為體積濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HEK-293T細(xì)胞的懸浮馴化和無血清馴化的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明分兩步進行，先HEK-293T細(xì)胞由貼壁培養(yǎng)馴化為在帶血清的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，再對適應(yīng)含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞降血清馴化至無血清馴化。本發(fā)明培養(yǎng)出的HEK-293T細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，分散性好，完全適應(yīng)在無血清且化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，能夠規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C12N5/0783GK103205396SQ20131010152
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日 公開號201310101524.發(fā)明者王謙, 孫藝飛, 張鵬, 王忠民, 夏瑜, 李百勇 申請人:中山康方生物醫(yī)藥有限公司