專利名稱：一種制備固定化脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備固定化脂肪酶的方法，具體涉及利用耦合固定化技術(shù)即吸附、交聯(lián)及包埋三種結(jié)合的方法對脂肪酶進(jìn)行固定化的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶(Lipase E13.1,1.3)是水解脂肪的酶，它可以水解天然油脂，產(chǎn)生脂肪酸及甘油的酶。由于脂肪酶水解脂肪具有高效、反應(yīng)條件溫和、無毒等優(yōu)點，并在洗滌劑、制革、食品、紡織及輕工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的用途。作為一種新型的酶制劑，脂肪酶已成為世界酶制劑市場上重要的品種。液體的脂肪酶水解油脂存在與底物接觸不充分導(dǎo)致水解不完全，反應(yīng)時間長，同時使用后的脂肪酶不能回收利用，增加使用成本。酶的固定化技術(shù)有利于酶的回收和再利用，減少酶的損耗，為生產(chǎn)節(jié)約成本。迄今為止開發(fā)的固定化技術(shù)不能普遍適用于每一種酶，所以要要根據(jù)酶的應(yīng)用目的和特性，開發(fā)固定化方法。脂肪酶的固定化方法有吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等4種方法，廣泛使用的固定化方法為吸附的方法。專利EP424130利用乙醇預(yù)處理疏水載體后進(jìn)行脂肪酶的吸附得到的固定化酶活性及穩(wěn)定性較高。專利US5156963利用聚甲基丙烯酸樹脂進(jìn)行吸附，用于轉(zhuǎn)酯，酯化，酯水解但反應(yīng)時間長(8h以上)。 專利US5182201將脂肪酶吸附于弱酸離子交換樹脂，添加卵磷脂增加活性。固定化酶的半衰期為36-126h。專利US5342768利用大孔無機載體顆粒(含有至少60%硅)進(jìn)行吸附，用于轉(zhuǎn)酯，酯化，酯水解，但是并未達(dá)到90%以上的轉(zhuǎn)化率。專利US5773266對比了表面活性劑對脂肪酶固定于疏水載體的影響，用于酯水解或者酯化，但活性不高。專利US5908769將脂肪酶固定于丙烯酸樹脂，能夠使短鏈醇與短鏈酸進(jìn)行反應(yīng)。專利US6605452將脂肪酶表面包埋表面活性劑固定于不溶性載體上，具有較高的酯化，轉(zhuǎn)酯及內(nèi)部酯交換，重復(fù)5次，活性損失。專利US7238504將脂肪酶通過吸附固定于載體，利用油脂調(diào)整固定化酶的含水量，處理時間較長(18-24h)，酯化活力比冷凍干燥得到的固定化酶高。達(dá)到DG+TG=70%需要7h0專利CN101280297A在脂肪酶液里加入印記分子(脂肪酸或者類似物)吸附于大孔樹脂上后，冷凍干燥后，利用界面激活技術(shù)處理，再次冷凍干燥，獲得固定化脂肪酶應(yīng)用于生物柴油的制備，反應(yīng)時間比較長。專利CN101712951A將脂肪酶吸附于大孔離子交換樹脂，用于轉(zhuǎn)化阿魏酸酯，但是反應(yīng)時間比較長達(dá)6-8天。專利101736000A利用有機化合物處理固定化酶，提高固定化酶的穩(wěn)定性，半衰期延長3-8h，催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長使用3-6批。專利CN101278047A將脂肪酶、多官能胺和交聯(lián)劑吸附在粒狀多孔載體上來對脂肪酶進(jìn)行固定化，未提到固定化酶的循環(huán)利用率。通過以上專利對比分析可以看出，通過吸附法得到的固定化脂肪酶活性、穩(wěn)定性及半衰期明顯比游離脂肪酶提高，但是固定化后脂肪酶易從載體上脫落，循環(huán)利用率不高，半衰期較短，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。少數(shù)采用其他的方法進(jìn)行固定化，例如，專利US5445955通過多種方式將脂肪酶吸附于多孔載體，體系存在脂肪酸或者脂肪酸衍生物中進(jìn)行固定化，經(jīng)實驗驗證利用環(huán)氧基對脂肪酶進(jìn)行固定化后脂肪酶的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)活性最高；US5569594將脂肪酶通過環(huán)氧基或者叔胺基固定于載體上，轉(zhuǎn)酯率24h達(dá)到99.8%。