專利名稱：一種優(yōu)秀越野滑雪運動員體能相關(guān)基因的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選優(yōu)秀越野滑雪運動員體能相關(guān)基因的分子生物學(xué)方法，具體是以基因芯片法及生物信息學(xué)分析對優(yōu)秀越野滑雪運動員家系進(jìn)行體能相關(guān)基因的篩選。適合于優(yōu)秀越野滑雪運動員在基因上的早期選材，屬于體育科學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)與分子生物學(xué)交叉的學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
越野滑雪是目前流行的極限運動項目之一。越野滑雪運動作為體能主導(dǎo)類項目，運動員的力量和耐力素質(zhì)對運動成績起著決定性作用。越野滑雪強調(diào)勇敢跨越心理障礙時所獲得的愉悅感、成就感，也追求競技體育超越生理極限的“更快、更高、更強”。所以作為越野滑雪運動中最艱苦的運動項目之一，越野滑雪運動員在訓(xùn)練和比賽中，除了要求具有對寒冷和寂寞超常的適應(yīng)性，更要承受長距離滑行的高強度運動對體能的影響。冬季奧運會越野滑雪共設(shè)12個小項，男女各6項。男子項目設(shè):1.5km競速、15km傳統(tǒng)式+15km自由式追逐、15km傳統(tǒng)式、5km自由式、團(tuán)隊競速、4X IOkm接力。女子項目設(shè):1.5km競速、7.5km傳統(tǒng)式+7.5km自由式追逐、IOkm傳統(tǒng)式、30km自由式、團(tuán)隊競速、4X5km接力。如此長距離長時間的體育運動必然對體能有很高的要求，而且，現(xiàn)代的越野滑雪場地路線對運動員的體能提出了更高的要求。一個運動員要達(dá)到較高的運動水平，不是幾年的訓(xùn)練就可以實現(xiàn)的，必須有一個長期的系統(tǒng)的科學(xué)的過程。在這個過程中，運動員的科學(xué)選材是所有工作的前提和訓(xùn)練的基礎(chǔ)，是運動員創(chuàng)造世界高水平運動成績的重要因素。實踐證明，只有那些具有天賦的運動員，才能攀上世界頂尖運動水平的高峰。如何根據(jù)越野滑雪運動項目的特點和要求，采用現(xiàn)代的科學(xué)方法和手段，從眾多兒童少年中將天賦條件優(yōu)越且適合從事越野滑雪運動的優(yōu)秀人才選拔出來，一直是廣大體育科學(xué)工作者亟待解決的一個重要課題。近年來分子遺傳學(xué)的研究揭示運動`員的體能與遺傳因素相關(guān)。如肌肉力量、耐力、肌肉動作能力、平衡力、神經(jīng)肌肉動作技巧和協(xié)調(diào)性、柔韌性、有氧運動能力、無氧運動能力、訓(xùn)練應(yīng)答，以及疲勞恢復(fù)等都有重要的生物學(xué)背景。人的體能是基于多種基因的表達(dá)調(diào)控和環(huán)境影響的復(fù)雜性狀，從單基因入手進(jìn)行運動員選材考慮的候選基因較多，較為復(fù)雜困難，也存在不夠全面的缺點。因而需要一種行之有效的方法全面綜合的篩選出優(yōu)秀越野滑雪運動員的體能相關(guān)基因，從而科學(xué)準(zhǔn)確的對越野滑雪運動員進(jìn)行早期基因選材。體能的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)化特點決定了體能的形成必然與多個基因網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，因而運用基因組學(xué)進(jìn)行家系的生物信息學(xué)研究可闡釋體能的遺傳特征。從遺傳角度考慮，優(yōu)秀越野滑雪運動員的體能相關(guān)基因分布在優(yōu)秀越野滑雪運動員的直系親屬家系中，運用基因芯片法可以快捷而全面的篩選獲得這些基因?；蛐酒巧镄酒袘?yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的分支，可以大規(guī)模、高通量地對成千上萬個基因進(jìn)行同時研究。利用基因芯片技術(shù)可以篩選并確立優(yōu)秀越野滑雪運動員身體素質(zhì)體能相關(guān)基因的特定遺傳與變異規(guī)律。