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雜交瘤細(xì)胞株1h2、其產(chǎn)生的抗赭曲霉毒素a單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):424042閱讀:220來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:雜交瘤細(xì)胞株1h2、其產(chǎn)生的抗赭曲霉毒素a單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株1H2、其產(chǎn)生的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
赭曲霉毒素包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物,是由多種生長(zhǎng)在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。其中赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大,在霉變谷物、飼料等中最常見。OTA主要經(jīng)胃腸道吸收,在人體血液中半衰期長(zhǎng)達(dá)840h,有很強(qiáng)的肝毒性和腎毒性,是引起巴爾干腎炎的主要原因,除此,其還具有致畸和致癌作用,與上尿路腫瘤發(fā)生率的增加密切相關(guān)。鑒于OTA的腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性和致畸性,其被世界衛(wèi)生組織定為2B類可疑人類致癌物。且OTA有很高的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,因此OTA污染問題引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。為此,很多組織都對(duì)食品及飼料中的OTA含量進(jìn)行了嚴(yán)格限定,如歐盟規(guī)定谷類等食品中OTA最高濃度為5y g/kg,國(guó)際糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑委員會(huì)暫定人每日對(duì)OTA最大耐受量為0.17ng/(kg.d)。而我國(guó)又屬于小農(nóng)戶分散型的種植模式,因此鑒于OTA的廣泛發(fā)生性,加強(qiáng)對(duì)食品及農(nóng)產(chǎn)品中OTA的檢測(cè)尤其是快速檢測(cè),對(duì)保障我國(guó)食品安全消費(fèi)具有重要意義?,F(xiàn)有的對(duì)赭曲霉毒素的檢測(cè)方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學(xué)分析法。薄層層析法對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測(cè)時(shí),不需要特殊的儀器設(shè)備,一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行,但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴(yán)重、準(zhǔn)確性差,不能準(zhǔn)確定量,且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周圍環(huán)境污染危害較大,不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。精密儀器分析法主要包括高效液相色譜法和液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用方法,其靈敏度高,準(zhǔn)確性好,但儀器昂貴,要求赭曲霉毒素A樣品的純化程度高,樣品前處理過程繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高,難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。近些年發(fā)展起來(lái)的免疫分析技術(shù)克服了前兩者的缺點(diǎn),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、 對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周圍環(huán)境的污染危害小、適于現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性的結(jié)合反應(yīng)和抗體、抗原上的標(biāo)記物的生物、物理或化學(xué)放大作用來(lái)對(duì)超微量殘留物進(jìn)行定性、定量檢測(cè),其中,抗體作為免疫反應(yīng)的核心試劑,為了建立針對(duì)抗赭曲霉毒素A的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),必須先制得靈敏度高、特異性好的抗赭曲霉毒素A的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供雜交瘤細(xì)胞株1H2、其產(chǎn)生的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株1H2,該雜交瘤細(xì)胞株已于2013年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏地址是,中國(guó),武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為CCTCCN0.C201329。其具有序列表中SEQ ID N0.1所示的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因序列和序列表中SEQ ID N0.2所示的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼基因序列。
抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,它由保藏編號(hào)為CCTCC N0.C201329的雜交瘤細(xì)胞株1H2分泌產(chǎn)生。其重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列;輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。該抗赭曲霉毒素A單克隆抗體可以識(shí)別赭曲霉毒素A,對(duì)赭曲霉毒素A的50%抑制濃度IC5tl為52pg/mL??刽髑苟舅谹單克隆抗體在赭曲霉毒素A含量測(cè)定中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株1H2是采用兩步篩選法獲得的,其具體步驟為:將BALB/c小鼠經(jīng)赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA免疫4_6次后,用2倍于前一次免疫劑量的赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA作最后一次加強(qiáng)免疫,3天后進(jìn)行細(xì)胞融合,待細(xì)胞融合后2-3周,用微量移液器將單個(gè)細(xì)胞集落移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用液體放大培養(yǎng),進(jìn)行第一次克隆,然后采用ELISA方法分兩步篩選融合細(xì)胞:第一步采用間接ELISA法篩選出抗赭曲霉毒素A而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔;第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè),用赭曲霉毒素A作為競(jìng)爭(zhēng)原,選擇吸光值和靈敏度均較高的孔,采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,亞克隆后采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè),如此重復(fù)亞克隆2-3次后,最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株1H2。