通過共價結(jié)合的方式雖然能夠提高轉(zhuǎn)酯活力，但是反應(yīng)時間比較長，并且固定化酶制備成本比較昂貴，這也限制了固定化酶的工業(yè)應(yīng)用。專利US5387514是將脂肪酶固定于疏水載體，后用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，得到的固定化酶能夠?qū)σ掖歼M(jìn)行?；饔茫?天轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%。專利US5232843將脂肪酶固定于疏水或者離子交換樹脂，后用酪蛋白酸鈉進(jìn)行包埋，得到的固定化酶酯化與酯交換反應(yīng)活性比較高，但是需要反應(yīng)2-5天。雖然耦合技術(shù)的應(yīng)用可以克服單一固定化技術(shù)的缺點，但是還是需要將其有機的結(jié)合起來，才能發(fā)揮各種固定化技術(shù)的優(yōu)勢，得到適合工業(yè)化的固定化脂肪酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 目的是提供一種用于脂肪酶的工業(yè)固定化的簡單有效的方法。本發(fā)明的方法通過有機結(jié)合吸附、交聯(lián)與包埋的三種方法制備固定化脂肪酶，其與已知的固定化方法獲得的固定化酶產(chǎn)物相比穩(wěn)定性更高，應(yīng)用性更好，適合工業(yè)生產(chǎn)用。本發(fā)明的固定化脂肪酶的制備方法，包括如下步驟:a)制備含脂肪酶、水溶性蛋白和糖類的液體介質(zhì)A，其中按IOOg液體介質(zhì)A來計脂肪酶:水溶性蛋白:糖類的比例為100000-500000U:0-0.2g:0.01-0.5g ；b)制備含交聯(lián)劑的液體介質(zhì)B，其中交聯(lián)劑的質(zhì)量百分含量為0.1-1.5% ；c)制備含包埋劑的液體介質(zhì)C，其中包埋劑的質(zhì)量百分含量為0.01-0.1% ；d)將液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B引入至經(jīng)預(yù)處理的粒狀多孔載體上，過濾除去液體，得固體產(chǎn)物；e)將液體介質(zhì)C引入至d)的固體產(chǎn)物中，過濾除去液體，剩余物經(jīng)干燥后得固定化脂肪酶；所述步驟d)中液體介質(zhì)A:液體介質(zhì)B:粒狀多孔載體的質(zhì)量比優(yōu)選為8-10:1:1，更優(yōu)選為10:1:1，液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B的引入順序為任意或同時；所述步驟e)中按質(zhì)量比液體介質(zhì)C:固體產(chǎn)物的質(zhì)量比優(yōu)選為2-5:1，更優(yōu)選為5:1 ；所述液體介質(zhì)A、液體介質(zhì)B、液體介質(zhì)C是水溶液。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述脂肪酶優(yōu)選來源于南極假絲酵母(C.Antarctica)、產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)、曼赫根毛霉(R.miehei)。
本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述水溶性蛋白質(zhì)優(yōu)選為牛血白蛋白、乳清蛋白、酪蛋白酸鈉、明膠中的一種。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述糖類優(yōu)選為葡萄糖、果糖、海藻糖、半乳糖、蔗糖中的一種。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述交聯(lián)劑優(yōu)選為聚乙烯亞胺，碳化二亞胺、聚丙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、對苯二醛中的一種。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述包埋劑優(yōu)選為阿拉伯膠、海藻酸鈣、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸鈉和明膠中的一種。