一種與高血壓易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)與原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)的位點(diǎn)，并公開了一種檢測(cè)原發(fā)性高血壓相關(guān)基因線粒體融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括檢測(cè)個(gè)體的線粒體融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）5’端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
【專利說明】[0001] 一種與高血壓易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及人線粒體融合基因2 (Mfn2 gene)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)5'端非編碼 區(qū)-1248bp的檢測(cè)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這個(gè)SNP位點(diǎn)的試劑盒。
[0003]

【背景技術(shù)】
[0004] 原發(fā)性高血壓（essential hypertension, EH)是一種多因素、多基因疾病，由環(huán) 境與遺傳因素共同致病的常見而多發(fā)的心血管病癥，對(duì)人類健康造成了極大的影響。隨著 分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因已經(jīng)有150余種，但是的發(fā)病機(jī)制仍 然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預(yù)防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環(huán)境共 同作用的結(jié)果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環(huán)境因素是可以控制和確認(rèn)的，而 對(duì)高血壓遺傳學(xué)因素卻是固定不變的。因此，對(duì)可變因素的控制，如對(duì)高血壓危險(xiǎn)因素的 預(yù)防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發(fā)病，但是對(duì)固定不變的遺傳因素的認(rèn)識(shí)不 足卻在一定程度上嚴(yán)重影響著對(duì)高血壓發(fā)病、診斷和治療。因此對(duì)高血壓遺傳學(xué)的研究十 分必要（王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態(tài)性[J].高血壓雜志， 2001,9:259-264)。
[0005] 近二十余年來，有關(guān)高血壓治療的研究更多地集中在對(duì)血壓的控制和對(duì)靶器官的 保護(hù)，并已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對(duì)人類內(nèi) 源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究?jī)?nèi)源性抗高血壓機(jī)制是今后高血壓防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，如果通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制治 療高血壓病，將會(huì)促進(jìn)我國生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我國每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費(fèi)用。
[0006] 目前所發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因，歸結(jié)起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓基 因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學(xué)者陳光慧等[Chen GH，Zhang CH，ZhuYQ，etal. Expression of a novel gene related to hypertension[J]. Natl Med J China, 1997, 77: 823-828·]于1997年對(duì)培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠（SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY) 大鼠的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行差異顯示，克隆出一個(gè)新基因--增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene, HSG)。它包含有4160bp的喊基對(duì)，共編碼661個(gè)氨基酸（NM_014874, GeneBank Access U41803)。后經(jīng)一系列體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[Chen KH, Guo XM, Dalong Ma, et al. Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J]. Nature Cell Biol, 2004, 6, 872-883. ]，HSG 可以明顯地抑制 Ras-Raf 蛋白-絲裂素活 化蛋白激酶基因表達(dá)，并且可以激活抗癌基因的表達(dá)，有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制多種細(xì) 胞的增殖，且這種抑制作用是通過細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)的。因此HSG基因是原發(fā)性高血壓 的候選基因之一，后經(jīng)基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒 體融合基因 2(mitofusin 2，Mfn2)。
[0007] 由于Mfn2基因在原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠血管和白細(xì)胞中主要的 特點(diǎn)是出現(xiàn)表達(dá)下降，這應(yīng)該是其表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)了異常，但是目前對(duì)Mfn2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方 面的研究較少。5'端非編碼區(qū)是處于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，2000bp以內(nèi)是啟動(dòng)子和主要 轉(zhuǎn)錄因子存在部位，5'端非編碼區(qū)-1248bp (從起始密碼子的"A"起向上第1248位的位置， 在SEQ ID NO: 1中為第32位核苷酸）變異正好處于這個(gè)位置。而且我們?cè)谶M(jìn)行序列的生 物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于Mfn2基因5'端非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)2000bp內(nèi)，且該變異位 點(diǎn)正好位于一個(gè)啟動(dòng)子內(nèi)。另外，該變異位點(diǎn)是一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-轉(zhuǎn)錄激活 蛋白質(zhì)-1 (Activator protein-l，AP-l)的結(jié)合部位，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度而言，具有非常重要 的價(jià)值，因而可能具有非常重要的意義。
