專利名稱：水稻品種9194 抗黑條矮縮病位點及其分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及水稻品種9194抗黑條矮縮病位點及其分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
水稻是我國的重要糧食作物。水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streaked dwarf virus, RBSDV)引起的病毒病,主要由灰飛風(fēng)以持久性不經(jīng)卵方式進行傳播。近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推廣，傳毒介體灰飛虱發(fā)生量日益上升，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、江西和福建大規(guī)模發(fā)生，并迅速上升為生產(chǎn)上最主要的病毒病害，給水稻的安全生產(chǎn)帶來很大威脅。水稻黑條矮縮病的典型癥狀是病株矮縮，葉色濃綠僵硬，葉背、葉鞘和莖桿有早期蠟白色，后期為黑褐色的短條紋不規(guī)則突起，嚴(yán)重發(fā)病株不抽穗。目前生產(chǎn)上針對此類病害尚無特效農(nóng)藥，主要是早期通過對灰飛虱的防治，減輕其危害，但防治效果并不理想，且污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡。防治病毒病最理想的方法是選育和利用抗病品種，篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗病種質(zhì)是開展抗黑條矮縮病育種的前提和基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供水稻品種9194抗黑條矮縮病位點及其分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):水稻品種9194抗黑條矮縮病位點，包括位于分子標(biāo)記RM282-RM14898之間的qRBSDV3，位于分子標(biāo)記RM20069-RM3`0之間的qRBSDV6、位于分子標(biāo)記RM3912-RM257之間的qRBSDV9和位于分子標(biāo)記RM26062-RM536之間的qRBSDVll ;所述的分子標(biāo)記RM282引物為SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，存在qRBSDV3時的擴增條帶為146bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM14898引物為SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4，存在qRBSDV3時的擴增條帶為176bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM20069引物為SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，存在qRBSDV6時的擴增條帶為162bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM30引物為SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8，存在qRBSDV6時的擴增條帶為136bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM3912引物為SEQ ID N0.9/SEQ ID N0.10，存在qRBSDV9時的擴增條帶為191bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM257引物為SEQ ID N0.11/SEQ IDN0.12，存在qRBSDV9時的擴增條帶為155bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM26062引物為SEQ IDN0.13/SEQ ID N0.14，存在qRBSDVll時的擴增條帶為149bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM536引物為SEQ ID N0.15/SEQ ID N0.16，存在qRBSDVll時的擴增條帶為242bp條帶。水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的分子標(biāo)記方法:用分子標(biāo)記RM282引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2 或者用分子標(biāo)記 RM14898 引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4,擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM282引物能夠擴增出146bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM14898引物能夠擴增出176bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的存在。水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的分子標(biāo)記方法:用分子標(biāo)記RM20069引物:SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，或者用分子標(biāo)記RM30 引物:SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM20069引物能夠擴增出162bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM30引物能夠擴增出136bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的存在。水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的分子標(biāo)記方法:用分子標(biāo)記RM3912引物:SEQ ID N0.9/SEQ ID N0.10，或者用分子標(biāo)記 RM257 引物:SEQ ID N0.11/SEQ IDN0.12擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM3912引物能夠擴增出191bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM257引物能夠擴增出155bp的擴增片段均標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的存在。水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV 11的分子標(biāo)記方法:用分子標(biāo)記RM26062 引物:SEQ ID N0.13/SEQ ID N0.14，或者用分子標(biāo)記 RM536 引物:SEQ ID N0.15/SEQ ID N0.16擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM26062引物能夠擴增出149bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM536引物能夠擴增出242bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDVll的存在。