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述粒狀多孔載體的粒徑為50-1000um，更優(yōu)選150-650um，更優(yōu)選 300_650um ;顆粒孔徑為 lOnm-lum，優(yōu)選為 50_200nm。所述粒狀多孔載體可以為無機或者有機材料的載體，優(yōu)選高分子有機合成材料，更優(yōu)選為樹脂類高分子材料，其中優(yōu)選Amberlite XAD761、Amberlite XAD7HP、AmberliteXAD16、Amberlite XA D1600、ES_1 環(huán)氧樹脂。本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟d)中所述的液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B的引入方法為:在連續(xù)混合器中加入粒狀多孔載體，再加入步驟液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B，在20-300C，50-120rpm，攪拌6_24小時，過濾除去液體即可；步驟e)中所述的液體介質(zhì)C的引入方法為:將液體介質(zhì)C加入到所述步驟d)得到的固體產(chǎn)物中，在20-30°C，50-120rpm,攪拌2-10小時，過濾除去液體即可。本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟e)所述的干燥方法為室溫干燥或者在10_50°C烘箱干燥，干燥至剩余物含水量為5-10%。本發(fā)明的制備方法中，將含脂肪酶、水溶性蛋白以及糖類化合物的液體介質(zhì)吸附于載體，使水溶性蛋白替代脂肪酶吸附于載體，以此節(jié)省脂肪酶固定化的成本，糖類化合物通過分子間作用力增加了酶分子空間結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，制備得到的固定化脂肪酶經(jīng)干燥后酶活性沒有損失，增加重復(fù)回收使用的次數(shù)，減少了以往的方法中冷凍干燥帶來的高成本；在交聯(lián)劑存在下進(jìn)行脂肪酶的吸附(吸附于載體)，使得交聯(lián)劑中的醛基或者亞胺基一方面與脂肪酶的氨基結(jié)合，另一方面與載體中的基團發(fā)生反應(yīng)，這樣交聯(lián)劑將脂肪酶連接至載體上，不易脫落，再加入適當(dāng)濃度的包埋劑，使吸附的脂肪酶更緊密的結(jié)合于載體上，使其不易泄露，增加酶活性，提高重復(fù)使用次數(shù)。通過本發(fā)明方法制備得到的固定化酶比現(xiàn)有的固定化酶具備更高的穩(wěn)定性及工藝?yán)脙r值。本發(fā)明中，所述液體介質(zhì)的pH為4-11。本發(fā)明中，在含有脂肪酶的液體介質(zhì)中所述的脂肪酶，可以通過純化產(chǎn)脂肪酶的上述菌株的培養(yǎng)液得到的濃縮液，也可以為溶于水性介質(zhì)的比較純的脂肪酶。在本發(fā)明的具體實施方式
中，載體中液體介質(zhì)的引入方法具體為:可以在加入含交聯(lián)劑的液體介質(zhì)之前，將含脂肪酶、水溶性蛋白和糖類的液體介質(zhì)加入至粒狀多孔載體；也可以先將含交聯(lián)劑的液體介質(zhì)加入至粒狀多孔載體中，然后加入含脂肪酶、水溶性蛋白和糖類的液體介質(zhì)；也可以將兩種液體介質(zhì)同時加入至粒狀多孔載體中。在本發(fā)明的具體實施方式
中，粒狀多孔載體在使用之前需要進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方法不予特別限定，可以根據(jù)載體所附的說明書或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和公知常識選擇能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明技術(shù)效果的現(xiàn)有技術(shù)中的任何處理方法對載體進(jìn)行預(yù)處理。
