專利名稱：一種ssap分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
牡丹suffruticosa Andr.)為茍藥科茍藥屬牡丹組的木本植物,是原產(chǎn)于中國(guó)的傳統(tǒng)名花。其品種豐富，花朵碩大，多姿多彩，雍容華貴。素有“國(guó)色天香”、“花中之王”之稱。每年4 5月開花，朵大色艷，奇麗無(wú)比，姿豐典雅，花香襲人，深受人們的喜愛。因此，提高牡丹的研究水平，促進(jìn)牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記一形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有:大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)連鎖；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒另U、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。逆轉(zhuǎn)座子在植物基因組中以高拷貝、高異質(zhì)性和廣泛存在等特點(diǎn)，在不少主要作物中已經(jīng)研究開發(fā)出基于逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記，并且得到廣泛應(yīng)用。兩端含有長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRs)的Tyl-copia類逆轉(zhuǎn)座子是高等植物中逆轉(zhuǎn)座子的主要類型,而SSAP是Waugh等1997年在大麥上開發(fā)的一種基于逆轉(zhuǎn)座子LTR序列的錨定AFLP技術(shù)(Waugh，1997)。與AFLP, RAPD等分子標(biāo)記相比，SSAP標(biāo)記多態(tài)性最高，并且利用SSAP方法分析得到的植物分類和進(jìn)化信息結(jié)果更接近于地理和形態(tài)上的分析結(jié)果。SSAP分子標(biāo)記技術(shù)目前已經(jīng)成功用于葡萄、大麥、蘋果等物種 的遺傳多樣性分析(Labra, 2004 ；Queen, 2004 ；Venturi, 2006),但至今尚無(wú)基于Tyl-copia類逆轉(zhuǎn)座子的SSAP分子標(biāo)記在牡丹上的應(yīng)用。SSAP分子標(biāo)記步驟繁多，不同物種之間的逆轉(zhuǎn)座子LTR序列異質(zhì)性很大。因此，解決基于牡丹LTRs引物的開發(fā)和具體PCR體系的優(yōu)化，成為SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上應(yīng)用的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，不僅可以使SSAP分子標(biāo)記技術(shù)直接用于牡丹種屬之間多態(tài)性的分析，而且更具有高效性和實(shí)用性。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是:一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，包括以下步驟:
步驟一、設(shè)計(jì)引物
設(shè)計(jì)Mse I和EcoR I接頭引物、預(yù)擴(kuò)增PCR弓丨物、接頭選擇性擴(kuò)增PCR引物、逆轉(zhuǎn)座子PCR引物，引物序列走向?yàn)? 端到3 端:1)接頭引物 Mse I接頭引物
Mse 15 端接頭引物:Mzx5 GACGATGAGTCCTGAG Mse 13 端接頭引物:Mzx3 TACTCAGGACTCAT EcoR I接頭引物
&ο7 Ι5 端接頭引物:Ezx5 CTCGTAGACTGCGTACC &ο7 Ι3 端接頭引物:Ezx3 AATTGGTACGCAGTCTAC
2)預(yù)擴(kuò)增引物
Mse I 預(yù)擴(kuò)增引物:MzxOO GATGAGTCCTGAGTAAC EcoRl 預(yù)擴(kuò)增引物:Ezx00 GACTGCGTACCAATTCA
3)選擇性擴(kuò)增引物 接頭選擇擴(kuò)增引物:
Mzx02:GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04:GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06:GATGAGTCCTGAGTAACTTMzxOll:GATGAGTCCTGAGTAACCCMzxO16:GATGAGTCCTGAGTAACGGEzxI2:GACTGCGTACCAATTCACGEzxI5:GACTGCGTACCAATTCAGC逆轉(zhuǎn)座子引物:
PLRl GTGGTGGTTCATAGGTATTGTT` PLR2 CTGAAGTCACTGTCACCGAAG PLR3 GCAATAGAAGCGTTACAGACAA PLR4 ATAAGCGACTTCTCCAATCC PLR5 ATCTTGTGGTGAAATGGGAC PLR6 AACAAACCCAGATTCAGACG PLF7 CTTCAGCCCTGTAACCAACA PLF8 CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG 步驟二、牡丹基因組DNA的提取
選取牡丹新鮮的嫩葉，搗碎，利用CTAB法提取基因組DNA:
1)將牡丹幼嫩葉片放入研缽，加入10(Tl30mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入液氮迅速研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移研磨液至預(yù)先冷卻、潔凈的1.5ml離心管中，備用；