篩選所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標(biāo)記的方法，包含如下步驟:(I)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配制雜種F1,構(gòu)建了包含200個單株的F2分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系，進行抗黑條矮縮病鑒定；(2)用SDS法提取親本、F1 及F2群體各株系的DNA，采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記SSR對兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR在PTC-200擴增儀上進行，擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進行分析，獲取群體基因型資料；(3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳距離；(4)采用田間誘發(fā)結(jié)合室內(nèi)接種鑒定進行黑條矮縮病的抗性鑒定；(5)利用MAPMARKER/EXP3.0軟件對各個分子標(biāo)記的群體基因型和相應(yīng)家系的黑條矮縮病抗性級別進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離。利用Windows QTLCartographer V2.0軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進行掃描。QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗方法進行估計，共重復(fù)抽樣1000次。同時估計了各位點的加性效應(yīng)和貢獻率；(6)獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點四個，分別為qRBSDV3，位于標(biāo)記RM282-RM14898之間；qRBSDV6，位于標(biāo)記RM20069-RM30之間；qRBSDV9，位于標(biāo)記RM3912-RM257之間；qRBSDVll，位于標(biāo)記RM26062-RM536之間。通過抗黑條矮縮病主基因的分子標(biāo)記來檢測抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有該主基因位點，可預(yù)測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點優(yōu)選在快速篩選抗黑條矮縮病品種或品系中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標(biāo)記引物在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標(biāo)記引物在快速篩選抗黑條矮縮病品種或品系中的應(yīng)用。有益效果前期，申請人對來源于20個國家共960份水稻品種進行了抗黑條矮縮病田間誘發(fā)和人工接種鑒定，篩選到4個黑條矮縮病發(fā)病率較低的水稻品種，其中水稻品種9194，連續(xù)三年每年三個地點田間鑒定均對黑條矮縮病表現(xiàn)高抗，進一步室內(nèi)鑒定結(jié)果也表明，該品種具有較高的黑條矮縮病抗性。該抗源的發(fā)掘為抗水稻黑條矮縮病基因的定位、克隆和育種利用提供了基礎(chǔ)材料。本發(fā)明利用9194與感病品種蘇御糯雜交獲得的F2群體進行遺傳連鎖分析，獲得四個抗黑條矮縮病基因位點，分別為qRBSDV3，qRBSDV6, qRBSDV9和qRBSDVll。通過與上述四個基因位點連鎖的分子標(biāo)記來檢測抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有抗黑條矮縮病基因位點，可預(yù)測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。本發(fā)明所提供的水稻品種9194抗黑條矮縮病主效基因位點的分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點:(I)通過本發(fā)明在國際上首次用SSR標(biāo)記定位了水稻品種9194中的抗黑條矮縮病的基因位點。(2)通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的抗性基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測這些與抗黑條矮縮病基因位點連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的黑條矮縮病抗性，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有黑條矮縮病抗性，進而快速篩選抗病品種或品系用于水稻育種?？剐曰蛭稽c的檢測方便快速，不受環(huán)境影響；(3)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗源的親本與栽培品種進行一 系列雜交，而且要對黑條矮縮病的抗性進行單株選擇。對水稻黑條矮縮病進行表型鑒定復(fù)雜，同時受環(huán)境影響，由于黑條矮縮病不能經(jīng)卵傳毒，要經(jīng)飼養(yǎng)灰飛虱、帶毒和接種傳毒等復(fù)雜的鑒定過程，非常困難，表型鑒定的結(jié)果可靠性低。因此，抗黑條矮縮病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測抗黑條矮縮病基因位點，可以在苗期就鑒定出抗黑條矮縮病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。


圖1 9194和蘇御糯接種后的抗性表現(xiàn)。圖2 9194和蘇御糯F2群體抗黑條矮縮病次數(shù)分布圖。圖3水稻品種9194抗黑條矮縮病基因在染色體上的分布。圖4抗黑條矮縮病基因緊密連鎖分子標(biāo)記的電泳圖譜。M:Mark;l:9194;2:蘇御糯；3 =F1;4-13:極抗單株；14-23:極感單株。
具體實施例方式材料與方法:( 一)9194/蘇御糯F2群體構(gòu)建及表型鑒定
