專利名稱：副溶血性弧菌的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，涉及副溶血性弧菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)進(jìn)行副溶血性弧菌檢測。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemoIyticus,簡稱Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚、貝類等海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥。近年來，由感染副溶血性弧菌引發(fā)的食物中毒已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問題之一。在日本，由該菌引起的食物中毒占全國食物中毒例數(shù)的20% 30% ;我國國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示沿海省份副溶血性弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已經(jīng)高居微生物食物中毒首位。為確保食品安全，保護(hù)人民身體健康，歐盟、美國等發(fā)達(dá)國家對水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌做出了明確的規(guī)定。如歐盟規(guī)定副溶血性弧菌不得檢出，而美國規(guī)定小于lX104CFU/g。我國已將該菌列為主要的檢驗(yàn)或監(jiān)測對象。目前，該菌是多數(shù)進(jìn)出口水產(chǎn)品必檢的致病菌之一。目前檢測食品中致病微生物的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，即分離鑒定方法，該方法所需時(shí)間長，一般情況下需要5 7天，有時(shí)達(dá)到10 15天，很難滿足快速鑒定的需要；實(shí)時(shí)熒光PCR (RT-PCR)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的基于檢測遺傳物質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在微生物檢測、基因表達(dá)、新生物醫(yī)藥的篩選等領(lǐng)域，該技術(shù)具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，所需檢測時(shí)間短，整個(gè)PCR過程只需2個(gè)小時(shí)左右，經(jīng)大量的科研實(shí)踐證明，在檢測特異性和靈敏度方面，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，但是極大地縮短了檢測時(shí)間，整個(gè)檢測過程從5 7天時(shí)間，縮短 到2 3天，節(jié)約了時(shí)間，縮短了貨物在口岸的停留時(shí)間，最根本的保護(hù)了廣大消費(fèi)者的利益。納米磁珠是運(yùn)用納米 技術(shù)，在傳統(tǒng)生物學(xué)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的研究。在分子、細(xì)胞和個(gè)體水平上為食源性致病菌檢測和疾病的診斷等方面提供新材料、新技術(shù)和新方法。納米磁珠在生物樣品的分離分析中有著重要應(yīng)用價(jià)值:(1)高效富集:納米磁珠比表面積大，顯著增加反應(yīng)界面能夠高效富集生物樣品；
(2)非常有效的去除PCR反應(yīng)中的抑制劑:以現(xiàn)在的檢測方法，不同種的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加劑往往對PCR反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用，采用磁珠分離的方法可以非常有效的去除抑制劑；(3)可操作性:納米磁珠具有超順磁效應(yīng)，外加磁場能夠快速對其進(jìn)行移動(dòng)和分離；(4)標(biāo)記性質(zhì):生物分子標(biāo)記方法簡單、可靠?？贵w是一類重要的生物活性材料，廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫、疾病診斷、藥物篩選、國防、航天、司法鑒定、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測及軍事偵檢等領(lǐng)域，已成為發(fā)展新型免疫檢測技術(shù)和推動(dòng)檢測檢疫產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要資源。本發(fā)明應(yīng)用與抗副溶血性弧菌單克隆抗體偶聯(lián)的納米磁珠，即免疫磁珠(Immunomagnetic Beads, IMB),其具有選擇性好,特異性強(qiáng)，能起到富集濃縮細(xì)菌的作用，有效避免或減少漏檢，且可去除食品樣品中抑制PCR反應(yīng)的成分。將免疫磁珠分離(Immunomagnetic separation, IMS)與 RT-PCR 技術(shù)相結(jié)合，建立 IMS-RT-PCR 檢測方法，可以極大地提高檢測效率。并由此開發(fā)了副溶血性弧菌MS-RT-PCR檢測試劑盒，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測副溶血性弧菌的RT-PCR寡核苷酸。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的副溶血性弧菌的RT-PCR檢測試劑盒。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種副溶血性弧菌的IMS-RT-PCR檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一組檢測副溶血性弧菌的寡核苷酸，是依據(jù)NCBI收錄號M36437對應(yīng)的基因序列設(shè)計(jì)的，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.3所示堿基序列組成；其中序列SEQ ID N0.1為正義引物(P1)，序列SEQ ID N0.2為反義引物(P2)，序列SEQ IDN0.3為突光探針(P),探針的5’端標(biāo)記報(bào)告突光基團(tuán)為FAM (6-羧基突光素),3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)為TAMRA。詳見表I。表I引物序列`
權(quán)利要求
1.一組檢測副溶血性弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ IDN0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分別為檢測副溶血性弧菌的正義引物和反義引物，序列SEQ ID N0.3為檢測副溶血性弧菌的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測副溶血性弧菌的寡核苷酸，其特征在于，所述熒光探針序列SEQ ID NO:3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測副溶血性弧菌的寡核苷酸在制備檢測副溶血性弧菌試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種副溶血性弧菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下物質(zhì): (1)偶聯(lián)有抗副溶血性弧菌單克隆抗體的免疫磁珠； (2)RT-PCR反應(yīng)液，其包括:序列表SEQID N0.1所示的正義引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針； (3)陰性對照； (4)陽性對照。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌單克隆抗體為保藏編號為CGMCC N0.6061的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)液還包括TaqManGene Expression Master Mix 溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)液中各種成分的使用終濃度為 IXTaqMan Gene Expression Maste`r Mix 溶液、0.4 U M 正義引物、0.4 U M 反義弓丨物、0.4 ii M熒光探針。
8.一種副溶血性弧菌的檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)免疫磁珠富集菌體； 2)提取菌體的DNA； 3)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，其中，使用序列表SEQID N0.1所示的正義引物，序列表SEQ IDN0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，所述熒光探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA ； 4)根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中，所述免疫磁珠為偶聯(lián)有抗副溶血性弧菌單克隆抗體的免疫磁珠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌單克隆抗體為保藏編號為CGMCC N0.6061的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及一組檢測副溶血性弧菌的寡核苷酸，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的堿基序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡便。
文檔編號C12R1/63GK103160602SQ20131011946
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者曾靜, 周琦, 張蕾, 程晉霞, 魏海燕, 張西萌, 張琳 申請人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心