[0008] 綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要深入研究原發(fā)性高血壓的 發(fā)病機(jī)制，尋找原發(fā)性高血壓易感基因，篩選出具有高風(fēng)險(xiǎn)的原發(fā)性高血壓患者，開發(fā)檢測(cè) 原發(fā)性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物等。
[0009]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)高血壓易感基因 Mfn2多態(tài)性位點(diǎn)的方法及檢測(cè)試 劑盒。
[0011] 本發(fā)明提供了一種可以通過高血壓易感性基因的檢測(cè)預(yù)測(cè)高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方 法，即檢測(cè)Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的基因型。5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)為G 基因型的個(gè)體其高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群。
[0012] 所述的5'端非編碼區(qū)-1248,位于Mfn2的5'端非編碼區(qū)中（1ρ36. 22 : NC_000001. 10位置12043990 A/G)其中，脫氧核糖核酸（DNA)序列編號(hào)：5'端非編碼 區(qū)-1248位置基于SEQ ID N0 :1 ;引物1基于SEQ ID N0 :2 ;引物2基于SEQ ID N0 :3 ;擴(kuò) 增產(chǎn)物基于SEQ ID N0 :4。
[0013] 具體而言，該方法包括步驟：（a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得Mfn2基因5' 端非編碼區(qū)；（b)通過特異性的引物擴(kuò)增獲得Mfn2基因包含5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的 區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID NO :4 ;(c)檢測(cè)步驟（b)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5'端非編碼 區(qū)-1248的基因型。
[0014] 所述的擴(kuò)增Mfn2基因5'端非編碼區(qū)的引物序列如SEQ ID N0 2和SEQ ID N0 3 所示。
[0015] 上述方法中涉及的測(cè)序、擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操 作方法。
[0016] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)高血壓易感基因的試劑盒，它含有可以包括特異性擴(kuò)增 Mfn2基因5'端非編碼區(qū)中包含5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的區(qū)域的引物。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與特異性擴(kuò)增Mfn2基因5'端非編碼區(qū)中包含5'端非 編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的區(qū)域的引物的序列如SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示。
[0018] 本發(fā)明經(jīng)研究顯示，首次證明了 Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5'端非編碼區(qū)-1248 (位于Mfn2 5'端非編碼區(qū)中，1ρ36. 22 :NC_000001. 10位置12043990 A/G)與高血壓密切 相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能：Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5'端非編碼區(qū)-1248位于 Mfn2,5'端非編碼區(qū)中（1ρ36. 22 :NC_000001. 10位置12043990 A/G)基因型的改變將導(dǎo)致 高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高。其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248A - G 在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異（P〈〇. 05)，即在原發(fā)性高血壓患者中該基因型主 要表現(xiàn)為G，而在正常對(duì)照組中該基因型主要為A，該SNP變化可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在 此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0019] 本發(fā)明提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟：檢測(cè)該 個(gè)體的Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的基因型，以此判斷該個(gè)體患高血壓的發(fā)病風(fēng) 險(xiǎn)是否高于普通人群。
[0020] 在一優(yōu)選例中，所述的差異是選自5'端非編碼區(qū)-1248的單核苷酸多態(tài)性。5'端 非編碼區(qū)-1248位于Mfn2基因5'端非編碼區(qū)中（1ρ36. 22 :NC_000001. 10位置12043990 A/G)。其中，5'端非編碼區(qū)-1248位置基于SEQ ID NO :1。
[0021] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括 步驟： (a) 用Mfn2基因5'端非編碼區(qū)特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 和 (b) 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5'端非編碼區(qū)-1248的基因型。
[0022] Mfn2基因的詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)為（NG_007945. 1) 5'端非編碼區(qū)-1248的核苷酸 序列（可參見網(wǎng)址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。
[0023] 本發(fā)明人對(duì)Mfn2基因中的5'端非編碼區(qū)中（lp36. 22 :NC_000001. 10位置 12043990 A/G)區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序。
[0024] Mfn2基因的5'端非編碼區(qū)-1248的基因型可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、 DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。
[0025] 本發(fā)明公開了一個(gè)與原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)的位點(diǎn)。提供了一種檢測(cè)原發(fā)性高血 壓易感性基因 Mfn2多態(tài)性的方法，它包括檢測(cè)線粒體融合基因2 (Mfn2)的5'端非編碼 區(qū)-1248位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有擴(kuò)增5'端非編 碼區(qū)-1248位點(diǎn)的引物，還可以包括擴(kuò)增Mfn2基因5'端非編碼區(qū)的引物。利用本發(fā)明檢 測(cè)5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的基因型，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉，為該基因多態(tài) 性位點(diǎn)的檢測(cè)和原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)捷的新途徑。