利用基因芯片高通量篩選基因的特點，結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運動員的體能及訓(xùn)練相關(guān)數(shù)據(jù)資料，通過相關(guān)分析，獲得其體能相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)，篩選得到目的基因。從體育運動的角度出發(fā)，篩選并挖掘與越野滑雪運動員體能相關(guān)基因，探討不同運動能力者相關(guān)基因的分布特征、基因表達(dá)狀況以及對運動訓(xùn)練的適應(yīng)性等問題。這是保證科學(xué)訓(xùn)練達(dá)到高效益、高質(zhì)量、培養(yǎng)高水平運動員的途徑，同時有助于高水平越野滑雪運動員的科學(xué)選材。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)運用基因芯片對優(yōu)秀越野滑雪運動員體能相關(guān)基因的篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種優(yōu)秀越野滑雪運動員體能相關(guān)基因的篩選方法。本發(fā)明以優(yōu)秀越野滑雪運動員家系為對象，應(yīng)用高通量寡核苷酸基因芯片技術(shù)比較優(yōu)秀越野滑雪運動員體能差異基因表達(dá)譜，并通過基因本體論(gene ontology, GO)分析和闡釋差異基因的分子功能、生物學(xué)途徑和細(xì)胞組件，從而篩選出體能遺傳相關(guān)的目標(biāo)通路，獲得優(yōu)秀越野滑雪運動員體能的相關(guān)目的基因。
具體實施例方式以下以優(yōu)秀越野滑雪運動員家系基因芯片分析篩選其體能相關(guān)基因為例，說明本發(fā)明的具體實施方法。實施例1:優(yōu)秀越野滑雪運動員家系基因芯片分析篩選體能相關(guān)基因1、研究對象選擇以優(yōu)秀越野滑雪運動員家系為研究對象。“優(yōu)秀越野滑雪運動員家系”定義為一級親屬中至少有I人為優(yōu)秀越野滑雪運動員，對每位優(yōu)秀越野滑雪運動員進(jìn)行調(diào)查，確定研究對象，根據(jù)每位優(yōu)秀越野滑雪運動員確定其一級親屬家系成員(包括父母、同胞及子女，年齡、性別不限)。以年齡18 75歲，與試驗組優(yōu)秀越野滑雪運動員無血緣關(guān)系的健康成年人為參照，進(jìn)行優(yōu)秀越野滑雪運動員體能相關(guān)基因的篩選。每位受試者均須簽署知情同意書。2、高通量寡核苷酸基因芯片制備與分析I)芯片選擇選用美國Mfymetrix公司的HunanGenome U133Plus2.0芯片(該芯片有探針組54614個，分析47000個轉(zhuǎn)錄本和變異體，其中可能的已知基因38500個)。實驗前用該系列質(zhì)控芯片Test3進(jìn)行檢測，以確保樣品與全基因組芯片雜交時樣品RNA的質(zhì)量和熒光標(biāo)記量質(zhì)量達(dá)到要求。2)探針制備每例受試者采全血4mL。(I)白細(xì)胞提取，并用Trizol試劑將白細(xì)胞溶解，保存待測；⑵RNA的抽提、純化、質(zhì)檢、樣本混合，由RNA合成雙鏈cDNA，生物素標(biāo)記cDNA
的純化和定量等芯片的制作流程均由公司完成。3)芯片雜交、洗滌及染色。
4)芯片分析采用基因芯片掃描儀3000(Cat#00_00212，美國Affymetrix)進(jìn)行掃描，用Command Console Software3.1讀取原始數(shù)據(jù)；對質(zhì)控合格數(shù)據(jù)采用Gene SpringSoftwarell.0進(jìn)行歸一化處理，所用算法為現(xiàn)代有限元程序系統(tǒng)(MAS5.0)。(I)差異基因的篩選差異倍數(shù)(fold change, FC)為待比較的2個指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后信號的比值，設(shè)定差異基因篩選的閾值FC彡2及FC彡3。(2)差異基因的分析①差異基因功能通過基因本體論網(wǎng)站(http://www.geneontology.0rg/)進(jìn)行GO分析，尋找每個差異基因的生物學(xué)功能、代謝途徑和細(xì)胞定位(P < 0.05)，結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運動員的體能及訓(xùn)練的個人數(shù)據(jù)(P < 0.05)，篩選與體能相關(guān)的差異基因。