專利名稱：一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌的lamp方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(HPS)是一種不運(yùn)動(dòng)性、小型、NAD依賴、多形態(tài)的革蘭氏陰性桿菌，是豬上呼吸道的一種常在菌。衛(wèi)生狀況良好和較為健康的豬群，當(dāng)遭遇應(yīng)激因素易暴發(fā)該菌引起的病，常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎，影響2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段，5周齡I周齡的豬發(fā)病率達(dá)40%，嚴(yán)重時(shí)死亡率達(dá)50%。目前國(guó)內(nèi)對(duì)副豬嗜血桿菌的診斷主要有傳統(tǒng)的病原分離、血清學(xué)以及基于PCR的檢測(cè)方法。病原學(xué)方法是對(duì)細(xì)菌的分離和鑒定，副豬嗜血桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，且菌株比較脆弱，從病科中分離率較低。副豬嗜血桿菌各血清型之間存在交叉反應(yīng)，血清學(xué)診斷結(jié)果不一致且不準(zhǔn)確。常規(guī)PCR檢測(cè)方法是選擇副豬嗜血桿菌的16S rRNA的基因序列在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，16S rRNA可以作為種屬的劃分依據(jù)但卻不能區(qū)分巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌，且在檢驗(yàn)中容易誤檢造成假陽(yáng)性。

本發(fā)明以副豬嗜血桿菌的infB基因作為檢測(cè)目標(biāo)，16SrRNA中的基因序列設(shè)計(jì)合成引物。infB是副豬嗜血桿菌的轉(zhuǎn)錄起始因子(Translation initiation factor 2)基因序列，在種屬間的變異率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，因而可以作為通用性基因來監(jiān)測(cè)副豬嗜血桿菌。血清學(xué)診斷存在特異性不高，敏感性低的特點(diǎn)，而傳統(tǒng)PCR檢測(cè)需要經(jīng)過變性一退火一延伸，加上DNA提取整個(gè)過程大概需要2 4小時(shí)才能得出結(jié)果。以往技術(shù)中所用到的LAMP方法檢測(cè)也需要I小時(shí)后加入染料才能判斷結(jié)果，反應(yīng)中加入的熒光染料syber-green,需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像,存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染，缺乏對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡(jiǎn)便、快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)副豬嗜血桿菌的方法，公開一種快速、實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，該檢測(cè)方法包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及LAMP檢測(cè)方法，以上所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法，反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng)在20-35min間出現(xiàn)擴(kuò)增，引物包括外引物和內(nèi)引物；
所述的外引物是F3和B3 ；
所述的內(nèi)引物是FIP和BIP ；
其中引物的序列分別為:
F3 CGAAAGCAACGGATATCGT B3 CACCACCGAATTTCTCAGAAFIP CTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACGBIP GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT。以上所述的細(xì)菌的前處理是將細(xì)菌直接加入PBS煮沸。以上所述的LAMP反應(yīng)體系建立中LAMP反應(yīng)體系以25 μ I計(jì):
2X反應(yīng)緩沖液12.5μ1
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LB20pmol
模板2 μ I
超純水補(bǔ)足25 μ I
以上所述的LAMP檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)濁度儀。以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)方式。

以上所述的LAMP檢測(cè)方法采用密閉全程監(jiān)控。以上所述的LAMP檢測(cè)方法中熒光可視化檢測(cè)采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖希瑹晒馊玖显诜磻?yīng)前加入。以上所述的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)樣品溶液采用煮沸的PBS稀釋細(xì)菌液體。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步是:
I)特異性強(qiáng)
所檢測(cè)的陰性對(duì)照株均無陽(yáng)性結(jié)果出來，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。2)靈敏度高
普通的PCR檢測(cè)方法的靈敏度為102cfu/ml數(shù)量級(jí)，而是用本發(fā)明檢測(cè)方法，檢測(cè)限約為5.2cfu/ml，是普通PCR的100倍左右。3)迅速出結(jié)果
普通的PCR整個(gè)過程在2 4小時(shí)左右才能得出結(jié)果，一般的LAMP方法也要在I小時(shí)左右得出結(jié)果，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法反應(yīng)在2(T35min間出現(xiàn)擴(kuò)增。4)不造成污染
以往的LAMP檢測(cè)中加入的突光染料syber-green,需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。本發(fā)明用于觀察的熒光染料為反應(yīng)前加入，加入染料為鈣黃綠素，檢測(cè)過程不需要開蓋。5)可實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)產(chǎn)物
本研究利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀來實(shí)時(shí)分析LAMP反應(yīng)的結(jié)果,不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值對(duì)時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時(shí)間的副豬嗜血桿菌拷貝數(shù)，達(dá)到定量檢測(cè)產(chǎn)物的目的。


圖1是本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)結(jié)果；4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，5株陰性對(duì)照菌反應(yīng)管無擴(kuò)增情況。圖2是本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的敏感性檢測(cè)結(jié)果；原始菌液濃度為5.2X IO6Cfu/ml, 10倍倍比稀釋菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，LAMP法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限為5.2cfu/mL.
