專利名稱：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽在制備治療高血壓的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的一種新用途，即成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽在制備治療高血壓的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們生活水平的快速提高和生活方式的改變，高血壓的發(fā)病率逐年提升的。高血壓是一種以動(dòng)脈壓升高為特征，并伴有心臟、血管、腦和腎等器官功能或器質(zhì)性改變的全身性疾病。高血壓是最常見的心血管疾病，是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。目前我國(guó)18歲及以上居民高血壓患病率約19%。目前治療高血壓的藥物多為化學(xué)制劑，包括利尿劑、中樞神經(jīng)和交感神經(jīng)抑制劑、腎上腺素受體阻滯劑等。這些藥物雖然起效較快，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，需要長(zhǎng)期多次服用，容易使人形成藥物依賴性，并且長(zhǎng)期服用會(huì)造成嚴(yán)重的副作用。2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分離出FGF家族中的一個(gè)新成員并將其命名為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (FGF-21)。FGF-21是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的一名新成員，主要在肝臟中表達(dá)，蛋白N端前28個(gè)氨基酸為信號(hào)肽(去除信號(hào)肽后的多肽為成熟肽)，因此FGF21可以分泌到細(xì)胞外。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的一種新用途，即成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在制備治療高血壓的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種治療高血壓的藥物`，其活性成分為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。所述藥物還包括其它藥學(xué)上可接受的載體或輔料。所述藥物中，除了所述活性成分夕卜，可以添加藥學(xué)上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、增效劑和添加劑等。所述藥物的給藥形態(tài)可為針劑(如粉劑、水劑、油劑)。所述制劑都可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知常用的制備方法而獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、靜脈注射或肌肉注射。以上任一所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療高血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。以上任一所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽具體可采用包括如下步驟的方法制備:(I)表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白；(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。
所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白(即分子伴侶SUM0)。所述“表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白”的實(shí)現(xiàn)方法如下:將所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的編碼基因插入原核表達(dá)載體pSUMO，得到重組質(zhì)粒；將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到所述融合蛋白。所述“切除所述分子伴侶”的實(shí)現(xiàn)方式如下:所述融合蛋白，用SUMO蛋白酶KSUMO蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比具體可為1:50)和DTT (所述DTT的初始濃度可為2mmol/L)切割(切割條件具體可為4°C切割過夜)。所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明還保護(hù)一種制備所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的方法，包括如下步驟:(I)表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白；(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白(即分子伴侶SUM0)。所述“表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白”的實(shí)現(xiàn)方法如下:將所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的編碼基因插入原核表達(dá)載體pSUMO，得到重組質(zhì)粒；將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到所述融合蛋白。所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；
3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽能夠有效調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的血壓水平，具有藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可作為藥物治療高血壓及心血管病變等疾病。


圖1為實(shí)施例1中FGF-21成熟肽溶液的電泳圖。圖2為實(shí)驗(yàn)4周過程中，各組小鼠每周的血壓對(duì)比。圖3為停藥后，各組小鼠24小時(shí)監(jiān)測(cè)血壓的結(jié)果對(duì)比。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。FGF-21蛋白的成熟肽，簡(jiǎn)稱FGF-21成熟肽，如序列表的序列I所示。FGF-21成熟肽的編碼基因如序列表的序列2所示。原核表達(dá)載體pSUMO (在文獻(xiàn)中被稱為“pHisSUMO”):參考文獻(xiàn):姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性重組蛋白的研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 39(10):57-62 ;李璐，尹成凱，李德山.高效表達(dá)可溶性重組蛋白表達(dá)載體——pHisSUM0.生物技術(shù)，2009, 19(3):11-14.。大腸桿菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào):0)801。SUMO蛋白酶I (具有His標(biāo)簽):制備方法見文獻(xiàn):傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文兵，任桂萍，李璐，李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)及其活性鑒定.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26 (6):837-842.。雄性wistar大鼠:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)施例1、FGF-21成熟肽的制備一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、提取離體的人肝臟的總RNA。2、采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將步驟I得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以步驟2得到的cDNA為模板，采用Pl和P2組成的引物對(duì)，采用rTaq酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Pl:5/ -GGTCTCTAGGT CACCCCATCCCTGACTCCAGT-3'；P2:5， -CGCGGATCCTTA GGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG-3。PCR 擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 5min ；95°C 30s、56°C 30s,72°C 45s, 25 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin04、用限制性內(nèi)切酶BsaI和BamHI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶BsaI和BamHI雙酶切原核表達(dá)載體pSUMO，回收約5700bp的載體骨架。