本發(fā)明提供的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備方法,步驟如下:將上述獲得的雜交瘤細(xì)胞株1H2注射到預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠的腹部,收集該小鼠的腹水,純化即得抗赭曲霉毒素A單克隆抗體。按上述方案,所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法,具體步驟為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水,4°c,12000r/min離心15min以上,吸取上清,將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合,攪拌下緩慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸體積為30 35 μ L,室溫混合30 60min,4°C靜置2h以上,然后4°C,12000r/min離心30min以上,棄沉淀,將得到的上清液用雙層濾紙過濾后,加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液,用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7.4,4°C預(yù)冷,緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL,4°C靜置2h以上,然后4°C,12000r/min離心30min以上,棄上清,將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸,裝入透析袋,用純水透析,將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍,之后用冷凍干燥機(jī)凍干,收集凍干粉,即得純化好的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,將抗體置-20°C冰箱中備用;
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉,0.141mL醋酸加水定容到IOOmL所得;所述的
0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉,0.29g十二水磷酸氫二鈉,0.02g氯化鉀,磷酸二氫鉀0.02g,加水定容到IOOmL所得;所述的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉,2.9g十二水磷酸氫二鈉,0.2g氯化鉀,磷酸二氫鉀0.2g,加水定容到IOOmL所得。本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株1H2可以用于制備高效價(jià)抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得的效價(jià)可達(dá)7.2 X 105。(2)本發(fā)明提供的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體靈敏度高、特異性好,對(duì)赭曲霉毒素A的50%抑制濃度IC50為52pg/mL,與赭曲霉毒素B,黃曲霉毒素BI,B2,Gl, G2,嘔吐毒素,玉米赤霉烯酮,伏馬毒素的交叉反應(yīng)率均小于0.1 %。(3)本發(fā)明提供的 抗赭曲霉毒素A單克隆抗體可應(yīng)用于赭曲霉毒素A含量的測(cè)定。


圖1為應(yīng)用本發(fā)明提供的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體制備的赭曲霉毒素A免疫層析試紙條的正視圖。圖2為應(yīng)用本發(fā)明提供的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體制備的赭曲霉毒素A免疫層析試紙條的側(cè)視圖。圖3為實(shí)施例4中應(yīng)用本發(fā)明提供的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體制備的赭曲霉毒素A免疫層析試紙的檢測(cè)樣品的結(jié)果判定圖。
圖中:1紙板;2吸水墊;3檢測(cè)墊;4金標(biāo)墊;5樣品墊;6質(zhì)控線;7檢測(cè)線;8對(duì)照試紙條;9檢測(cè)試紙條。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株1H2的篩選
1.動(dòng)物免疫
購(gòu)買6周齡BALB/c小鼠6只,免疫市售的赭曲霉毒素A完全抗原0TA-BSA。第一次免疫將赭曲霉毒素A完全抗原與等體積的福氏完全佐劑乳化后,于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于4周后進(jìn)行,采用福氏不完全佐劑與等體積的赭曲霉毒素A完全抗原乳化,于小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔4周,免疫方式與其相同,第四次免疫于第三次免疫3周后進(jìn)行,免疫方式與第二次免疫相同,同樣為腹腔注射。4次免疫劑量相同,均為每鼠70 μ g。前3次每次免疫后8 10天,尾靜脈采血,分離血清,采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)。第4次免疫后8天,尾 靜脈采血,分離血清,采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià),并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定小鼠血清靈敏度,選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng)的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫,免疫劑量為前面的2倍。
赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。2.細(xì)胞融合
于最后一次加強(qiáng)免疫3天后,采用50% (重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450)作融合劑,按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合,具體步驟:無(wú)菌條件下殺死免疫小鼠,分離脾細(xì)胞,與鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5:1的個(gè)數(shù)比混合,用RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞,用50% PEG融合,融合I分鐘,然后緩慢加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液,離心,移去上清,小鼠脾細(xì)胞和鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0形成的融合細(xì)胞用20mL含1% HAT的細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸,將懸起的細(xì)胞加入到80mL半固體培養(yǎng)基中,混勻后加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,1.5mL/孔,置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