本發(fā)明的另一個目的是提供用上述方法制備的固定化脂肪酶。本發(fā)明的方法制備的固定化脂肪酶，穩(wěn)定性高，可以多次重復(fù)使用，降低成本，具有很高的工業(yè)利用價值，實驗表明本發(fā)明的固定化脂肪酶，在共軛亞油酸甲酯的水解反應(yīng)中，重復(fù)回收次數(shù)為100次時，其水解率也高達(dá)90%。本發(fā)明的又一目的是提供用上述方法制備的固定化脂肪酶在脂肪酸酯的酯水解反應(yīng)或游離脂肪酸的酯化反應(yīng)中的應(yīng)用。其中所述脂肪酸酯可以為脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸三甘酯。本發(fā)明的有益效果:①本發(fā)明的固定化脂肪酶的制備方法采用有機結(jié)合吸附、交聯(lián)及包埋三種固定化方法，得到的固定化脂肪酶與其它的只用到其中一種或者兩種的固定化技術(shù)相比，酶的重復(fù)循環(huán)利用率及酶活性均大幅提高。②本發(fā)明利用價格低廉的水溶性蛋白吸附于載體，部分替代脂肪酶，使得固定化成本大大降低，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。③本發(fā)明在制備在酶液中添加糖類物質(zhì)，通過分子間作用力增加酶分子空間結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，制備得到的固定化脂肪酶干燥后活性沒有損失，減少了冷凍干燥帶來的高成本。
④本發(fā)明的方法制備的固定化脂肪酶，可以用于有機化合物的酯化反應(yīng)或酯水解反應(yīng)，酯化及酯水解的效率可以達(dá)到90%以上，反應(yīng)時間縮短，重復(fù)利用率達(dá)到100次以上，酶活降低< 5%，具有很高的工業(yè)應(yīng)用的前景。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1(I)稱取IOg大孔離子交換樹脂(Amberlite XAD761)，加入IOml無水乙醇浸泡2h，過濾棄去無水乙醇，用純凈水沖洗凈樹脂中殘留的無水乙醇，得活化大孔離子交換樹脂(含水量70%)；(2)將來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)的液體脂肪酶(10000U/g) 20g,加入2.7g磷酸氫二鉀、攪拌溶解至完全，用10%的NaOH水溶液調(diào)pH至8.0 ±0.5，用純凈水稀釋至100g，后加入IOOmg葡萄糖，攪拌溶解，得脂肪酶酶液；(3) 1%的交聯(lián)劑配制:10ml戊二醛溶液(50%)加純凈水稀釋至500ml ；(4)連續(xù)混合器中加入步驟(I)得到的溶劑處理大孔樹脂10g、在步驟(3)得到的1%交聯(lián)劑溶液IOml與在步驟(2)得到的脂肪酶酶液IOOg,在25°C、120rpm下攪拌12h，過濾，棄去濾液，得到固體產(chǎn)物；(5)在步驟(4)得到的固體產(chǎn)物中加入50ml0.1%聚乙烯醇水溶液，在25°C、120rpm下攪拌2h，過濾，棄去濾液，剩余物在室溫晾干6小時至含水量為5%，得固定化脂肪酶。采用聚乙烯醇-橄欖油乳化法(參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T23535-2009中所述的方法)測定上述制備的固定化脂肪酶的活力，經(jīng)計算得到制備得到的固定化脂肪酶在干燥前后的酶活力無損失，具體酶活力為9000U/g，游離脂肪酶對橄欖油水解的最適溫度為40°C，固定化后對橄欖油水解的最適溫度提高到60°C，最適pH與游離脂肪酶酶同為9.4。實施例2( I)按照實施例1步驟(I)的方法得到活化大孔離子交換樹脂；(2)將來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)的液體脂肪酶(10000U/g) 10g,加入0.02%的酪蛋白酸鈉蛋白水溶液10g，攪拌均勻，加入2.7g磷酸氫二鉀、攪拌溶解至完全，用10%的NaOH水溶液調(diào)pH至8.0 ±0.5，用純凈水稀釋至100g，加入IOOmg葡萄糖，攪拌溶解，得脂肪酶酶液；(3) 1%的交聯(lián)劑:10ml甲醛溶液(50%)加純凈水稀釋至500ml。(4)連續(xù)混合器中加入步驟(I)得到的溶劑處理大孔樹脂10g、在步驟(3)得到的0.1%交聯(lián)劑溶液IOml與在步驟(2)得到的脂肪酶酶液IOOg,在25°C、120rpm下攪拌12h，過濾，棄去濾液，得固體產(chǎn)物；(5)在步驟(4)得到的固體產(chǎn)物中加入50ml0.1%酪蛋白酸鈉水溶液，在25°C、120rpm下攪拌2h，過濾，棄去濾液，剩余物在室溫晾干6小時至含水量為5%，得固定化脂肪