2)向上述離心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在溫度為65°C的條件下水浴Ih,期間，每隔5min顛倒混勻一次；` 3)待離心管冷卻至室溫，取出離心管，向離心管中加入等體積氯仿異戊醇溶液，顛倒混勻 IOmin ；
4)將離心管放入離心機(jī)中，在12000rpm的條件下離心IOmin；
5)取上清溶液轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管內(nèi)，再加入等體積氯仿異戊醇溶液，顛倒混勻IOmin ；6)將離心管小心放入離心機(jī)中，在12000rpm的條件下離心IOmin；
7)將上清溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入離心管容積2/3的預(yù)冷無(wú)水乙醇，迅速顛倒混勻，然后放入溫度為-20°C的冰箱內(nèi)Ih ；
8)用槍頭挑出白色絮狀物轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡IOmin ；
9)倒掉上清溶液，再加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡IOmin；
10)倒掉上清溶液，室溫下自然風(fēng)干；
11)加入5(T500mlTE溶液，放入溫度為_20°C的冰箱內(nèi)備用；
步驟三、牡丹基因組DNA中RNA的去除 利用Takara RNase A試劑盒對(duì)提取的牡丹基因組DNA進(jìn)行處理:取牡丹基因組DNA原液稀釋至50ng/μ I后加入I μ I RNase A混勻，瞬時(shí)離心后在溫度為37°C的條件下水浴lh，之后轉(zhuǎn)入溫度為-20°C的條件下保存，備用；
步驟四、牡丹基因組DNA的酶切
利用Takara酶切試劑盒中的i&e I和及I限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟三中制備的牡丹基因組DNA進(jìn)行酶切，20μ I的酶切反應(yīng)液成分為:質(zhì)量濃度為50ng/l.! I的基因組DNA5 10 μ 1，稀釋 10 倍后的 NEBuffer4 2 μ 1，稀釋 100 倍后的 BSA 0.2 μ I, Mse I 酶0.5 μI酶0.5 μ 1，余量為雙蒸水；具體步驟為:
1)將限制性內(nèi)切酶從冰箱內(nèi)取出放置冰上；
2)將DNA、NEBuffer4、BSA和雙蒸水按上述量混勻，在溫度為4°C的條件下放置30min；
3)加入限制性內(nèi)切酶，混勻，瞬時(shí)離心；
4)在溫度為37°C的條件下水浴f3h，之后放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)備用；
步驟五、接頭的準(zhǔn)備
1)將Mzx5、Mzx3 和 Ezx5、Ezx3 接頭引物稀釋到 50 mmol / I ；
2)上述四種接頭引物各取25μ I兩兩配對(duì)混合均勻；
3)將配對(duì)混合均勻后的接頭引物放到PCR中，先在溫度為94°C的條件下反應(yīng)lmin，然后在溫度為36°C的條件下反應(yīng)5min ；
4)室溫下慢慢冷卻，最后合成25μ M的接頭引物Mse接頭和EcoR接頭；
步驟六、酶切產(chǎn)物和接頭的連接
利用Takara Τ4 DNA Ligase連接試劑盒進(jìn)行連接
1)在微量PCR離心管內(nèi)配制25μ I PCR反應(yīng)液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產(chǎn)物8μ 1，步驟五中的i&e接頭引物和及接頭引物各2.5μ 1，T4 DNA連接酶I μ 1，稀釋10倍后的Ligation Buffer2.5 μ I,余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ I ；
2)用移液槍槍頭將上述反應(yīng)液吸打充分混勻，瞬時(shí)離心后在溫度為16°C的條件下保存，備用；
步驟七、連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增
1)將預(yù)擴(kuò)增引物MzxOO和EzxOO稀釋至20μ M后備用；
2)在微量PCR離心管配制25μ I PCR反應(yīng)液，其成分為:連接產(chǎn)物2.5 μ 1，稀釋10倍后的 Buffer 2.5 μ I,Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，Μζχ00 和 EzxOO 兩種預(yù)擴(kuò)增引物各 0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ I ;3)PCR反應(yīng)程序:將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性lmin，50°C退火90s，72°C延伸90s 36個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，得到PCR產(chǎn)物；
4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20 40倍，備用；
步驟八、選擇性擴(kuò)增反應(yīng)
1)將選擇性擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)座子引物稀釋到20μ M后備用；