(I)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配制雜種，構(gòu)建了 9194/蘇御糯F2分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的9194/蘇御糯F2l3豕系。(2)表型鑒定(2.1)田間誘發(fā)鑒定材料分別種植于東?？h黃川鎮(zhèn)、贛榆縣土城鎮(zhèn)和灌云縣東辛農(nóng)場試驗田，選用四周為麥田的地塊種植待鑒定材料，以保證獲得足量蟲源。2010和2011年材料均在5月10日(麥?zhǔn)涨?周)分兩個重復(fù)進行播種，每個重復(fù)單個品種播80粒，均勻撒播I行，行長50cm，行距10cm。6月27日移栽，單苗栽插，行株距15cmX 20cm，每個品種栽插60穴。常規(guī)肥水管理，不施用任何農(nóng)藥。2012年鑒定材料分別于5月5日、5月10日和5月15日分3個播期進行播種，每個品種播150粒，移栽時間分別為6月20日、6月25日和6月30日，每個品種栽插120穴，其他種植方式與2010和2011年相同。黑條矮縮病誘發(fā)如下:首先通過盤拍法調(diào)查灰飛虱蟲口密度，將33CmX45CmX5Cm的搪瓷盆對準(zhǔn)秧苗基部輕拍植株，使灰飛虱拍落于盤中，然后迅速將落入盤中的灰飛虱導(dǎo)入高約為60cm，直徑約為35cm的塑料桶內(nèi)。于6月上旬在試驗田進行調(diào)查，種植材料田塊對角線定5點取樣，每點拍0.30m2，記載灰飛虱數(shù)量。隨機對從實驗田塊采集來的100頭灰飛虱進行水稻黑條矮縮病毒的RT-PCR檢測，確定攜毒率。 于7月下旬水稻分蘗盛期統(tǒng)計發(fā)病率。此時發(fā)病植株表現(xiàn)出明顯的病狀:極明顯的矮縮、心葉突破下葉葉鞘而出、部分植株表現(xiàn)為從下葉枕口呈螺旋狀伸出、部分葉片的頂端出現(xiàn)旋狀卷曲。而健康稻株表現(xiàn)分蘗旺盛，生命力強，但尚未拔節(jié)，發(fā)病植株和健康植株反差非常明顯。另外，此時的發(fā)病植株很少有中間型病狀，以每個試驗點2個重復(fù)的發(fā)病百分率平均值作為品種抗黑條矮縮病表型值進行統(tǒng)計。(2.2)人工接種黑條矮縮病毒將親本、抗病和感病對照品種浸種催芽，播種200粒露白發(fā)芽種子于70.5cmX50.5cmX41.5cm的塑料箱內(nèi)，底部接塑料管通水，保持水層約3cm。當(dāng)秧苗長至
2.5-3.0葉時間苗，淘汰病弱苗，保留約150株整齊一致的健苗，每個塑料箱頂端用紗布封口。于2012年6月10日接入從東海黃川(試驗點中灰飛虱帶毒率最高)采集的灰飛虱進行接種，每天驅(qū)趕灰飛虱數(shù)次。7d后拿掉紗布，移走苗上的灰飛虱，把接種后的苗移栽到大田，長至分蘗盛期時調(diào)查病情。人工接種同期每個品種做三個重復(fù)，按每苗20頭灰飛虱計算接蟲。(二)9194/蘇御糯F2群體的分子標(biāo)記分析(I)用SDS法提取親本、F1及F2群體各株系的DNA。(2) SSR分析參照Chen et al.(1997)的程序。10 μ I反應(yīng)體系包括:IOmMTris-HCl pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgC12, 50 μ M dNTPs, 0.2 μ M 引物，0.5U Taqpolymerase (TaKaRa,大連)和 20ng of DNA 模板。擴增反應(yīng)在 PTC-200 (MJ ResearchInc.) PCR 儀上進行:94 °C 4min ；94 °C lmin, 55 °C lmin，72°C 1.5min，35 個循環(huán)；72 °C7min。擴增產(chǎn)物用8%的非變性PAGE膠分離,通過銀染顯色,銀染程序根據(jù)Sanguinetti etal.(1994)的方法制定而成。擴增的DNA條帶利用裝有熒光燈的燈箱進行觀察。記錄結(jié)果，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進行分析，獲取群體基因型資料；
(3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為MAPMAKER/EXP3.0，最小LOD值設(shè)為2，獲得連鎖圖譜；(4)利用 Windows QTL Cartographer V2.0 軟件(Wang et al., 2003)復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping,CIM),以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進行掃描。QTL的檢測采用5%總體顯著水平,相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗(Permutation test)(Churchill and Doerge, 1994)方法進行估計,共重復(fù)抽樣1000次。同時估計了各位點的加性效應(yīng)和貢獻率。利用MAPMAKER/3.0分析軟件進行黑條矮縮病抗性與SSR標(biāo)記的分離分析。并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離(cM)。(三)結(jié)果與分析:9194和蘇御糯經(jīng)黑條矮縮病的田間和室內(nèi)鑒定其平均發(fā)病率分別8.9%和78%，表明9194具有較高的黑條矮縮病抗性，而蘇御糯對黑條矮縮病高度敏感(圖1)。200個F2:3家系對黑條矮縮病的抗性頻率分布呈連續(xù)分布，表明該群體中可能存在多個抗黑條矮縮病位點(圖2)。WF2群體中挑選三個地點及室內(nèi)鑒定均表現(xiàn)高抗或高感的單株各10株，進行12條染色體的連鎖分析，在水稻第3，6，9和11染色體發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)性狀有連鎖跡象。進一步構(gòu)建了第3,6,9和11全染色體的連鎖圖譜,結(jié)合表型數(shù)據(jù),利用Windows QTL CartographerV2.0軟件進行抗黑條矮縮病的QTL檢測。結(jié)果在水稻第3染色體標(biāo)記RM282-RM14898之間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDV3, LOD值為2.34，貢獻率為5.4% ;在水稻第6染色體標(biāo)記RM20069-RM30之間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDV6, LOD值為4.42，貢獻率為
10.3% ;在水稻第9染色體標(biāo)記RM3912-RM257之間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDV9,LOD值為6.63，貢獻率為35.5% ;在水稻第11染色體標(biāo)記RM26062-RM536之間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDVll, LOD值為3.55，貢獻率為31.1%。上述四個QTLs可解釋表型變異82.3% (圖3)。分子標(biāo)記RM282引物:
上游引物:CTGTGTCGAAAGGCTGCAC(SEQ ID N0.1)下游引物:CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG(SEQ ID N0.2)分子標(biāo)記RM14898引物:上游引物:ATGTTCAACCTTGTCCCGACTAACC(SEQ ID N0.3)下游引物:TAAAGACGGCAGCTATCACTTTGC(SEQ ID N0.4)用分子標(biāo)記RM282引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2或者用分子標(biāo)記RM14898引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4，擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM282引物能夠擴增出146bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM14898引物能夠擴增出176bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的存在(圖4)。分子標(biāo)記RM20069引物:上游引物:GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG(SEQ ID N0.5)下游引物:CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG(SEQ ID N0.6)分子標(biāo)記RM30引物:上游引物:ACACTGTAGCGGCCACTG(SEQ ID N0.7)下游引物:CCTCCACTGCTCCACATCTT(SEQ ID N0.8)用分子標(biāo)記RM20069引物:SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，或者用分子標(biāo)記RM30引物:SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM20069引物能夠擴增出162bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM30引物能夠擴增出136bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的存在(圖4)。分子標(biāo)記RM3912引物:上游引物:GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG(SEQ ID N0.9)下游引物:CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG(SEQ ID N0.10)分子標(biāo)記RM257引物:上游引物:ACACTGTAGCGGCCACTG(SEQ ID N0.11)下游引物:CCTCCACTGCTCCACATCTT(SEQ ID N0.12)用分子標(biāo)記RM3912引物:SEQ ID N0.9/SEQ ID N0.10，或者用分子標(biāo)記RM257引物:SEQ ID N0.11/SEQ ID N0.12擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM3912引物能夠擴增出191bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM257引物能夠擴增出155bp的擴增片段均標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的存在(圖4)。分子標(biāo)記RM26062引物:上游引物:TTTGCGTTTGCGTTTGCGTAGG(SEQ ID N0.13)下游引物:ACCCGTACACCTCCACACAGTGC(SEQ ID N0.14)分子標(biāo)記RM536引物:上游引物:TCTCTCCTCTTGTTTGGCTC(SEQ ID N0.15)下游引物:ACACACCAACACGACCACAC(SEQ ID N0.16)用分子標(biāo)記RM26062引物:SEQ ID N0.13/SEQ ID N0.14，或者用分子標(biāo)記RM536引物:SEQ ID N0.15/SEQ ID N0.16擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM26062引物能夠擴增出149bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM536引物能夠擴增出242bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDVll的存在(圖4)。通過與上述四個基因位點連鎖的 分子標(biāo)記來檢測抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有抗黑條矮縮病基因位點，可預(yù)測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
權(quán)利要求
1.水稻品種9194抗黑條矮縮病位點，其特征在于包括位于分子標(biāo)記RM282-RM14898之間的qRBSDV3，位于分子標(biāo)記RM20069-RM30之間的qRBSDV6、位于分子標(biāo)記RM3912-RM257之間的qRBSDV9和位于分子標(biāo)記RM26062-RM536之間的qRBSDVll ;所述的分子標(biāo)記RM282引物為SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，存在qRBSDV3時的擴增條帶為146bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM14898引物為SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4，存在qRBSDV3時的擴增條帶為176bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM20069引物為SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，存在qRBSDV6時的擴增條帶為162bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM30引物為SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8，存在qRBSDV6時的擴增條帶為136bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM3912引物為SEQ ID N0.9/SEQ ID N0.10，存在qRBSDV9時的擴增條帶為191bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM257引物為SEQ ID N0.11/SEQ ID N0.12，存在qRBSDV9時的擴增條帶為155bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM26062引物為SEQ ID N0.13/SEQ ID N0.14，存在qRBSDVll時的擴增條帶為149bp條帶；所述的分子標(biāo)記RM536引物為SEQ ID N0.15/SEQ ID N0.16，存在qRBSDVll時的擴增條帶為242bp條帶。
2.水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的分子標(biāo)記方法，其特征在于:用分子標(biāo)記 RM282 引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2 或者用分子標(biāo)記 RM14898 引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4，擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM282引物能夠擴增出146bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM14898引物能夠擴增出176bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的存在。