所述的含1% HAT的細(xì)胞完全培養(yǎng)基含有20% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清,75% (體積百分?jǐn)?shù))RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液,I % (重量百分?jǐn)?shù))L-谷氨酰胺,I % (體積百分?jǐn)?shù))HEPES,1% (體積百分?jǐn)?shù))雙抗(10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素),2% (重量百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子(HFCS)和1% (重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT ;半固體培養(yǎng)基為含I % (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))甲基纖維素的細(xì)胞完全培養(yǎng)基;RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、HEPES、雙抗和L-谷氨酰胺購(gòu)于Hyclone公司;I %次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纖維素購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。
3.細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后2-3周,細(xì)胞集落長(zhǎng)到人肉眼可見時(shí),用微量移液器將克隆從該培養(yǎng)基中吸取,移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用液體放大培養(yǎng),每孔移入I個(gè)克隆,待細(xì)胞長(zhǎng)至滿孔底1/2 2/3時(shí),吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè),即進(jìn)行抗體檢測(cè)。采用ELISA方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選,篩選分兩步進(jìn)行,第一步采用間接ELISA法篩選出抗赭曲霉毒素A而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔;第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè),用赭曲霉毒素A作為競(jìng)爭(zhēng)原,選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為O的孔即陽(yáng)性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高,靈敏度較高指抑制率為50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦即IC5tl值較小),采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,亞克隆后采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè),如此重復(fù)亞克隆2-3次后,獲得雜交瘤細(xì)胞株1H2。實(shí)施例2:抗赭曲霉毒素A單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1H2抗體可變區(qū)序列測(cè)定
(1)提取總RNA:采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株1H2的總RNA ;
(2)合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板,oligo(dT) 15為引物,按照SuperScript -2II反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈;引物oligo(dT)15由Invitrogen 購(gòu)得;
(3)PCR法克隆可變區(qū)基因:根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以cDNA為模版擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)?94°C 30s,58°C lmin、72°C lmin,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1% (重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后,用試劑盒純化回收DNA片段,連接到載體PMD18-T中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆,送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別為:重鏈可變區(qū)引物為 5,-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3,(22mer)和 5,-TGAGGAGAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’ (32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基,M = A/C,R = A/G, S = C /G, W = Α/Τ,輕鏈可變區(qū)引物為 5,-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGTGCC-3’ (24mer)和 5,-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3,(24mer)。得到的基因序列結(jié)果:重鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)353bp,序列如SEQ ID NO:1所示,根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由117個(gè)氨基酸組成,序列如SEQ ID NO:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)329bp,序列如SEQ ID N0:2所示,根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由109個(gè)氨基酸組成,序列如 SEQ ID NO:4 所示。