2)在200μ IPCR離心管內(nèi)配制25 μ I PCR反應(yīng)液，其成分為:預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物稀釋液5 10 μ 1，稀釋10倍后的Buffer2.5 μ 1，Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，選擇性擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)座子引物各0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ I，余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ I ; 3)PCR反應(yīng)程序:將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 68°C退火30s,采用touchdown方法,每個(gè)循環(huán)降低0.7 V,72°C延伸Imin 12個(gè)循環(huán)，然后再94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin 23個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min ；
步驟九、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)
1)將電泳所使用的長(zhǎng)、短玻璃板用水清洗后風(fēng)干；
2)用雙蒸水清洗后風(fēng)干，重復(fù)3次，每次間隔3min；
3)用質(zhì)量濃度為95%的酒精清洗后風(fēng)干，重復(fù)3次，每次間隔3min；
4)取Iml反娃化液和2μ I反娃化劑均勻混合后涂在長(zhǎng)玻璃板上,室溫下放置5min后用質(zhì)量濃度為95%酒精擦洗3次，每次間隔5min ；
5)取Iml剝離硅烷均勻涂于短玻璃板上，室溫下放置5min后用質(zhì)量濃度為95%的酒精擦洗3次,每次間隔5min ；
6)放入邊條至長(zhǎng)玻璃板兩端，將兩塊兒玻璃板放置并用夾子固定在一起，擦洗面向內(nèi)，且兩玻璃板不接觸，用透明膠對(duì)長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板封邊，夾夾子，之后以10°的傾斜角放于平穩(wěn)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上；
7)室溫下放置3 4分鐘后倒入膠液，插入梳子，室溫下凝膠4 6h；
8)去夾子，撕掉透明膠帶，將玻璃板外部沖洗干凈，拔去梳子，立即沖洗拔去梳子后的點(diǎn)樣孔；
9)預(yù)電泳:將玻璃板固定于電泳槽上，上下槽各加入稀釋I倍的500mlTBE溶液，在75ff,200V,80mA 的條件下，電泳 15 30min ；
10)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1/10體積溴酚藍(lán)，取4μI上樣，在恒定功率為80W的條件下電泳2 4h，待溴酚藍(lán)跑至膠板高度的3/4處后停止電泳；
11)漂洗:將玻璃板放入2L雙蒸水中漂洗3次；
12)固定和銀染:加入染色固定液進(jìn)行銀染和固定20min，雙蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法為:加入150ml無(wú)水乙醇，15ml冰醋酸,3g硝酸銀,雙蒸水定容至1.5L ；
13)顯影:加入顯影液進(jìn)行顯影8min，用雙蒸水漂洗3次。14)拍照 15)結(jié)果分析
所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA、Nacl和水組成，其中100ml CTAB溶液按體積比取IOml lmol/1 Tris-Hcl,4ml 0.5 mol/1 EDTA,30ml 5mol/l Nacl,56ml 水。所述步驟二中的TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水組成，其中200mlTE溶液按體積比取 2ml 1 mol/1 的 Tris-Hcl，0.4ml 0.5 mol/1 的 EDTA，余量為水。
所述步驟九中的TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和雙蒸水組成，其中ILTBE溶液取Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5 mol/1 的 EDTA 20ml，雙蒸水定容至 IL0
所述步驟九中的膠液配制方法為:加入丙烯酰胺30g，N，N-二甲基甲酰胺1.5g，稀釋5倍后的TBE 50ml，雙蒸水定容至500ml ;取上述溶液45ml加入360 ill 10%水溶液的過(guò)硫酸銨和40 U I Temed。
所述顯影液的配制方法為:加入20g NaOH, 4ml甲醒,雙蒸水定容至1L。
所述步驟二中的氯仿異戊醇溶液為氯仿和異戊醇按體積比24:1混勻制成。
本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)牡丹屬逆轉(zhuǎn)座子LTR序列引物，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，條帶豐富，和應(yīng)用其他物種上的LTR引物相比，本引物可直接用于牡丹種屬之間多態(tài)性的分析，更具有高效性和實(shí)用性，對(duì)牡丹SSAP分子標(biāo)記意義重大，在本發(fā)明中選擇性擴(kuò)增PCR體系得到優(yōu)化，更適合牡丹屬SSAP分子標(biāo)記的擴(kuò)增，而且還改進(jìn)了聚丙烯酰胺凝膠電泳中銀染的方法，將銀染中固定和染色步驟合二為一，既節(jié)省時(shí)間，又節(jié)約成本，進(jìn)一步提高了 SSAP分子標(biāo)記在牡丹屬上應(yīng)用的效率。


