專利名稱：創(chuàng)傷弧菌的實時熒光pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢驗檢疫領(lǐng)域，涉及創(chuàng)傷弧菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及一種應用免疫磁珠技術(shù)進行創(chuàng)傷弧菌檢測的方法。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，VV)是一種嗜鹽弧菌，廣泛存在于海水及海產(chǎn)品中，人體可通過生食海鮮或經(jīng)過肢體破損創(chuàng)口接觸海水、海產(chǎn)品而受其感染。常見于海上勞作的漁民及駐海演習人員從而引起敗血癥和軟組織感染。本菌對于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎、肝功能障礙患者的危害相當嚴重，可引起創(chuàng)傷弧菌膿毒血癥，起病急，進展迅速，死亡率高。我國已將該菌列為主要的檢驗或監(jiān)測對象。目前，該菌是多數(shù)進出口水產(chǎn)品必檢的致病菌之一。目前檢測食品中致病微生物的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，即分離鑒定方法，該方法所需時間長，一般情況下需要5 7天，有時達到10 15天，很難滿足快速鑒定的需要；實時熒光PCR (RT-PCR)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的基于檢測遺傳物質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)應用在微生物檢測、基因表達、新生物醫(yī)藥的篩選等領(lǐng)域，該技術(shù)具有高特異性、高靈敏度的特點，所需檢測時間短，整個PCR過程只需2個小時左右，經(jīng)大量的科研實踐證明，在檢測特異性和靈敏度方面，實時熒光PCR技術(shù)與傳統(tǒng)方法相當，但是極大地縮短了檢測時間，整個檢測過程從5 7天時間，縮短到2 3天，節(jié)約了時間，縮短了貨物在口岸的停留時間，最根本的保護了廣大消費者的利益。納米磁珠是運用納米技術(shù)，在傳統(tǒng)生物學和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展生物科學、醫(yī)學等方面的研究。在分子、細胞和個體水平上為食源性致病菌檢測和疾病的診斷等方面提供新材料、新技術(shù)和新方法。納米磁珠在生物樣品的分離分析中有著重要應用價值:(1)高效富集:納米磁珠比表面積大，顯著增加反應界面能夠高效富集生物樣品；(2)非常有效的去除PCR反應中的抑制劑:以現(xiàn)在的檢測方法，不同種的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加劑往往對PCR反應有較強的抑制作用，采用磁珠分離的方法可以非常有效的去除抑制劑；(3)可操作性:納米磁珠具有超順磁效應，外加磁場能夠快速對其進行移動和分離；(4)標記性質(zhì):生物分子標記方法簡單、可靠?？贵w是一類重要的生物活性材料，廣泛應用于檢驗檢疫、疾病診斷、藥物篩選、國防、航天、司法鑒定、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測及軍事偵檢等領(lǐng)域，已成為發(fā)展新型免疫檢測技術(shù)和推動檢測檢疫產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要資源。本發(fā)明應用與抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體偶聯(lián)的納米磁珠，即免疫磁珠(Immunomagnetic Beads, IMB),其具有選擇性好,特異性強，能起到富集濃縮細菌的作用，有效避免或減少漏檢，且可去除食品樣品中抑制PCR反應的成分。將免疫磁珠分離(Immunomagnetic separation, IMS)與 RT-PCR 技術(shù)相結(jié)合，建立 IMS-RT-PCR 檢測方法，可以極大地提高檢測效率。并由此開 發(fā)了創(chuàng)傷弧菌MS-RT-PCR檢測試劑盒，具有廣闊的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測創(chuàng)傷弧菌的RT-PCR寡核苷酸。本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果準確的創(chuàng)傷弧菌的RT-PCR檢測試劑盒。本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種創(chuàng)傷弧菌的IMS-RT-PCR檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一組檢測創(chuàng)傷弧菌的寡核苷酸，是依據(jù)NCBI收錄號AB124803(vvhA)對應的基因序列設計的，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.3所不喊基序列組成；其中序列SEQ ID N0.1為正義引物(P1)，序列SEQ ID N0.2為反義引物(P2)，序列SEQ ID N0.3為熒光探針(P)，探針的5’端標記報告熒光基團為FAM (6-羧基熒光素)，3’端標記淬滅熒光基團為TAMRA。詳見表I。表I引物序列
權(quán)利要求
1.一組檢測創(chuàng)傷弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分別為檢測創(chuàng)傷弧菌的正義引物和反義引物，序列SEQ ID N0.3為檢測創(chuàng)傷弧菌的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測創(chuàng)傷弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述熒光探針序列SEQ ID NO:3的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測創(chuàng)傷弧菌的寡核苷酸在制備檢測創(chuàng)傷弧菌試劑盒中的應用。
4.一種創(chuàng)傷弧菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下物質(zhì): (1)偶聯(lián)有抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體的免疫磁珠； (2)RT-PCR反應液，其包括:序列表SEQID N0.1所示的正義引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針； (3)陰性對照； (4)陽性對照。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體為保藏編號為CGMCC N0.6755的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應液還包括TaqManGene Expression Master Mix 溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述 的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應液中各種成分的使用終濃度為 IXTaqMan Gene Expression Master Mix 溶液、0.4 U M 正義引物、0.4 U M 反義弓丨物、0.4 ii M熒光探針。
8.—種創(chuàng)傷弧菌的檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)免疫磁珠富集菌體； 2)提取菌體的DNA； 3)進行RT-PCR反應，其中，使用序列表SEQID N0.1所示的正義引物，序列表SEQ IDN0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，所述熒光探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA ； 4)根據(jù)實時熒光RT-PCR反應體系的熒光強度進行結(jié)果判定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中，所述免疫磁珠為偶聯(lián)有抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體的免疫磁珠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體為保藏編號為CGMCC N0.6755的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種創(chuàng)傷弧菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及一組檢測創(chuàng)傷弧菌的寡核苷酸，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡便。
文檔編號C12N15/11GK103160601SQ20131011937
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者曾靜, 張蕾, 周熙成, 魏海燕, 張西萌, 張琳 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心