酶。 用實施例1所述聚乙烯醇-橄欖油乳化法測定所述方法制備的固定化脂肪酶的酶活力:固定化脂肪酶活力為9000U/g，游離脂肪酶對橄欖油水解的最適溫度為40°C，固定化后對橄欖油水解的最適溫度提高到60°C，最適pH與游離脂肪酶同為9.4。實施例3(I)離子交換樹脂(Amberlite XAD7HP)的處理方式同實施例1。(2)將來自南極假絲酵母(C.Antarctica)的液體脂肪酶(10000U/g) 10g,加入
0.02%的牛血清白蛋白水溶液10g，攪拌均勻，加入2.7g磷酸氫二鉀、攪拌溶解至完全，用10%的NaOH水溶液調(diào)pH至8.0 ±0.5，用純凈水稀釋至100g，加入IOOmg海藻糖，攪拌溶解，得脂肪酶酶液；(3) 1%的交聯(lián)劑溶液:10g聚碳化二亞胺溶液(50%)加純凈水稀釋至500ml ；(4)連續(xù)混合器中加入步驟(I)得到的活化離子交換樹脂10g、在步驟(3)得到的1%交聯(lián)劑溶液IOml與在步驟(2)得到的脂肪酶酶液IOOg,在25°C、120rpm下攪拌12h，過濾，棄去濾液，得固體產(chǎn)物；(5)在步驟(4)得到的固體產(chǎn)物中加IOOml0.3%聚乙烯醇水溶液，在25°C、120rpm下攪拌2h，過濾，棄去濾液，剩余物在室溫晾干6小時至含水量為5%，得固定化脂肪酶。用實施例1所述聚乙烯醇-橄欖油乳化法測定所述方法制備的固定化脂肪酶的酶活力:固定化脂肪酶酶活力為10053U/g，游離脂肪酶對橄欖油水解的最適溫度為40°C，固定化后對橄欖油水解的最適溫度提高到60°C，最適pH與游離酶同為9.4。實施例4(I)按照實施例3的固定化脂肪酶制備步驟(I) - (4)的方法得到固體產(chǎn)物；(2)在固體產(chǎn)物中加入1%阿拉伯膠水溶100ml，在25°C、120rpm下攪拌2h，過濾，棄去濾液，剩余物在室溫晾干6小時至含水量為5%，得固定化脂肪酶。用實施例1所述聚乙烯醇-橄欖油乳化法測定所述方法制備的固定化脂肪酶的酶活力:固定化脂肪酶酶活力為11202U/g，游離脂肪酶對橄欖油水解的最適溫度為40°C，固定化后對橄欖油水解的最適溫度提高到60°C，最適pH與游離酶同為9.4。
實施例5利用實施例1、2、3或4制備得到的固定化脂肪酶，水解共軛亞油酸(CLA)甲酯，并測定CLA甲酯的水解率，具體方法為:稱取0.5g固定化脂肪酶，添加入裝有5g CLA甲酯(大連醫(yī)諾生物有限公司生產(chǎn))和20g水混合底物的反應(yīng)瓶中，在50°C下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)4h，負(fù)壓為0.95Mpa ;反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)終產(chǎn)物在3000rpm離心20min，測定油脂層的酸值，計算CLA甲酯的水解率，結(jié)果如表I。所述油脂層酸值的計算方法參見國標(biāo)GB/T5530-2005所述的方法，CLA甲酯水解率計算公式為:酸值/2%。固定化脂肪酶的反復(fù)回收使用及回收脂肪酶對CLA甲酯水解率的影響:用如下方法回收上述CLA甲酯水解終產(chǎn)物中的固定化脂肪酶，并按照上述方法水解CLA甲酯，測定CLA甲酯的水解率，結(jié)果如表2。CLA甲酯水解終產(chǎn)物中的固定化脂肪酶的回收方法:水解反應(yīng)結(jié)束后，利用200目的濾網(wǎng)過濾掉反應(yīng)瓶中的油脂與水混合物，得到固體產(chǎn)物；固體產(chǎn)物用IOOml無水乙醇進(jìn)行浸泡20min，過濾掉無水乙醇后，室溫進(jìn)行干燥得到干燥回收固定化脂肪酶。表I固定化脂肪酶對CLA甲酯水解率的影響
權(quán)利要求
1.一種制備固定化脂肪酶的方法，其特征在于包括如下步驟: a)制備含脂肪酶、水溶性蛋白和糖類的液體介質(zhì)A，其中按IOOg液體介質(zhì)A來計脂肪酶:水溶性蛋白:糖類的比例為100000-500000U:0-0.2g:0.01-0.5g ； b)制備含交聯(lián)劑的液體介質(zhì)B，其中交聯(lián)劑的質(zhì)量百分含量為0.1-1.5% ； c)制備含包埋劑的液體介質(zhì)C，其中包埋劑的質(zhì)量百分含量為0.01-0.1% ； d)將液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B引入至經(jīng)預(yù)處理的粒狀多孔載體上，過濾除去液體，得固體產(chǎn)物； e)將液體介質(zhì)C引入至d)的固體產(chǎn)物中，過濾除去液體，剩余物經(jīng)干燥后得固定化脂肪酶； 