圖1為SSAP分子標(biāo)記技術(shù)原理路線不意圖； 圖2為選擇性擴(kuò)增瓊脂糖電泳檢測(cè)圖； 圖3為選擇性擴(kuò)增聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)圖。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說(shuō)明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例一 一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，包括以下步驟: 步驟一、設(shè)計(jì)引物 設(shè)計(jì)Mse I和EcoR I接頭引物、預(yù)擴(kuò)增PCR引物、接頭選擇性擴(kuò)增PCR引物、逆轉(zhuǎn)座子PCR引物，引物序列走向?yàn)? 端到3 端: 1)接頭引物 Mse I接頭引物 Mse 15 端接頭引物:Mzx5 GACGATGAGTCCTGAG Mse 13 端接頭引物:Mzx3 TACTCAGGACTCAT EcoR I接頭引物 EcoRI5 端接頭引物:Ezx5 CTCGTAGACTGCGTACC EcoRI3 端接頭引物:Ezx3 AATTGGTACGCAGTCTAC 2)預(yù)擴(kuò)增引物 Mse I 預(yù)擴(kuò)增引物:MzxOO GATGAGTCCTGAGTAAC EcoR I 預(yù)擴(kuò)增引物:EzxOO GACTGCGTACCAATTCA3)選擇性擴(kuò)增引物 接頭選擇擴(kuò)增引物:Mzx02:GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04:GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06:GATGAGTCCTGAGTAACTTMzxOll:GATGAGTCCTGAGTAACCCMzxO16:GATGAGTCCTGAGTAACGGEzxI2:GACTGCGTACCAATTCACGEzxI5:GACTGCGTACCAATTCAGC逆轉(zhuǎn)座子引物: PLRl GTGGTGGTTCATAGGTATTGTT PLR2 CTGAAGTCACTGTCACCGAAG PLR3 GCAATAGAAGCGTTACAGACAA PLR4 ATAAGCGACTTCTCCAATCC PLR5 ATCTTGTGGTGAAATGGGAC PLR6 AACAAACCCAGATTCAGACG PLF7 CTTCAGCCCTGTAACCAACA PLF8 CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG 步驟二、牡丹基因組DNA的提取 選取牡丹新鮮的嫩葉，搗碎，利用CTAB法提取基因組DNA: 1)將牡丹幼嫩葉片放入研缽內(nèi)，加入115mg聚乙烯吡咯烷酮，再加入液氮迅速研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移研磨液至預(yù)先冷卻、潔凈的1.5ml離心管中，備用； 2)向上述離心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在溫度為65°C的條件下水浴lh，水浴過(guò)程中，每隔5min顛倒混勻一次； 3)待離心管冷卻至室溫后，取出離心管，向離心管中加入0.75ml氯仿異戊醇溶液，顛倒混勻IOmin ； 4)將離心管放入離心機(jī)中，在12000rpm的條件下離心IOmin； 5)將離心管內(nèi)的上 清溶液轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管內(nèi)，再加入與上清溶液等體積的氯仿異戍醇溶液，顛倒混勻IO min ； 6)將離心管放入離心機(jī)中，在12000rpm的條件下離心IOmin； 7)將上清溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入離心管容積2/3的預(yù)冷無(wú)水乙醇，迅速顛倒混勻，然后放入溫度為-20°C的冰箱內(nèi)Ih ； 8)用槍頭挑出白色絮狀物轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡IOmin ； 9)倒掉離心管內(nèi)上清溶液，再加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡IOmin； 10)倒掉上清溶液，室溫下自然風(fēng)干； 11)加入5(T500mlTE溶液，放入溫度為_20°C的冰箱內(nèi)備用； 步驟三、牡丹基因組DNA中RNA的去除 利用Takara RNase A試劑盒對(duì)提取的牡丹基因組DNA進(jìn)行處理:取牡丹基因組DNA原液稀釋至50ng/ill后加入I ill RNase A混勻，瞬時(shí)離心后在溫度為37°C的條件下水浴lh，之后轉(zhuǎn)入溫度為-20°C的條件下保存，備用； 步驟四、牡丹基因組DNA的酶切 利用Takara酶切試劑盒中的i&e I和及限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟三中制備的牡丹基因組DNA進(jìn)行酶切，20 ill的酶切反應(yīng)液成分為:質(zhì)量濃度為50ng/iil的基因組DNA 7u I,稀釋 10 倍后的 NEBuffer4 2 U 1，稀釋 100 倍后的 BSA 0.2 u I,Mse I 酶 0.5 y !,EcoR I 酶0.5iU，余量為雙蒸水；具體步驟為: 1)將限制性內(nèi)切酶從冰箱內(nèi)取出放置冰上； 2)將DNA、NEBuffer4、BSA和雙蒸水按上述量混勻，在溫度為4°C的條件下放置30min； 3)加入限制性內(nèi)切酶，混勻，瞬時(shí)離心； 4)在溫度為37°C的條件下水浴2h，之后放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)備用； 