專利名稱：用改變?yōu)躅^酸酶調(diào)控元件的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸的方法及其衍生的方法和應(yīng)用，和可以用在這些方法和應(yīng)用中的細(xì)菌等。
背景技術(shù)：
通過產(chǎn)1-蘇氨酸的細(xì)菌(如，埃希氏菌屬的大腸桿菌和棒桿菌屬的桿狀細(xì)菌)發(fā)酵來生產(chǎn)1-蘇氨酸已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。這些細(xì)菌，可以是從自然界分離的細(xì)菌，也可以是通過誘變或基因工程改造獲得的細(xì)菌，或者兩者兼而有之。當(dāng)前的文獻(xiàn)報(bào)道中，通過基因工程改造的注意力主要集中在Α 7/Λ MrTP等基因上(參見中國(guó)專利94102007和99121353等)，未見為了 L-蘇氨酸生產(chǎn)而關(guān)注烏頭酸酶(如，烏頭酸酶A)及其編碼基因。烏頭酸酶是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)酶，該酶催化兩步化學(xué)反應(yīng)，分別為檸檬酸轉(zhuǎn)化為烏頭酸以及烏頭酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因(其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)編碼烏頭酸酶A，但是可能是由于其代謝距離最終的1-蘇氨酸產(chǎn)物太遠(yuǎn)，中間代謝分支太多且復(fù)雜，而在1-蘇氨酸發(fā)酵中一直未引起人們的重視。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究和實(shí)踐，尤其憑借了一些運(yùn)氣，偶然發(fā)現(xiàn)acW基因的調(diào)控元件的改造能夠有助于提高1-蘇氨酸的產(chǎn)量；然而，現(xiàn)有技術(shù)要么通過增加拷貝和/或定點(diǎn)突變導(dǎo)入表達(dá)量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通過敲除不利的基因以使之酶活性和/或表達(dá)量消失，但是與之不同的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基因的調(diào)控元件不能簡(jiǎn)單地提高或敲除，尤其是敲除后基因的不表達(dá)使得細(xì)菌生長(zhǎng)困難，難以實(shí)際應(yīng)用，因此開發(fā)了新的針對(duì)acW基因的調(diào)控元件的方法，以此來提高1-蘇氨酸的產(chǎn)量，而且該方法與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌的染色體改造位點(diǎn)沒有沖突，可以疊加提高的效果，從而在實(shí)踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸的方法及其相關(guān)的方法，包括相對(duì)于未改造細(xì)菌提高1-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的方法，改造的細(xì)菌在發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸中的應(yīng)用，改造的細(xì)菌在相對(duì)于未改造細(xì)菌提高1-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的應(yīng)用，和/或，改造細(xì)菌的方法等。另外，本發(fā)明還提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、載體和/或細(xì)菌等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸的方法，其包括:
(O改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失；和，
(2)用步驟(1)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸。在本文中，術(shù)語“改造”指的是是相應(yīng)被改造的對(duì)象發(fā)生變化，從而達(dá)到一定的效果。改造位于染色體上的調(diào)控元件的頻度遠(yuǎn)小于改造位于染色體上的基因的頻度，但是兩者進(jìn)行改造的技術(shù)手段基本一致，包括但是不限于，誘變、定點(diǎn)突變、和/或同源重組，優(yōu)選是后兩者。這些技術(shù)手段廣泛記載于分子生物學(xué)和微生物學(xué)文獻(xiàn)中，有許多甚至已經(jīng)商品化了。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，根據(jù)同源重組的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV質(zhì)粒系統(tǒng)來進(jìn)行改造，將未改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，改造成能夠使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失的新的調(diào)控元件。因此，在本文文中，優(yōu)選改造是通過同源重組進(jìn)行的改造。本發(fā)明人經(jīng) 過長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，使得acW基因所編碼的烏頭酸酶A的表達(dá)量消失，將造成細(xì)菌本身生長(zhǎng)困難，甚至無法生長(zhǎng)/繁殖。因此，本發(fā)明的“改造”要相對(duì)于未改造的細(xì)菌，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失，優(yōu)選使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低20% 95%，更優(yōu)選降低50% 90%，如降低65%、70%或80%。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了其他應(yīng)用或方法。例如，在第二方面，本發(fā)明提供了提高1-蘇氨酸的發(fā)酵量的方法，其包括:
(1)改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失；和，
(2)用步驟(I)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生1-蘇氨酸。1-蘇氨酸作為細(xì)菌的重要代謝產(chǎn)物，大多數(shù)細(xì)菌或多或少都能夠發(fā)酵產(chǎn)生一定量的1-蘇氨酸。盡管低產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌不適合有經(jīng)濟(jì)效益地生產(chǎn)1-蘇氨酸，但是通過本發(fā)明的方法，仍舊能提高1-蘇氨酸的發(fā)酵量，仍舊可以供對(duì)經(jīng)濟(jì)效益不敏感的地方使用。當(dāng)然，在本文中，優(yōu)選細(xì)菌是高產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌。通過本發(fā)明的方法，可以進(jìn)一步提高其產(chǎn)量。另外，在本發(fā)明的方法或應(yīng)用中，除了改造細(xì)菌染色體上基因的野生型的調(diào)控元件以外，可以不再進(jìn)行其他改造，如甚至可以不改造細(xì)菌染色體上的野生型的基因。例如，尤其對(duì)于高產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌來說，僅僅改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件。又如，在第三方面，本發(fā)明提供了改造獲得的細(xì)菌在發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸中的應(yīng)用，其中，所述改造獲得是改造細(xì)菌染色體上基因的野生型的調(diào)控元件而獲得，而且使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失。改造獲得的細(xì)菌可以單獨(dú)應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸中，也可以和其他產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌混合發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸，或者以其他方式應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸中。在本文中，如無特別限定(如未以“改造獲得”來限定)，術(shù)語“細(xì)菌”是未改造或改造前的細(xì)菌，其染色體的acW基因座位前后的調(diào)控元件是野生型的調(diào)控元件。優(yōu)選本文中，細(xì)菌是產(chǎn)蘇氨酸的細(xì)菌，如產(chǎn)蘇氨酸超過0.5g/L的細(xì)菌。還如，在第四方面，本發(fā)明提供了改造獲得的細(xì)菌在提高1-蘇氨酸的發(fā)酵量的應(yīng)用，其中，所述改造獲得是改造細(xì)菌染色體上基因的野生型的調(diào)控元件而獲得，而且使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失。在本文中，細(xì)菌優(yōu)選是埃希氏菌屬細(xì)菌，更優(yōu)選是大腸桿菌。由于現(xiàn)有技術(shù)幾乎沒有在1-蘇氨酸生產(chǎn)/發(fā)酵中關(guān)注過細(xì)菌的acnA基因的調(diào)控元件，改造的染色體的基因大多集中于其他基因位點(diǎn)上，甚至都不關(guān)注調(diào)控元件，因此現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)菌(尤其是埃希氏菌屬細(xì)菌，如大腸桿菌)的基因前后沒有被報(bào)道不帶有野生型的調(diào)控元件。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，無論高產(chǎn)還是低產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌，只要帶有acW基因的野生型的調(diào)控元件，通過本發(fā)明的方法進(jìn)行改造，就能使得L-蘇氨酸的發(fā)酵量得到提高。更本質(zhì)地，在第五方面，本發(fā)明提供了改造細(xì)菌的方法，其包括改造所述細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失。本發(fā)明第五方面的方法改造而獲得的細(xì)菌能夠用于發(fā)酵生產(chǎn)或產(chǎn)生L-蘇氨酸。因此，在第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第五方面的方法改造而獲得的細(xì)菌。野生型的調(diào)控元件可以是基因上游的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或啟動(dòng)子區(qū)域序列，也可以是基因下游與表達(dá)調(diào)控相關(guān)的序列。優(yōu)選地，在本文中，所述野生型的調(diào)控元件是野生型的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述野生型的啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示，其被替換后提高L-蘇氨酸的發(fā)酵量被證實(shí)。經(jīng)過本發(fā)明人研究和證實(shí)，更優(yōu)選地，在本文中，所述改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件是將染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件替換為弱轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，優(yōu)選替換為弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。