3.水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的分子標(biāo)記方法，其特征在于:用分子標(biāo)記RM20069 引物:SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，或者用分子標(biāo)記 RM30 引物:SEQ ID N0.7/SEQID N0.8擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM20069引物能夠擴增出162bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM30引物能夠擴增出136bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的存在。
4.水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的分子標(biāo)記方法,其特征在于:用分子標(biāo)記 RM3912 引物:SEQ ID N0.9/SEQ ID N0.10，或者用分子標(biāo)記 RM257 引物:SEQ ID N0.11/SEQ ID N0.12擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM3912引物能夠擴增出191bp的擴增片 段，或用分子標(biāo)記RM257引物能夠擴增出155bp的擴增片段均標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的存在。
5.水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDVll的分子標(biāo)記方法，其特征在于:用分子標(biāo)記RM26062引物:SEQ ID N0.13/SEQ ID N0.14，或者用分子標(biāo)記RM536引物:SEQ IDN0.15/SEQ ID N0.16擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標(biāo)記RM26062引物能夠擴增出149bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM536引物能夠擴增出242bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDVll的存在。
6.篩選權(quán)利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標(biāo)記的方法，其特征在于包含如下步驟: (1)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配制雜種F1,構(gòu)建了包含200個單株的F2分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系，進行抗黑條矮縮病鑒定； (2)用SDS法提取親本、F1及F2群體各株系的DNA，采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記SSR對兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR在PTC-200擴增儀上進行，擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進行分析，獲取群體基因型資料； (3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳距離； (4)采用田間誘發(fā)結(jié)合室內(nèi)接種鑒定進行黑條矮縮病的抗性鑒定； (5)利用MAPMARKER/EXP3.0軟件對各個分子標(biāo)記的群體基因型和相應(yīng)家系的黑條矮縮病抗性級別進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離。利用Windows QTLCartographer V2.0軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進行掃描。QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗方法進行估計，共重復(fù)抽樣1000次。同時估計了各位點的加性效應(yīng)和貢獻率； (6)獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點四個，分別為qRBSDV3，位于標(biāo)記RM282-RM14898之間；qRBSDV6，位于標(biāo)記RM20069-RM30之間；qRBSDV9，位于標(biāo)記RM3912-RM257之間；qRBSDVll，位于標(biāo)記RM26062-RM536之間。通過抗黑條矮縮病主基因的分子標(biāo)記來檢測抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有該主基因位點，可預(yù)測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
7.權(quán)利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點在水稻育種中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點在快速篩選抗黑條矮縮病 品種或品系中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標(biāo)記引物在水稻育種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標(biāo)記引物在快速篩選抗黑條矮縮病品種或品系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻品種9194抗黑條矮縮病位點及其分子標(biāo)記方法。對抗黑條矮縮病水稻品種9194(♀)與感病品種蘇御糯(♂)雜交獲得的F2單株的基因型和相應(yīng)F2:3家系的黑條矮縮病抗性級別進行遺傳連鎖分析，獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點四個，其中qRBSDV3位于標(biāo)記RM282‐RM14898之間；qRBSDV6位于標(biāo)記RM20069-RM30之間；qRBSDV9位于標(biāo)記RM3912-RM257之間；qRBSDV11位于標(biāo)記RM26062-RM536之間。通過抗黑條矮縮病基因的分子標(biāo)記來檢測抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有黑條矮縮病抗性基因位點，可預(yù)測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
文檔編號C12Q1/68GK103146700SQ201310109798
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者萬建民, 劉裕強, 江玲, 孫志廣, 胡金龍, 王寶祥, 王 琦, 趙志剛, 王益華, 陳亮明, 劉世家, 劉喜, 陳賽華, 張文偉, 田云錄, 王春明, 徐大勇 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)