所述步驟d)中按質(zhì)量比液體介質(zhì)A:液體介質(zhì)B:粒狀多孔載體=8-10:1: 1，液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B的引入順序 為任意或同時； 所述步驟e)中按質(zhì)量比液體介質(zhì)C:固體產(chǎn)物的=2-5:1 ； 所述液體介質(zhì)A、液體介質(zhì)B、液體介質(zhì)C為水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述脂肪酶來源于南極假絲酵母(C.Antarctica)、產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)、曼赫根毛霉(R.miehei);所述水溶性蛋白為牛血白蛋白、乳清蛋白、酪蛋白酸鈉、明膠中的一種；所述糖類為葡萄糖、果糖、海藻糖、半乳糖、蔗糖中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述交聯(lián)劑為聚乙烯亞胺，碳化二亞胺、聚丙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、對苯二醛中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述包埋劑為阿拉伯膠、海藻酸鈣、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸鈉和明膠中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述粒狀多孔載體的粒徑為50-1000um，顆?？讖綖镮 Onm-1 um。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述粒狀多孔載體選自AmberliteXAD761、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、ES_1 環(huán)氧樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d)中所述的液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B的引入方法為:在連續(xù)混合器中加入粒狀多孔載體，再加入步驟液體介質(zhì)A和液體介質(zhì)B，在20-30°C，50-120rpm，攪拌6-24小時，過濾除去液體即可；步驟e)中所述的液體介質(zhì)C的引入方法為:將液體介質(zhì)C加入到所述步驟d)得到的固體產(chǎn)物中，在20-30°C，50-120rpm,攪拌2-10小時，過濾除去液體即可。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟e)所述的干燥方法為室溫干燥或者在10-50°C烘箱干燥，干燥至含水量為5-10%。
9.權(quán)利要求1-8的任一項所述的方法制備的固定化脂肪酶。
10.權(quán)利要求9所述的固定化脂肪酶在脂肪酸酯的酯水解反應(yīng)或游離脂肪酸的酯化反應(yīng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備固定化脂肪酶的方法。該方法，利用耦合固定化技術(shù)即吸附、交聯(lián)及包埋三種結(jié)合的方法對脂肪酶進(jìn)行固定化。耦合技術(shù)的應(yīng)用，克服了吸附法帶來的脂肪酶易脫落，循環(huán)利用率差的缺點，具備交聯(lián)法的高結(jié)合力及包埋法的高酶活回收的優(yōu)點，使得結(jié)合于載體的脂肪酶牢牢地固定化于載體，提高重復(fù)循環(huán)利用率及酶活性。本工藝制備的固定化酶用于酯化，轉(zhuǎn)酯，酯水解，不但轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90%以上，反應(yīng)時間縮短，重復(fù)利用率達(dá)到100次以上，酶活降低≤5%，具有工業(yè)應(yīng)用的前景。
文檔編號C12N11/04GK103224926SQ201310116628
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者吳文忠, 楊大蘋, 伏萃翠 申請人:大連醫(yī)諾生物有限公司