②信號差異基因通路分析確定優(yōu)秀越野滑雪運動員體能的相關(guān)差異基因后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)網(wǎng)站及數(shù)據(jù)庫(http://www.bioearta.com/ 和 http://www.genome, ip/kegg/)找到每個差異基因所在信號途徑，應(yīng)用超幾何分布統(tǒng)計學(xué)方法分析通路結(jié)果，取顯著性P < 0.05，篩選有意義的目標(biāo)通路。3、熒光 定量RT-PCR驗證在差異基因中選擇表達(dá)FC較大和較小的若干基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR驗證。分別取優(yōu)秀越野滑雪運動員家系成員及對照組樣本抽提總RNA，經(jīng)甲醛變性膠檢測后，進(jìn)一步進(jìn)行基因組DNA消化，以特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，確定陰性對照和陽性對照，采用熒光定量PCR儀對測試基因進(jìn)行PCR擴增，驗證所選基因與優(yōu)秀越野滑雪運動員體能的相關(guān)性。4、統(tǒng)計學(xué)分析采用FoxPro軟件建立數(shù)據(jù)庫，錄入數(shù)據(jù)并至少核對2次無誤，統(tǒng)計處理之前進(jìn)行邏輯核對，缺項核查，以確保原始資料錄入的準(zhǔn)確性。使用在線SAS統(tǒng)計分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異篩選、統(tǒng)計分析。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)秀越野滑雪運動員家系的體能相關(guān)基因篩選方法。“優(yōu)秀越野滑雪運動員家系”定義為一級親屬中至少有I人為優(yōu)秀越野滑雪運動員，對每位優(yōu)秀越野滑雪運動員進(jìn)行調(diào)查，確定研究對象，根據(jù)每位優(yōu)秀越野滑雪運動員確定其一級親屬家系成員(包括父母、同胞及子女，年齡、性別不限)。
2.如權(quán)利要求1所述，基因篩選方法是以優(yōu)秀越野滑雪運動員家系為研究對象，通過高通量寡核苷酸探針基因芯片的制備與分析篩選獲得體能相關(guān)基因，主要步驟是: (1)選取優(yōu)秀越野滑雪運動員家系； (2)制備高通量寡核苷酸探針基因芯片； (3)篩選差異基因進(jìn)行基因本體論分析和信號通路分析:設(shè)定差異基因篩選的閾值FC≥2及FC≥3，GO分析每個差異基因的生物學(xué)功能、代謝途徑和細(xì)胞定位(P < 0.05)，結(jié)合優(yōu)秀越野滑雪運動員的體能及訓(xùn)練的個人數(shù)據(jù)(P < 0.05)，篩選與體能相關(guān)的差異基因； (4)熒光定量RT-PCR驗證靶基因。
全文摘要
本發(fā)明提供一種優(yōu)秀越野滑雪運動員體能相關(guān)基因的篩選方法。本發(fā)明以優(yōu)秀越野滑雪運動員家系為對象，應(yīng)用高通量寡核苷酸基因芯片技術(shù)比較優(yōu)秀越野滑雪運動員體能差異基因表達(dá)譜，并通過基因本體論分析和闡釋差異基因的分子功能、信號途徑和細(xì)胞定位信息，從而篩選出體能遺傳相關(guān)的目標(biāo)通路，通過BioCarta及KEGG網(wǎng)站尋找差異基因所在通路，應(yīng)用超幾何分布統(tǒng)計學(xué)方法分析篩選出有意義的目標(biāo)通路，并用實時熒光定量RT-PCR對差異基因進(jìn)行驗證。獲得優(yōu)秀越野滑雪運動員體能的相關(guān)目的基因。
文檔編號C12Q1/68GK103160585SQ20131010886
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者王旋, 張強, 高俊江, 金紅, 王文杰, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院