專利名稱：一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是由艾滋病病毒(HIV)感染而引起的傳染性疾病，目前對于AIDS的治療主要是采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy,HARRT)，這種方法在減少體內(nèi)HIV感染數(shù)量、延長感染后無癥狀時(shí)間和提高病人生活質(zhì)量等方面取得了成功。但是由于HIV容易產(chǎn)生突變，該方法經(jīng)常導(dǎo)致抗性病毒株的出現(xiàn)。此夕卜，這種方法的高昂費(fèi)用以及所產(chǎn)生的毒副作用進(jìn)一步限制了該方法的廣泛應(yīng)用。CCR5是艾滋病病毒(HIV)感染靶細(xì)胞時(shí)的輔助受體。pol基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白水解酶，對于HIV-1的復(fù)制、前病毒的整合和增殖都具有非常重要的作用。Vif蛋白具有調(diào)節(jié)病毒侵入、組裝、出芽和成熟等功能。近年來，RNA干擾技術(shù)(siRNA和miRNA)在抗HIV-1感染方面的研究取得了很好的進(jìn)展。但是由于HIV-1的高變異性，很快就產(chǎn)生了逃避RNA干擾的變異毒株，從而使得針對HIV-1基因組各基因的RNA干擾的有效性大大降低。選擇宿主細(xì)胞靶點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)是:(1) miRNA的目標(biāo)序列沒有變異的傾向，不會(huì)象病毒基因一樣在miRNA的壓力下發(fā)生逃逸突變；(2)在巨噬細(xì)胞沉默CCR5的表達(dá)，其抗HIV-1的能力比沉默病毒基因更能持久。其不足之處是:(1) miRNA只能減少目標(biāo)基因的表達(dá)，不能敲除；(2)病毒可以通過改變自身的特性，從使用一種輔助受體(如CCR5)轉(zhuǎn)變?yōu)槔昧硪环N輔助受體(如CXCR4)來繼續(xù)感染宿主細(xì)胞。選擇病毒HIV-1 基因組RNA序列作為靶標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)是直接針對病毒RNA，因而具有更強(qiáng)的抑制HIV-1感染的效果；但其缺點(diǎn)是病毒基因靶序列容易發(fā)生突變，且不同株的HIV-1的序列存在差異，因而容易逃避siRNA或miRNA的沉默作用。因此構(gòu)建能同時(shí)靶向宿主細(xì)胞基因和HIV-1基因的聯(lián)合miRNA在RNA干擾上具有優(yōu)越性，既能避免HIV-1的逃逸現(xiàn)象，又能延長干擾作用的持續(xù)時(shí)間，還能提高抑制HIV-1感染的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足而提供一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA及構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA,它包括三個(gè)能同時(shí)靶向基因ccr5、pol、vif的miRNA，第一個(gè)是針對基因ccr5的miRNA，其靶序列為:TGTAAACTGAGCTTGCTCGCT ;第二個(gè)是針對基因pol的miRNA，其靶序列為:ATAGCTTGGTCCAACCTGTTA ;第三個(gè)是針對基因vif的miRNA，其靶序列為:ATGAGTGCTATCATAGTGATG。同時(shí)產(chǎn)生的三個(gè)miRNA分別對基因ccr5、基因pol、基因vif產(chǎn)生干擾作用，使其不能表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抑制艾滋病毒感染和復(fù)制的目的。本發(fā)明還提供了一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA的構(gòu)建方法，其具體步驟如下:A、根據(jù)ccr5、pol、vif基因序列分別設(shè)計(jì)并合成miRNA寡聚單鏈DNA, miRNA寡聚單鏈DNA序列如表I所示，其中下劃線處為靶序列。表I miRNA寡聚單鏈DNA序列
權(quán)利要求
1.一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA，其特征是:它包括三個(gè)能同時(shí)靶向基因ccr5、pol、vif 的miRNA，第一個(gè)是針對基因 ccr5 的miRNA，其靶序列為:TGTAAACTGAGCTTGCTCGCT ；第二個(gè)是針對基因pol的miRNA，其靶序列為:ATAGCTTGGTCCAACCTGTTA ;第三個(gè)是針對基因vif的miRNA，其靶序列為:ATGAGTGCTATCATAGTGATG ;同時(shí)產(chǎn)生的三個(gè)miRNA分別對基因ccr5、基因pol、基因vif產(chǎn)生干擾作用，使其不能表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抑制艾滋病毒感染和復(fù)制的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA的構(gòu)建方法，其特征是:其具體步驟如下: A、根據(jù)ccr5、pol、vif基因序列分別設(shè)計(jì)并合成miRNA寡聚單鏈DNA, miRNA寡聚單鏈DNA序列如表I所示，其中下劃線處為靶序列； 表I miRNA寡聚單鏈DNA序列
全文摘要
一種抗艾滋病病毒感染的三聯(lián)miRNA及構(gòu)建方法，該三聯(lián)miRNA的序列系根據(jù)ccr5、pol、vif基因序列分別設(shè)計(jì)并合成miRNA寡聚單鏈DNA，退火成雙鏈，然后分別插入到miRNA表達(dá)載體pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR中，構(gòu)建成miRNA表達(dá)質(zhì)粒，并通過qPCR方法檢測miRNA表達(dá)質(zhì)粒對靶基因的干擾效果。挑選對ccr5、vif和pol基因干擾效果最好的miRNA串聯(lián)插入到pcDNA6.2 -GW/EmGFP載體中，從而獲得pcDNA6.2 -GW/EmGFP-ccr5-pol-vif串聯(lián)干擾載體，然后將其中的miR-ccr5-pol-vif轉(zhuǎn)移到慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST上，構(gòu)建成pLenti6.3/V5-DESTmiR-ccr5-pol-vif。該重組慢病毒可同時(shí)產(chǎn)生三個(gè)miRNA，分別對基因ccr5、基因pol、基因vif產(chǎn)生干擾作用，使其不能表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抑制艾滋病毒感染和復(fù)制的作用。
文檔編號C12N15/867GK103184224SQ20131011407
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者王芳宇, 何麗芳, 滕濤, 楊海 申請人:衡陽師范學(xué)院