實(shí)施例3:抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實(shí)施例1獲得的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1H2注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠,收集該小鼠的腹水,采用辛酸-硫酸銨法純化抗體,具體操作為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水,4°C,12000r/min離心15min,吸取上清,將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合,攪拌下緩慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 μ L,室溫混合30min,4°C靜置2h,然后4°C,12000r/min離心30min,棄沉淀,將得到的上清液用雙層濾紙過濾后,加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液,用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7.4,4°C預(yù)冷,緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL,4°C靜置2h,然后4°C,12000r/min離心30min,棄上清,將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.0lmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸,裝入透析袋,對(duì)純水透析,將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍,之后用冷凍干燥機(jī)凍干,收集凍干粉,即得純化好的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,將抗體置于_20°C冰箱中備用;
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉,0.141mL醋酸加水定容至IOOmL所得;所述的
0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉,2.9g十二水磷酸氫二鈉,0.2g氯化鉀,磷酸二氫鉀0.2g,加水定容到IOOmL所得;所述的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉,0.29g十二水磷酸氫二鈉,0.02g氯化鉀,磷酸二氫鉀0.02g,加水定容至IOOmL所得。用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株1H2分泌的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的亞型為IgGl。用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得注射雜交瘤細(xì)胞株1H2的BALB/c小鼠腹水抗體效價(jià)可達(dá)7.2X105,即小鼠腹水抗體稀釋7.2X IO5倍時(shí)的溶液測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。用常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定其對(duì)赭曲霉毒素A的靈敏度為52pg/mL,與赭曲霉毒素B,黃曲霉毒素BI,B2, Gl, G2,嘔吐毒素,玉米赤霉烯酮,伏馬毒素的交叉反應(yīng)率均小于0.1%。實(shí)施例4:抗體應(yīng)用
將雜交瘤細(xì)胞株1H2分泌的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體制備赭曲霉毒素A免疫層析試紙條,用于抗赭曲霉毒素A含量的檢測(cè),其具體制備方法包括以下步驟:
(1)吸水墊的制備 將吸水紙剪裁成長(zhǎng)15 20mm寬3.4mm的規(guī)格,即得吸水墊;
(2)檢測(cè)墊的制備 檢測(cè)線的包被:
將赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物OTA-BSA用包被緩沖液配制成濃度為0.4mg/mL的包被液;于距硝酸纖維素膜上沿15mm的位置,用點(diǎn)噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上,得到檢測(cè)線,每厘米檢測(cè)線所需赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物的包被量為160ng,然后于37°C條件下干燥30分鐘;
質(zhì)控線的包被:
將兔抗鼠多克隆抗體用包被緩沖液配成濃度為0.25mg/mL的包被液;于距檢測(cè)線6mm的位置,用點(diǎn)噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上,得質(zhì)控線,每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為lOOng,然后于37°C條件下干燥I小時(shí);
所述的包被緩沖液中每IOmL中含有牛血清白蛋白0.lg,氯化鈉0.08g,十二水磷酸氫二鈉0.029g,氯化鉀0.002g,磷酸二氫鉀0.002g ;
所述的硝酸纖維素膜長(zhǎng)25mm,寬3.4mm ;
(3)樣品墊的制備:
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)13mm寬3.4mm的規(guī)格,放入封閉液中浸濕,取出,于37°C條件下干燥6小時(shí),得樣品墊,然后置干燥器中室溫保存;
(4)金標(biāo)墊的制備:
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)IOmm寬3.4mm的規(guī)格,放入封閉液中浸濕,取出,于37°C條件下干燥6小時(shí),于干燥好的玻璃纖維膜上,用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體溶液橫向噴涂,每厘米噴涂長(zhǎng)度所需納米金標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體為210ng,然后真空冷凍干燥2.5h,置干燥器中室溫保存;
所述步驟(3)和(4)中的封閉液為Ig卵清白蛋白,2g鹿糖,0.02g疊氮化鈉,0.8g氯化鈉,0.29g十二水磷酸氫二鈉,0.02g氯化鉀,0.02g磷酸二氫鉀,加水定容至IOOmL所得;所述納米金標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體溶液的具體標(biāo)記方法為:量取50.0mL質(zhì)量濃度為0.01 %的納米金溶液,用400 μ L0.lmol/L碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值;在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入1.5mL0.lmg/mL的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體水溶液,繼續(xù)攪拌反應(yīng)30min ;加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為1%,繼續(xù)攪拌30min ;于4°C放置2h后,1500r/min離心15min,取上清液,棄沉淀;將上清液12000r/min離心30min,棄去上清液,加入30.0mL標(biāo)記洗漆保存液;再以12000r/min離心30min,棄去上清液,將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸,得到5.0mL濃縮物,置4°C冰箱備用,其中納米金標(biāo)記的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0.03mg/mL ;
所述納米金溶液中納米金的粒徑為15nm ;
所述0.lmol/L碳酸鉀水溶液為:13.8g碳酸鉀溶于純水定容至IOOOmL, 0.22 μ m濾膜過濾所得;所述0.lmg/mL抗赭曲霉毒素A單克隆抗體水溶液為Img抗赭曲霉毒素A單克隆抗體溶解在IOmL純水中制成;所述10%牛血清白蛋白水溶液為IOg牛血清白蛋白溶解在IOOmL純水中,0.22 μ m濾膜過濾所得;所述標(biāo)記洗滌保存液為:2.0g聚乙二醇-20000,