圖3是本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法的熒光可視化檢測(cè)結(jié)果，加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果；左管為以副豬嗜血桿菌為模板的反應(yīng)情況，右管為陰性對(duì)照。圖4是本發(fā)明副豬嗜血桿菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值對(duì)時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時(shí)間的副豬嗜血桿菌拷貝數(shù)。
具體實(shí)施例方式1、材料的準(zhǔn)備
4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、布魯氏菌均為廣西獸醫(yī)研究所分離保存。LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京藍(lán)譜生物科技有限公司。2、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank中的副豬嗜血桿菌inf B基因序列，利用LAMP法引物輔助設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4軟件設(shè)計(jì)一套LAMP引物，其中F3/B3為外引物，F(xiàn)IP/BIP為內(nèi)引物；B4/B5為副豬嗜血桿菌LAMP檢測(cè)引物F3 CGAAAGCAACGGATATCGTB3 CACCACCGAATTTCTCAGAA
FIPCTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACG
BIP GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT
3、細(xì)菌的前處理
由于LAMP法具有敏感度高，其敏感性通常比PCR高出1(Γ1000倍，所以只需要對(duì)菌株從平板中刮取一小接種環(huán)于裝有500微升PBS的EP管進(jìn)行煮沸處理即可。4、LAMP反應(yīng)體系建立
按照試劑盒說明書，按25 μ I體系配置:
2X反應(yīng)緩沖液12.5μ1
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LB20pmol
模板2 μ I
超純水補(bǔ)足25 μ I
LAMP反應(yīng)在實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進(jìn)行密閉全程監(jiān)控的形式監(jiān)測(cè)本方法的檢出情況，濁度儀時(shí)間監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過獲得未知樣品達(dá)到0.1時(shí)的時(shí)間值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。反應(yīng)溫度以試劑盒推薦的63 °C做為反應(yīng)溫度。
5、LAMP檢測(cè)方法
I)特異性檢測(cè)
分別提取4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和布魯氏菌菌株7種菌株純培養(yǎng)后，分別刮取一小接種環(huán)于裝有500微升PBS的EP管進(jìn)行煮沸處理作為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)進(jìn)程進(jìn)行結(jié)果判定。2)敏感性檢測(cè)
將過夜培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌液10倍倍比稀釋至KT1 10_8 8個(gè)稀釋度菌液，取各稀釋度菌液100 μ I平板計(jì)數(shù)。取各稀釋度菌液1ml，用煮沸法提取DNA，取2μ I上清液作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)進(jìn)程進(jìn)行結(jié)果判定。3)熒光可視化檢測(cè)
根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應(yīng)前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63°C下反應(yīng)25分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。實(shí)施例1 LAMP檢測(cè)方法的特異性結(jié)果
對(duì)4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌、布魯氏菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，4型副豬嗜血桿菌和5型副豬嗜血桿菌反應(yīng)管在25分鐘左右出現(xiàn)濁度的上 升曲線，為陽(yáng)性結(jié)果，5株陰性對(duì)照菌反應(yīng)管曲線均無擴(kuò)增情況出現(xiàn)，LAMP呈陰性結(jié)果。實(shí)施例2 LAMP檢測(cè)方法的敏感性結(jié)果
細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)敏感性經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始菌液濃度為5.2 X 106cfu/ml。10倍倍比稀釋菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，從圖中看出，LAMP法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限為5.2cfu/ml,而PCR法細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限一般為102cfu/ml數(shù)量級(jí)。實(shí)施例3LAMP檢測(cè)方法的熒光可視化檢測(cè)結(jié)果
