專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)技術，屬于運動創(chuàng)傷學、細胞生物學、組織工程學交叉學科領域。
背景技術：
骨骼肌衛(wèi)星細胞(skeleton satellite cell, SCC)是目前公認的骨骼肌干細胞，是位于肌細胞膜和基膜之間的具有增殖分化潛力的肌源性細胞。1961年，Mauro描述了一個與青蛙肌纖維細胞邊緣緊密相連的細胞，并根據(jù)其位置命名為衛(wèi)星細胞，它們在一般情況下是處于靜息狀態(tài)的，當被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌細胞的能力。負責骨骼肌生長和損傷修復。2008年，Nature雜志刊登由美國斯坦福大學醫(yī)學院的Sacco等人的研究結果:研究小組通過利用克隆分析證實衛(wèi)星細胞的確是干細胞、能夠自我更新，從而澄清了相關問題。他們將一個表達熒光素酶的衛(wèi)星細胞移植進了小鼠的肌肉中，發(fā)現(xiàn)它能夠大量增殖，有助于肌肉纖維的形成，而且可以被再次移植。若該干細胞治療應用技術得以突破，必定會為人類骨骼肌損傷修復在臨床康復治療帶來了新的希望。在現(xiàn)代體育運動中，冰雪運動是一個高風險的運動，運動員發(fā)生肌肉損傷幾乎不可避免，當優(yōu)秀冰雪運動員發(fā)生損傷后，一方面運動員自身承受著巨大的身心壓力，另一方面也是其所從事的項目上的重大損失。怎樣科學地選擇運動員骨骼肌損傷后的治療康復手段已成為現(xiàn)今醫(yī)學工作者和體育工作者熱切關注的問題，以往組織病理學的觀點認為，人體成熟的骨骼肌細胞屬于終末分化細胞，已經(jīng)不再具有分裂和再生的能力，一旦因為某種原因遭受破壞，就會成為永久性的功能和組織的缺失，被纖維化的瘢痕組織所代替，不在具有收縮能力，使其運動能力減弱或喪失。同時，傳統(tǒng)的治療手段，如開放性手術治療，因其副損傷和術后并發(fā)癥常常給運動員重回巔峰競技水平帶來不可預知的風險。近年來，關于骨骼肌衛(wèi)星細胞移植到骨骼肌中用來治療肌肉組織缺損或肌肉功能障礙的研究不斷出現(xiàn)新的成果，并且隨著組織工 程技術的發(fā)展，應用肌組織工程技術，進行骨骼肌再生代替以往的手術方法治療運動員骨骼肌損傷的手段固然是更為科學的選擇。目前，骨骼肌細胞移植技術還處于基礎研究階段，使得體外分離培養(yǎng)人骨骼肌衛(wèi)星細胞在骨骼肌損傷后的治療和康復領域具有很重要的臨床和現(xiàn)實意義。因此，優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)方法能夠為骨骼肌細胞移植技術提供豐富的研究材料，能夠為骨骼肌傷病的冰雪運動員帶來治療康復的新希望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)方法。骨骼肌衛(wèi)星細胞樣本采集均經(jīng)優(yōu)秀冰雪運動員本人及隸屬單位同意。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下實驗方案:(I)優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌樣本的采集；(2)優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞分離培養(yǎng)；
其中，步驟⑴樣本的采集來自優(yōu)秀冰雪運動員三角肌肌肉組織活檢；步驟(2)中采用0.9%無菌生理鹽水清洗肌肉組織；步驟(2)中采用1% I型膠原酶及0.1%鏈酶蛋白酶聯(lián)合消化分離骨骼肌衛(wèi)星細胞；步驟(2)中采用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；步驟⑵中采用0.25%胰蛋白酶消化骨骼肌衛(wèi)星細胞傳代培養(yǎng)；步驟⑵中采用DMEM基礎培養(yǎng)基+ 二甲基亞砜+胎牛血清(比例為5: I: 4)進行骨骼肌衛(wèi)星細胞凍存。
具體實施例方式(I)取優(yōu)秀冰雪運動員三角肌活檢組織3mm3 ；(2)用0.9%無菌生理鹽水清洗兩遍；(3)用1% I型膠原酶消化30min ；(4)用0.1 %鏈酶蛋白酶消化30min，用不同規(guī)格滴定管吹打使衛(wèi)星細胞與基膜分離；(5)用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，用400目細胞篩過濾，500g離心 5min。(6)棄 上清，高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，接種貼壁培養(yǎng)。(7)待骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁匯合率至95%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。(8)骨骼肌衛(wèi)星細胞凍存采用凍存液DMEM基礎培養(yǎng)基+ 二甲基亞砜+胎牛血清(比例為5:1:4)凍存。
權利要求
1.一種優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離方法。
2.根據(jù)權利要求1所述中的方法，其特征在于，采用1%I型膠原酶及0.1 %鏈酶蛋白酶聯(lián)合消化分離法為特征。
3.根據(jù)權利要求2所述中的方法，其特征在于，聯(lián)合消化法采用在37°中對骨骼肌衛(wèi)星細胞進行消化，IOmin 即可獲得目的細胞。教傳統(tǒng)方法相比節(jié)約了操作時間。
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)技術，屬于細胞生物學、運動創(chuàng)傷學、組織工程學交叉學科領域。通過采用0.9％無菌生理鹽水清洗肌肉組織，37°條件下1％I型膠原酶及0.1％鏈酶蛋白酶聯(lián)合消化分離骨骼肌衛(wèi)星細胞，含10％胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)以及采用凍存液DMEM基礎培養(yǎng)基+二甲基亞砜+胎牛血清(比例為5∶1∶4)凍存骨骼肌衛(wèi)星細胞，提供了一種簡易、高效、傳代穩(wěn)定的優(yōu)秀冰雪運動員骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)方法。
文檔編號C12N5/077GK103160461SQ20131011789
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權日2013年4月8日
發(fā)明者王瑩, 謝長福, 張宏宇, 熊慧, 孫婷婷, 關偉軍 申請人:哈爾濱體育學院