所以，優(yōu)選本發(fā)明第六方面的產(chǎn)蘇氨酸細(xì)菌，其不包含如SEQ ID No:1所示的野生型的啟動(dòng)子的核苷酸序列。更優(yōu)選本發(fā)明第六方面的產(chǎn)蘇氨酸細(xì)菌，其包含以下第七方面的多核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了可以用于上述方法中的多核苷酸和/或載體等物質(zhì)。例如，在第七方面，本發(fā)明提供了多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。又如，在第八方面，本發(fā)明提供了載體，其包含本發(fā)明第七方面的多核苷酸。本發(fā)明的有益效果在于，開辟并且實(shí)踐證明了新的提高L-蘇氨酸的發(fā)酵量的方式，對(duì)于高產(chǎn)和低產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌都適用，而且與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌的染色體改造位點(diǎn)沒有沖突，觀察到了可以`疊加提高產(chǎn)量的效果，從而在實(shí)踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸，便于推廣應(yīng)用。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。構(gòu)建實(shí)施例用轉(zhuǎn)錄活性較弱的啟動(dòng)子替換acW的啟動(dòng)子
通過對(duì)疋coli K12 W3110中acW上游序列分析，我們?cè)O(shè)計(jì)了弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(序列如SEQ ID No:2所示)并委托中科院微生物所合成并構(gòu)建入pMD-19T質(zhì)粒(可購(gòu)自大連寶生物公司)中，來替換acW基因ORF上游196bp的野生型的啟動(dòng)子區(qū)域(序列如SEQ ID No:1所示)，以減弱野生型acW基因的強(qiáng)度。具體而言，以抽提的野生型大腸桿菌疋coli K12 W3110基因組染色體為模板，以引物Pl和P2、P3和P4分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度分別為486 bp和619 bp的兩條DNA片段(分別命名為Up2和Down2片段)。以含有上述弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的pMD_19T質(zhì)粒，以P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為161 bp的弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子片段(命名為P片段)。其中，PCR按如下方式進(jìn)行:94°C變性30 s (秒)，52°C退火30 s (秒)，以及72°C延伸30 s (秒)(30個(gè)循環(huán))。將上述三條D N A片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，再以上述Up2和P片段混合為模板，以Pl和P6為引物，通過Overlap PCR擴(kuò)增長(zhǎng)約622bp的片段(命名為Up-P片段)。其中，PCR按如下方式進(jìn)行:94°C變性30s (秒)，52°C退火30 s (秒)，以及72°C延伸60 s (秒)(30個(gè)循環(huán))。將瓊脂糖凝膠電泳分離純化后的Up-P和Down2片段為模板，以Pl和P4為引物，通過Overlap PCR擴(kuò)增長(zhǎng)約1240bp的片段(命名為Up-P-down片段)。其中，PCR按如下方式進(jìn)行:94°C變性30 s (秒)，52°C退火30 s (秒)，以及72°C延伸60 s (秒)(30個(gè)循環(huán))。上述所用的引物序列如下:
Pl: 5’ -CGCGGATCCGTGATGGCGATTATATGAGG-3，
P2:5 ’ -GGTTTCTTAGACGTCGGATTGAGAAAACGCGCCCATCCAGGA-3，
P3:5 ’ -ATCAGCAGGACGCACTGACCCATTAAGGAGGAGCTATGTCG-3，
P4: 5’ -ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAATT-3’
P5:5 ’ -TCCTGGATGGGCGCGTTTTCTCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3，
P6:5 ’ -CGACATAGCTCCTCCTTAATGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3，
將瓊脂糖凝膠電泳分離純化后的Up-P-down片段和pKOV質(zhì)粒(可購(gòu)自Addgene公司)分別用雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后連接，獲得用于導(dǎo)入的載體pK0V-Up-P-Down,并將載體pKOV-Up-P-Down送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，表明其含有正確的弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列，保存?zhèn)溆?。