步驟五、接頭的準(zhǔn)備 1)將Mzx5、Mzx3 和 Ezx5、Ezx3 接頭引物稀釋到 50mmol/l ； 2)上述四種接頭引物各取25Ul兩兩配對(duì)混合均勻； 3)將配對(duì)混合均勻后的接頭引物放到PCR中，先在溫度為94°C的條件下反應(yīng)lmin，然后在溫度為36°C的條件下反應(yīng)5min ； 4)室溫下慢慢冷卻，最后合成25ii M的接頭引物i&e接頭和接頭； 步驟六、酶切產(chǎn)物和接頭的連接 利用Takara T4 DNA Ligase連接試劑盒進(jìn)行連接 1)在微量PCR離心管內(nèi)配制25ill PCR反應(yīng)液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產(chǎn)物8iil，步驟五中的Mse接頭引物和EcoR接頭引物各2.5iil，T4 DNA連接酶I yl，稀釋10倍后的Ligation Buffer2.5 u I,余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 U I ； 2)用移液槍槍頭將上述反應(yīng)液吸打充分混勻，瞬時(shí)離心后在溫度為16°C的條件下保存，備用; 步驟七、連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增 1)將預(yù)擴(kuò)增引物MzxOO和EzxOO稀釋至20u M后備用； 2)在微量PCR離心管配制25ill PCR反應(yīng)液，其成分為:連接產(chǎn)物2.5 yl，稀釋10倍后的 Buffer 2.5 u I,Mg2+ 1.875 u l，dNTP 0.5 u I，MzxOO 和 EzxOO 兩種預(yù)擴(kuò)增引物各 0.5 y 1，Taq酶0.2 iil，余量用雙蒸 水補(bǔ)齊至25 yl ; 3)PCR反應(yīng)程序:將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性lmin，50°C退火90s，72°C延伸90s 36個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，得到PCR產(chǎn)物； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍，備用； 步驟八、選擇性擴(kuò)增反應(yīng) 1)將選擇性擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)座子引物稀釋到20y mol/1后備用； 2)在200ill的PCR離心管內(nèi)配制25 ill PCR反應(yīng)液，其成分為:預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物稀釋液7iil，稀釋10倍后的Buffer2.5iil，Mg2+ 1.875 u l,dNTP 0.5 yl，選擇性擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)座子引物各0.5 iil，Taq酶0.2 ii I，余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 yl ; 3)PCR反應(yīng)程序:將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 68°C退火30s,采用touchdown,每個(gè)循環(huán)降0.7°C, 72°C延伸lmin 12個(gè)循環(huán)，然后再94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin 23個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸 5min ； 步驟九、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 1)將電泳所使用的長(zhǎng)、短玻璃板用水清洗后風(fēng)干； 2)用雙蒸水清洗后風(fēng)干，重復(fù)3次，每次間隔3min； 3)用質(zhì)量濃度為95%的酒精清洗后風(fēng)干，重復(fù)3次，每次間隔3min； 4)取Iml反娃化液和2ii I反娃化劑均勻混合后涂在長(zhǎng)玻璃板上,室溫下放置5min后用質(zhì)量濃度為95%酒精擦洗3次，每次間隔5min ； 5)取Iml剝離硅烷均勻涂于短玻璃板上，室溫下放置5min后用質(zhì)量濃度為95%的酒精擦洗3次,每次間隔5min ； 6 )將兩塊J L玻璃板固定在一起，擦洗面向內(nèi)，且兩玻璃板不接觸，用透明膠對(duì)長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板封邊，夾夾子，之后以10°的傾斜角放于平穩(wěn)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上； 7)室溫下放置4分鐘后倒 入膠液，插入梳子，室溫下凝膠5h； 8)去夾子，撕掉透明膠帶，將玻璃板外部沖洗干凈，拔去梳子，立即沖洗拔去梳子后的點(diǎn)樣孔； 9)預(yù)電泳:將玻璃板固定于電泳槽上，上下槽各加入稀釋I倍的500mlTBE溶液，在75ff,200V,80mA 的條件下，電泳 20min ； 10)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1/10體積溴酚藍(lán)，取4iil上樣，在恒定功率為80W的條件下電泳3h，待溴酚藍(lán)跑至膠板高度的3/4處后停止電泳； 11)漂洗:將玻璃板放入2L雙蒸水中漂洗3次； 12)固定和銀染:加入染色固定液進(jìn)行銀染和固定20min，雙蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法為:加入150ml無(wú)水乙醇，15ml冰醋酸,3g硝酸銀,雙蒸水定容至1.5L ； 13)顯影:加入顯影液進(jìn)行顯影8min，用雙蒸水漂洗3次。