6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pSUMO-FGF-21。重組質(zhì)粒pSUMO-FGF-21中，F(xiàn)GF-21成熟肽的編碼基因和載體骨架上的分子伴侶SUMO的編碼序列、以及載體骨架上的His標(biāo)簽的編碼序列(位于SUMO的編碼序列的上游，由6個(gè)組氨酸殘基組成)融合，形成融合基因，表達(dá)融合蛋白(融合蛋白自N端至C端依次為His標(biāo)簽、分子伴侶SUMO和FGF-21成熟肽)。FGF-21成熟肽的預(yù)期分子量為21KD(推算分子量為21KD，SDS-PAGE電泳顯示分子量為25KD左右)，分子伴侶SUMO的預(yù)期分子量為12KD (推算分子量為12KD，SDS-PAGE電泳顯不分子量為18KD左右)。二、FGF-21成熟肽的制備和純化1、將重組質(zhì)粒pSUMO-FGF-21導(dǎo)入大腸桿菌Rossetta(DE3)，得到重組菌。2、將步驟I得到的重組菌的單菌落接種至5mL LB培養(yǎng)基中，37°C、120rpm振蕩培養(yǎng)10h，然后取菌液，以1:100的體積比接種于500mL含50mg/mL青霉素的LB培養(yǎng)基中，370C、120rpm 振蕩培養(yǎng) 2h，此時(shí) OD6tltlnm 為 0.35 左右。3、向步驟2得到的菌液中加入IPTG并使其濃度為0.25mmol/L以進(jìn)行誘導(dǎo)(30°C、70rpm振蕩培養(yǎng)4h),然后4°C、4000rpm離心30min,收集菌體。4、取步驟3得到的菌體，進(jìn)行超聲破碎(AMP35%，8-12min，工作Is停ls)，4°C、12000rpm離心,分別收集上清液和沉淀。分別將上清液和沉淀進(jìn)行12%SDS_PAGE電泳分析。結(jié)果表明，可溶性表達(dá)的目的蛋白占菌體總目的蛋白的90 %以上。5、取步驟4得到的上清液,進(jìn)行HisTrapTM FF crude colum親和層析。柱子型號(hào)為:柱長(zhǎng)0.7cm,柱高2.5cm。上樣量為10ml。洗脫過程:先用5倍柱體積的雜蛋白洗脫液(溶劑為水，含有如下濃度的各個(gè)溶質(zhì):40mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 50mmol/L Na3PO4 ；pH7.4)洗脫以去除雜蛋白，流速為lml/min ;然后用3倍柱體積的目的蛋白洗脫液(溶劑為水,含有如下濃度的各個(gè)溶質(zhì):500mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI /T, Na3PO4 ；pH7.4)洗脫,流速為 lml/min, 280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)峰(即峰值高于SOmAU的峰)，即為融合蛋白溶液。6、采用HiPr印TM26/10Desalting將步驟5得到的融合蛋白溶液進(jìn)行脫鹽。7、取步驟6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I (SUM0蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比為1:50)和終濃度為2mmol/L的DTT4°C切割過夜。8、取步驟7得到的溶液,進(jìn)行HisTrapTM FF crude colum親和層析。柱子型號(hào)為:柱長(zhǎng)0.7cm,柱高2.5cm。上樣量為15ml，280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)峰(即峰值高于30mAU的峰)，即為FGF-21成熟肽溶液。FGF-21成熟肽溶液的聚丙烯凝膠電泳圖見圖1?；厥漳康膸Р⑦M(jìn)行N端測(cè)序，結(jié)果表明，N端前15個(gè)氨基酸殘基如序列表的序列I自N末端第I至15位氨基酸殘基所示。實(shí)施例2、FGF-21成熟肽溶液對(duì)高血壓的治療作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為六周齡清潔 劑雄性wistar大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用10g/100mL果糖水溶液，正常飼喂，12h晝夜周期喂養(yǎng)，4周后選取收縮壓大于140mm Hg的大鼠，即為成模大鼠。將成膜大鼠分為兩組，每組5只，分別進(jìn)行如下平行處理:
FGF21治療組:每天的7 =00-8:00時(shí)段內(nèi)注射一次實(shí)施例1制備的FGF-21成熟肽
溶液，連續(xù)注射28天；每天每只大鼠注射Img FGF-21成熟肽(以總蛋白計(jì))，用生理鹽水調(diào)
整注射體積為0.5mL。生理鹽水組:每天的7:00-8:00時(shí)段內(nèi)注射一次生理鹽水，連續(xù)注射28天；每天
每只大鼠注射0.5mL。設(shè)置正常對(duì)照組，即5只正常雄性wistar大鼠，每天的7 =00-8:00時(shí)段內(nèi)注射一
次生理鹽水,連續(xù)注射28天；每天每只大鼠注射0.5mL。每周(第I周即實(shí)驗(yàn)第7天、第2周即實(shí)驗(yàn)第14天、第3周實(shí)驗(yàn)第21天，第4周即
實(shí)驗(yàn)第28天)檢測(cè)一次血壓，三次試驗(yàn)的結(jié)果見表I至表3，三次試驗(yàn)的平均值結(jié)果見圖2。
O周即第一次注射前。FGF21治療組的血壓相對(duì)于生理鹽水組顯著下降，與正常對(duì)照組無差異。
表I第一次試驗(yàn)中各組小鼠的血壓(mm Hg)
權(quán)利要求
1.成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽在制備治療高血壓的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療聞血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為權(quán)利要求7至10中任 一所述方法制備得到的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。
4.一種治療高血壓的藥物，其活性成分為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療聞血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為權(quán)利要求7至10中任一所述方法制備得到的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。
7.一種制備成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的方法，包括如下步驟: (1)表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白； (2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽； 所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療聞血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述分子伴侶為分子泛素樣修飾蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述“表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白”的實(shí)現(xiàn)方法如下:將所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的編碼基因插入原核表達(dá)載體pSUMO,得到重組質(zhì)粒；將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta (DE3),得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到所述融合蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在制備治療高血壓的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種治療高血壓的藥物，其活性成分為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽能夠有效調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的血壓水平，具有藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可作為藥物治療高血壓及心血管病變等疾病。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103191415SQ20131011527
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者李德山, 王文飛, 朱升龍, 張振宇, 任桂萍, 劉銘瑤 申請(qǐng)人:哈爾濱博翱生物醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司