0.2g疊氮鈉,0.1235g硼·酸,純水定容至IOOOmL, 0.22 μ m濾膜過濾所得;
(5)試紙條的組裝:
在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊,相鄰各墊在連接處交疊連接,交疊長(zhǎng)度為I 3mm,即得赭曲霉毒素A免疫層析試紙條,見圖1和圖2。實(shí)施例5:上述赭曲霉毒素A免疫層析試紙條的應(yīng)用:
玉米樣品的處理:取20g玉米樣品用研磨機(jī)研磨,磨碎后加入80m L70% (體積分?jǐn)?shù))的甲醇水,攪拌反應(yīng)2分鐘,制得樣品混合液,并將該混合液手動(dòng)搖晃3分鐘,然后用雙層濾紙過濾,收集濾液2mL,加入4mL純水稀釋濾液,混勻,得到樣品檢測(cè)液。另取已知的赭曲霉毒素A空白玉米樣品經(jīng)同樣處理獲得空白玉米樣品檢測(cè)液。
赭曲霉毒素A試紙條檢測(cè)玉米樣品:吸取1#和2#玉米樣品檢測(cè)液各100 μ L,分別逐滴加入赭曲霉毒素A免疫層析試紙條的樣品墊,將其作為檢測(cè)試紙條;同時(shí)取IOOyL不含赭曲霉毒素A的空白玉米樣品檢測(cè)液逐滴加入另一赭曲霉毒素A免疫層析試紙條的樣品墊,將其作為對(duì)照試紙條,15分鐘后讀取結(jié)果。
檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線均均顯示出紅色條帶;1#樣品檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條,而檢測(cè)線不顯色,由此判定其為陽(yáng)性結(jié)果,且待測(cè)樣品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于2ng/mL,見圖3_1,再經(jīng)換算得1#玉米樣品中赭曲霉毒素A的含量等于或高于24ng/g。
2#樣品檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條,而檢測(cè)線顏色比對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色淺,由此判定:其陽(yáng)性結(jié)果,且待測(cè)樣品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于0.5ng/mL,并小于2ng/mL,見圖3_2,再經(jīng)換算得2#玉米樣品中赭曲霉毒素A含量等于或高于6ng/g,并小于24ng/g。
權(quán)利要求
1.雜交瘤細(xì)胞株1H2,其特征在于:它保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC N0.C201329。
2.抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,其特征在于:它由保藏編號(hào)為CCTCCN0.C201329的雜交瘤細(xì)胞株1H2分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體在赭曲霉毒素A含量測(cè)定中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備方法,其特征在于:將權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞株1H2注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠,收集該小鼠的腹水,純化即得抗赭曲霉毒素A單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備方法,其特征在于:所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法,具體步驟為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水,4°C,12000r/min離心15min以上,吸取上清,將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合,攪拌下緩慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸體積為30 35 μ L,室溫混合30 60min,4°C靜置2h以上,然后4°C,12000r/min離心30min以上,棄沉淀,將得到的上清液用雙層濾紙過濾后,加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液,用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的PH值至7.4,4°C預(yù)冷,緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為.0.277g/mL, 4°C靜置2h以上,然后4°C,12000r/min離心30min以上,棄上清,將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸,裝入透析袋,用純水透析,將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍,之后用冷凍干燥機(jī)凍干,收集凍干粉,即得純化好的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,將抗體置_20°C冰箱中備用; 所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉,0.141mL醋酸加水定容到100mL所得;所述的.0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉,0.29g十二水磷酸氫二鈉,0.02g氯化鉀,磷酸二氫鉀0.02g,加水定容到100mL所得;所述的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉,2.9g十二水磷酸氫二鈉,0.2g氯化鉀,磷酸二氫鉀0.2g,加水定容到100mL所得。
全文摘要
本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株1H2、其產(chǎn)生的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體及其在免疫層析時(shí)中應(yīng)用。雜交瘤細(xì)胞株1H2,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC NO.C201329。雜交瘤細(xì)胞株1H2可以用于制備高效價(jià)抗赭曲霉毒素A單克隆抗體,采用鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得的效價(jià)可達(dá)7.2×105。該抗赭曲霉毒素A單克隆抗體靈敏度高,對(duì)赭曲霉毒素A的50%抑制濃度IC50為52pg/mL,與赭曲霉毒素B,黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,嘔吐毒素,玉米赤霉烯酮,伏馬毒素的交叉反應(yīng)率均小于0.1%,可用于赭曲霉毒素A含量的快速測(cè)定。
文檔編號(hào)C12R1/91GK103215231SQ20131011592
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者李培武, 李鑫, 張奇, 何婷, 丁小霞, 張文, 李冉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
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