所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA、Nacl和水組成，其中100ml CTAB溶液按體積比取 IOml lmol/1 Tris-Hcl,4ml 0.5 mol/1 EDTA,30ml 5mol/l Nacl,56ml 水。
所述步驟二中的TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水組成，其中200mlTE溶液按體積比取 2ml I mol/1 的 Tris-Hcl，0.4ml 0.5 mol/1 的 EDTA，余量為水。
所述步驟九中的TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和雙蒸水組成，其中ILTBE溶液取Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5 mol/1 的 EDTA 20ml，雙蒸水定容至 IL0
所述步驟九中的膠液配制方法為:加入丙烯酰胺30g，N，N-二甲基甲酰胺1.5g，稀釋5倍后的TBE 50ml，雙蒸水定容至500ml ;取上述溶液45ml加入360 ill 10%水溶液的過(guò)硫酸銨和40 U I Temed。
所述顯影液的配制方法為:加入20g NaOH, 4ml甲醒,雙蒸水定容至1L。
所述步驟二中的氯仿異戊醇溶液為氯仿和異戊醇按體積比24:1混勻制成。
如圖2、圖3所示，通過(guò)采用本發(fā)明方法的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，條帶豐富，將SSAP分子標(biāo)記技術(shù)成功的應(yīng)用在牡丹上。
權(quán)利要求
1.一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、設(shè)計(jì)引物 設(shè)計(jì)Mse I和EcoR I接頭引物、預(yù)擴(kuò)增PCR引物、接頭選擇性擴(kuò)增PCR引物、逆轉(zhuǎn)座子PCR引物，引物序列走向?yàn)? 端到3 端: 1)接頭引物 Mse I接頭引物 Mse 15 端接頭引物:Mzx5 GACGATGAGTCCTGAG Mse 13 端接頭引物:Mzx3 TACTCAGGACTCAT EcoR I接頭引物 EcoRI5 端接頭引物:Ezx5 CTCGTAGACTGCGTACC EcoRI3 端接頭引物:Ezx3 AATTGGTACGCAGTCTAC 2)預(yù)擴(kuò)增引物 Mse I 預(yù)擴(kuò)增引物:MzxOO GATGAGTCCTGAGTAAC EcoR I 預(yù)擴(kuò)增引物:EzxOO GACTGCGTACCAATTCA 3)選擇性擴(kuò)增引物 接頭選擇擴(kuò)增引物:Mzx02:GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04:GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06:GATGAGT CCTGAGTAACTTMzxOll:GATGAGTCCTGAGTAACCCMzxO16:GATGAGTCCTGAGTAACGGEzxI2:GACTGCGTACCAATTCACGEzxI5:GACTGCGTACCAATTCAGC逆轉(zhuǎn)座子引物: PLRl GTGGTGGTTCATAGGTATTGTT PLR2 CTGAAGTCACTGTCACCGAAG PLR3 GCAATAGAAGCGTTACAGACAA PLR4 ATAAGCGACTTCTCCAATCC PLR5 ATCTTGTGGTGAAATGGGAC PLR6 AACAAACCCAGATTCAGACG PLF7 CTTCAGCCCTGTAACCAACA PLF8 CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG 步驟二、牡丹基因組DNA的提取 選取牡丹新鮮的嫩葉，搗碎，利用CTAB法提取基因組DNA: O將牡丹幼嫩葉片放入研缽內(nèi)，加入10(Tl30mg聚乙烯吡咯烷酮，再加入液氮迅速研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移研磨液至預(yù)先冷卻、潔凈的1.5ml離心管中，備用； 2)向上述離心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在溫度為65°C的條件下水浴lh，水浴過(guò)程中，每隔5min顛倒混勻一次；3)待離心管冷卻至室溫后，取出離心管，向離心管中加入0.75ml氯仿異戊醇溶液，顛倒混勻IOmin ； 4)將離心管放入離心機(jī)中，在12000rpm的條件下離心IOmin； 5)將離心管內(nèi)的上清溶液轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管內(nèi)，再加入與上清溶液等體積的氯仿異戍醇溶液，顛倒混勻IOmin ； 6)將離心管放入離心機(jī)中，在12000rpm的條件下離心IOmin； 7)將上清溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入離心管容積2/3的預(yù)冷無(wú)水乙醇，迅速顛倒混勻，然后放入溫度為-20°C的冰箱內(nèi)Ih ； 8)用槍頭挑出白色絮狀物轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡IOmin ； 9)倒掉離心管內(nèi)上清溶液，再加入質(zhì)量濃度為75%的乙醇浸泡IOmin； 