將?gòu)建好的pKOV-Up-P-Down質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化入常用的低產(chǎn)L-蘇氨酸的E.coliMG442菌株(可購(gòu)自俄國(guó)國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏編號(hào)CMM B-1628 ;其構(gòu)建方法可參見US4278765A)和高產(chǎn)L-蘇氨酸的萬.coli BKIIM B-3996菌株(可購(gòu)自俄國(guó)抗生素研究所，登記號(hào)為1867 ;其構(gòu)建方法可參見US5175107A)(經(jīng)測(cè)序確認(rèn)這兩個(gè)菌株染色體上均保留有野生型的acnA基因(即Genbank等錄號(hào)U00096.2中的1333855至1336530位)及其上下游元件)，于30°C、100 rpm,在LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇2 h后,根據(jù)Addgene公司的pKOV質(zhì)粒的商品指南，挑選出同源重組陽性的單克隆，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)其染色體上的野生型基因的上游啟動(dòng)子被替換為弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，分別得到acW啟動(dòng)子突變的(低/高產(chǎn)L-蘇氨酸)大腸桿菌。經(jīng)檢測(cè)，在不同培養(yǎng)基中，這兩個(gè)菌株的烏頭酸酶的表達(dá)量均有6510%的下降。效果實(shí)施例蘇氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 將萬.coli BKIIM B-3996菌株、疋coli MG442菌株以及實(shí)施例1和2的菌株分別接種在25mL表I所述的培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm培養(yǎng)12 h。然后取I mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)物接種在25 mL表I所述的培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm培養(yǎng)培養(yǎng)36 h。當(dāng)培養(yǎng)完成時(shí)，通過HPLC測(cè)定1-蘇氨酸的產(chǎn)生。
表I培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸的方法，其包括: (1)改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失；和， (2)用步驟(I)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸。
2.提高1-蘇氨酸的發(fā)酵量的方法，其包括: (O改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失；和， (2)用步驟(I)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生1-蘇氨酸。
3.改造獲得的細(xì)菌在發(fā)酵生產(chǎn)1-蘇氨酸中的應(yīng)用，其中，所述改造獲得是改造細(xì)菌染色體上基因的野生型的調(diào)控元件而獲得，而且使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失。
4.改造獲得的細(xì)菌在提高1-蘇氨酸的發(fā)酵量的應(yīng)用，其中，所述改造獲得是改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件而獲得，而且使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失。
5.改造細(xì)菌的方法，其包括改造所述細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失。
6.權(quán)利要求1-5之任一所述的方法或應(yīng)用，其中，所述野生型的調(diào)控元件是野生型的啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求6所述的方法或應(yīng)用，其中，所述野生型的啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。
8.權(quán)利要求1-7之任一所述的方法或應(yīng)用，其中，所述改造細(xì)菌染色體上acW基因的野生型的調(diào)控元件是將染色體上基因的野生型的調(diào)控元件替換為弱轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，優(yōu)選替換為弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，如核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求1-8之任一所述的方法或 應(yīng)用，其中，所述細(xì)菌是埃希氏菌屬細(xì)菌，優(yōu)選是大腸桿菌。
10.權(quán)利要求5所述的方法改造而得到的產(chǎn)蘇氨酸細(xì)菌，其不包含如SEQID No:l所示的野生型的啟動(dòng)子的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法，其包括改造細(xì)菌染色體上acnA基因的野生型的調(diào)控元件，使其烏頭酸酶A的表達(dá)量降低但不消失；和，用改造的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)l-蘇氨酸。另外，本發(fā)明還提供了由該方法衍生的方法和應(yīng)用，以及可以用在這些方法和應(yīng)用中的細(xì)菌等。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103173505SQ201310117440
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者馬吉銀, 溫廷益, 陳金龍, 梁勇, 劉樹文, 魏愛英, 楊立鵬, 孟剛, 任瑞 申請(qǐng)人:寧夏伊品生物科技股份有限公司