根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，63°C反應(yīng)30分鐘后，在紫外燈下觀察，圖3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，左管為以副豬嗜血桿菌為模板的反應(yīng)情況，右管為陰性對(duì)照，建立的方法方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設(shè)計(jì)的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63°C 30分鐘，即可快速觀察結(jié)果。且無需開蓋，避免了污染。實(shí)施例4副豬嗜血桿菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
設(shè)置對(duì)照:濃度為 5.2X105cfu/ml、5.2X 104cfu/ml、5.2X 10cfu/ml3、5.2XlO2Cfu/
ml、5.2 X IO1Cfu/ml、5.2 X 10°cfu/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，因?yàn)闈舛鹊膶?duì)數(shù)值與濁度值為
0.1的時(shí)間值成線性關(guān)系，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時(shí)間做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲
線方程，如圖4所示。從此次獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來看相關(guān)系數(shù)R2為0.9629，呈良好的線
性關(guān)系。以時(shí)間為X值，可求出Y值即濃度的次方數(shù)。如某試驗(yàn)樣品達(dá)到濁度值為0.1的時(shí)
間為30分鐘時(shí)，帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = -0.3288x + 11.383，求出Y等于1.519，
則濃度為101519，再乘以基數(shù)5.2，即為樣品的濃度，從而達(dá)到定量的效果。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:該檢測(cè)方法包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測(cè)方法，所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法，反應(yīng)溫度為63 °C、反應(yīng)在20-35min間出現(xiàn)擴(kuò)增，弓丨物包括外弓丨物和內(nèi)引物， 所述的外引物是F3和B3 ； 所述的內(nèi)引物是FIP和BIP ； 其中引物的序列分別為: F3 CGAAAGCAACGGATATCGT B3 CACCACCGAATTTCTCAGAAFIP CTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACGBIP GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的細(xì)菌的前處理是將細(xì)菌直接加入PBS煮沸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢 測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP反應(yīng)體系建立中LAMP反應(yīng)體系以25 μ I計(jì): 2X反應(yīng)緩沖液12.5μ1FIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmolLF20pmolLB20pmol模板2 μ I超純水補(bǔ)足25 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)方式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)濁度儀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法采用密閉全程監(jiān)控。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法中熒光可視化檢測(cè)采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖希瑹晒馊玖显诜磻?yīng)前加入。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特征是:所述的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)樣品溶液采用煮沸的PBS稀釋細(xì)菌液體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP方法，該檢測(cè)方法包括材料的準(zhǔn)備、LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、細(xì)菌的前處理、LAMP反應(yīng)體系建立以及采用LAMP檢測(cè)方法，LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法，其中引物包括外引物和內(nèi)引物。特異性檢測(cè)和敏感性檢測(cè)證實(shí)，本發(fā)明提供的LAMP檢測(cè)方法只需按建立的體系加樣即可實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)并且定量檢測(cè)出副豬嗜血桿菌的拷貝數(shù)，快速準(zhǔn)確的獲得檢測(cè)結(jié)果，為簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)副豬嗜血桿菌帶來便利。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103205494SQ20131010785
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者陳澤祥, 李軍, 彭昊, 楊威, 許力干, 謝宇舟, 禤雄標(biāo), 胡帥, 馬春霞, 謝永平, 潘艷 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所