10)倒掉上清溶液，室溫下自然風(fēng)干； 11)加入5(T500mlTE溶液，放入溫度為_20°C的冰箱內(nèi)備用； 步驟三、牡丹基因組DNA中RNA的去除 利用Takara RNase A試劑盒對(duì)提取的牡丹基因組DNA進(jìn)行處理:取牡丹基因組DNA原液稀釋至50ng/μ I后加入I μ I RNase A混勻，瞬時(shí)離心后在溫度為37°C的條件下水浴lh，之后轉(zhuǎn)入溫度為-20°C的條件下保存，備用； 步驟四、牡丹基因組DNA的酶切 利用Takara酶切試劑盒中的Mse I和EcoR I限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟三中制備的牡丹基因組DNA進(jìn)行酶切:20μ I的酶切反應(yīng)液成分為:質(zhì)量濃度為50ng/l.! I的基因組 DNA5 10μ 1，稀釋 10 倍后的 NEBuffer4 2 μ 1，稀釋 100 倍后的 BSA 0.2 μ I, Mse I 酶0.5 μ IjEcoR I酶0.5 μ 1，余量為雙蒸水；具體步驟為: 1)將限制性內(nèi)切酶從冰箱內(nèi)取出放置冰上； 2)將DNA、NEBuffer4、BSA和雙蒸水按上述量混勻，在溫度為4°C的條件下放置30min； 3)加入限制性內(nèi)切酶，混勻，瞬時(shí)離心； 4)在溫度為37°C的條件下水浴f3h，之后放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)備用； 步驟五、接頭的準(zhǔn)備 1)將Mzx5、Mzx3 和 Ezx5、Ezx3 接頭引物稀釋到 50mmol/l ； 2)上述四種接頭引物各取25μ I兩兩配對(duì)混合均勻； 3)將配對(duì)混合均勻后的接頭引物放到PCR中，先在溫度為94°C的條件下反應(yīng)lmin，然后在溫度為36°C的條件下反應(yīng)5min ； 4)室溫下慢慢冷卻，最后合成25μ M的接頭引物Mse接頭和EcoR接頭； 步驟六、酶切產(chǎn)物和接頭的連接 利用Takara Τ4 DNA Ligase連接試劑盒進(jìn)行連接 1)在微量PCR離心管內(nèi)配制25μ I PCR反應(yīng)液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產(chǎn)物8μ 1，步驟五中的Mse接頭引物和EcoR接頭引物各2.5μ 1，T4 DNA連接酶I μ 1，稀釋10倍后的Ligation Buffer2.5 μ I,余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ I ； 2)用移液槍槍頭將上述反應(yīng)液吸打充分混勻，瞬時(shí)離心后在溫度為16°C的條件下保存，備用; 步驟七、連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增1)將預(yù)擴(kuò)增引物MzxOO和EzxOO稀釋至20μ M后備用； 2)在微量PCR離心管配制25μ I PCR反應(yīng)液，其成分為:連接產(chǎn)物2.5 μ 1，稀釋10倍后的 Buffer 2.5 μ I, Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，MzxOO 和 EzxOO 兩種預(yù)擴(kuò)增引物各0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ I ; 3)PCR反應(yīng)程序:將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性lmin，50°C退火90s，72°C延伸90s 36個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，得到PCR產(chǎn)物； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20 40倍，備用； 步驟八、選擇性擴(kuò)增反應(yīng) 1)將選擇性擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)座子引物稀釋到20μπιΟ1/1后備用； 2)在200μ I的PCR離心管內(nèi)配制25 μ I PCR反應(yīng)液，其成分為:預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物稀釋液5 10 μ 1，稀釋10倍后的Buffer2.5μ l，Mg2+ 1.875 μ I, dNTP 0.5 μ 1，選擇性擴(kuò)增引物和逆轉(zhuǎn)座子引物各0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ I，余量用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ I ; 3)PCR反應(yīng)程序:將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 68°C退火30s,采用touchdown,每個(gè)循環(huán)降0.7 V, 72°C延伸Imin 12個(gè)循環(huán)，然后再94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸Imin 23個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸 5min ； 步驟九、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 1)將電泳所使用的長(zhǎng)、短玻璃板用水清洗后風(fēng)干； 2)用雙蒸水清洗后風(fēng)干，重復(fù)3次，每次間隔3min； 