[0026]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是經(jīng)過使用本專利的引物通過PCR擴(kuò)增后所得產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果截圖。顯了 5' 端非編碼區(qū)-1248的一種SNP基因型的測(cè)序結(jié)果。5'端非編碼區(qū)-1248位于Mfn2基因5' 端非編碼區(qū)中（1ρ36. 22 :NC_000001. 10位置12043990 A/G)。其中A為正常對(duì)照組正向測(cè) 序圖，B為原發(fā)性高血壓患者組正向測(cè)序圖，C為正常對(duì)照組反向測(cè)序圖，B為原發(fā)性高血壓 患者組反向測(cè)序圖。從正向測(cè)序圖中可以看出，正常對(duì)照組的A堿基變異為原發(fā)性高血壓 組的G堿基；而在與之相對(duì)應(yīng)的反向測(cè)序圖中，正常對(duì)照組的T堿基變異為原發(fā)性高血壓組 的C堿基。
[0028]

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克??；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0030] 實(shí)施例1 用測(cè)序法檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感基因 MFn2基因的5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)。挑選上 述高血壓病例-對(duì)照組樣本各30例進(jìn)行測(cè)序判斷5'端非編碼區(qū)-1248的基因型。
[0031] 一、實(shí)驗(yàn)方法 PCR測(cè)序引物仍采用上述PCR用引物，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測(cè)序。測(cè)序的儀器 是ABI公司的3130x1遺傳分析儀，用sequence analysis 5. 2分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用 chromas也可以查看。
[0032] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測(cè)序結(jié)果截圖如圖1所示。
[0033] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作 為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本 發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0034] 〈110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所 〈120> -種與高血壓易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)及其檢測(cè)方法 <130> <160> 4 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature 〈222> (32).. (32) <223> n=A or G <400> 1 AATGACCCAAAATATTATCACTTCAACATGTnGTCAGCATATAAATAGTAATGGGC--56 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 〈400> 2 TGACCCACAAATGCAAGCTA----------------------------------------------------- --------------------2〇 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 〈400> 3 GACATGGGGAAGCATTTCAC----------------------------------------------------- --------------------2〇 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <400> 4 TGACCCACAAATGCAAGCTACTTATGTAATTTTAAATTTTCTAGTAGCGACATTTTTAAAAAGAAACAGGTG CAATTAATCTTAGTAATGTATTTAACCCAAATGACCCAAAATATTATCACTTCAACATGTAGTCAGCATATAAATA GTAATGGGCTAATAGCCCTGCACTGTGGCAGGTACCTGTAACCCGGCATTTTGGGAAGCCGAGGCAGGAGAAGATT GCTTGACTCCAGGAGTCCAGGAGTTCAGGACACCAGC--------------------------------------- ---------------261
【權(quán)利要求】
1. 一種與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)的DNA片段，其特征在于所述DNA片段包含如SEQ ID NO. 1所示的序列。
2. 線粒體融合基因2 ( Mfn2) 5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)多態(tài)性在制備檢測(cè)高血壓易 感性的試劑中的用途。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)位 于 1ρ36· 22 :NC_000001. 10 位置 12043990 A/G。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248位 點(diǎn)A - G的突變?cè)黾釉l(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)。
5. -種用于檢測(cè)高血壓易感性的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括能夠特異性擴(kuò) 增線粒Mfn2基因包含5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的區(qū)域的引物。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn) 位于 1ρ36· 22 :NC_000001. 10 位置 12043990 A/G。
7. 如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述引物序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3 所示。
8. 如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于通過所述引物特異性擴(kuò)增獲得Mfn2 基因包含5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn)的DNA片段；并檢測(cè)獲得的DNA片段中5'端非編碼 區(qū)-1248位點(diǎn)的核苷酸，所述位點(diǎn)A - G的突變?cè)黾釉l(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)。
9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于檢測(cè)Mfn2基因5'端非編碼區(qū)-1248位點(diǎn) 的核苷酸的方法選自：Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104099329SQ201310111917
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月2日
【發(fā)明者】王佐廣, 彭曉云, 劉潔琳, 魏永祥, 李梅, 劉雅, 文杰, 許秀芳, 牛秋麗, 溫紹君 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院