3)用質(zhì)量濃度為95%的酒精清洗后風(fēng)干，重復(fù)3次，每次間隔3min； 4)取Iml反娃化液和2μ I反娃化劑均勻混合后涂在長(zhǎng)玻璃板上,室溫下放置5min后用質(zhì)量濃度為95%酒精擦洗3次，每次間隔5min ； 5)取Iml剝離硅烷均勻涂于短玻璃板上，室溫下放置5min后用質(zhì)量濃度為95%的酒精擦洗3次,每次間隔5min ； 6)將兩塊J L玻璃板固定在一起，擦洗面向內(nèi)，且兩玻璃板不接觸，用透明膠對(duì)長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板封邊，夾夾子，之后以10°的傾斜角放于平穩(wěn)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上； 7)室溫下放置3 4分鐘后倒入膠液，插入梳子，室溫下凝膠4 6h； 8)去夾子，撕掉透明膠帶，將玻璃板外部沖洗干凈，拔去梳子，立即沖洗拔去梳子后的點(diǎn)樣孔； 9)預(yù)電泳:將玻璃板固定于電泳槽上，上下槽各加入稀釋I倍的500mlTBE溶液，在75ff,200V,80mA 的條件下，電泳 15 30min ； 10)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1/10體積溴酚藍(lán)，取4μI上樣，在恒定功率為80W的條件下電泳2 4h，待溴酚藍(lán)跑至膠板高度的3/4處后停止電泳； 11)漂洗:將玻璃板放入2L雙蒸水中漂洗3次； 12)固定和銀染:加入染色固定液進(jìn)行銀染和固定20min，雙蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法為:加入150ml無(wú)水乙醇，15ml冰醋酸,3g硝酸銀,雙蒸水定容至1.5L ； 13)顯影:加入顯影液進(jìn)行顯影8min，用雙蒸水漂洗3次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，其特征在于，所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA, Nacl和水組成，其中100ml CTAB溶液按體積比取IOmllmol/1 Tris-Hcl,4ml 0.5 mol/1 EDTA,30ml 5mol/l Nacl,56ml 水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法,其特征在于，所述步驟二中的TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水組成，其中200mlTE溶液按體積比取2ml Imol/1 的 Tris-Hcl，0.4ml 0.5 mol/1 的 EDTA，余量為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法,其特征在于，所述步驟九中的TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和雙蒸水組成，其中ILTBE溶液取Tris 54g，硼酸27.5g，0.5 mol/1的EDTA 20ml，雙蒸水定容至IL0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法,其特征在于，所述步驟九中的膠液配制方法為:加入丙烯酰胺30g，N，N-二甲基甲酰胺1.5g，稀釋5倍后的TBE 50ml，雙蒸水定容至500ml ;取上述溶液45ml加入360 μ I 10%水溶液的過(guò)硫酸銨和40 μ I Temed0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，其特征在于，所述顯影液的配制方法為:加入20g NaOH，4ml甲醒，雙蒸水定容至1L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，其特征在于，所述步驟二中的氯仿異戊醇溶液為氯仿和異戊醇按體積比24:1混勻制成。
全文摘要
一種SSAP分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹上的標(biāo)記方法，包括設(shè)計(jì)引物、牡丹基因組DNA的提取、牡丹基因組DNA酶切、接頭的準(zhǔn)備、酶切產(chǎn)物和接頭的連接、連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增反應(yīng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)等步驟。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)牡丹屬逆轉(zhuǎn)座子LTR序列引物，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，條帶豐富，和應(yīng)用其他物種上的LTR引物相比，本引物可直接用于牡丹種屬之間多態(tài)性的分析，更具有高效性和實(shí)用性，在本發(fā)明中選擇性擴(kuò)增PCR體系得到優(yōu)化，更適合牡丹屬SSAP分子標(biāo)記的擴(kuò)增，改進(jìn)了聚丙烯酰胺凝膠電泳中銀染的方法，將銀染中固定和染色步驟合二為一，進(jìn)一步提高了SSAP分子標(biāo)記在牡丹屬上應(yīng)用的效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184290SQ201310107900
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者侯小改, 郭大龍, 張曦, 宋程威, 劉素云, 趙威, 馬慧麗 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)