專利名稱：副溶血性弧菌的lamp檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種副溶血性弧菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemoIyticus,簡(jiǎn)稱Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚、貝類等海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥。近年來，由感染副溶血性弧菌引發(fā)的食物中毒已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問題之一。在日本，由該菌引起的食物中毒占全國(guó)食物中毒例數(shù)的20% 30% ;我國(guó)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示沿海省份副溶血性弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)高居微生物食物中毒首位。為確保食品安全，保護(hù)人民身體健康，歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌做出了明確的規(guī)定。如歐盟規(guī)定副溶血性弧菌不得檢出，而美國(guó)規(guī)定小于lX104CFU/g。我國(guó)已將該菌列為主要的檢驗(yàn)或監(jiān)測(cè)對(duì)象。目前，該菌是多數(shù)進(jìn)出口水產(chǎn)品必檢的致病菌之一。目前檢測(cè)食品中致病微生物的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，即分離鑒定方法，該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，一般情況下需要5 7天，有時(shí)達(dá)到10 15天，很難滿足快速鑒定的需要；近幾年發(fā)展起來的PCR技術(shù)，是一種快速、靈敏、特異性好的技術(shù)，但是目前該技術(shù)還是依賴于傳統(tǒng)方法的前增菌步驟，增菌液中往往含有PCR抑制劑，從而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果；快速的ELISA方法檢測(cè)，作為篩選方法具有快速、靈敏的特點(diǎn)，是受到廣泛歡迎的篩選方法，但是所使用的試劑盒均來自國(guó)外，價(jià)格昂貴，而且需要配備其專門的儀器。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是繼PCR技術(shù)發(fā)展起來的基于檢測(cè)遺傳物質(zhì)DNA的一種新的擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速 、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列；其特點(diǎn)是無需特殊的、昂貴的檢測(cè)儀器，只需簡(jiǎn)單的恒溫設(shè)備或者是加熱塊，即可完成PCR擴(kuò)增，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。納米磁珠是運(yùn)用納米技術(shù)，在傳統(tǒng)生物學(xué)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的研究。在分子、細(xì)胞和個(gè)體水平上為食源性致病菌檢測(cè)和疾病的診斷等方面提供新材料、新技術(shù)和新方法。納米磁珠在生物樣品的分離分析中有著重要應(yīng)用價(jià)值:(1)高效富集:納米磁珠比表面積大，顯著增加反應(yīng)界面能夠高效富集生物樣品；
(2)非常有效的去除核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的抑制劑:以現(xiàn)在的檢測(cè)方法，不同種的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加劑往往對(duì)核酸擴(kuò)增有較強(qiáng)的抑制作用，采用磁珠分離的方法可以非常有效的去除抑制劑；(3)可操作性:納米磁珠具有超順磁效應(yīng)，外加磁場(chǎng)能夠快速對(duì)其進(jìn)行移動(dòng)和分離；(4)標(biāo)記性質(zhì):生物分子標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、可靠?？贵w是一類重要的生物活性材料，廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫、疾病診斷、藥物篩選、國(guó)防、航天、司法鑒定、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測(cè)及軍事偵檢等領(lǐng)域，已成為發(fā)展新型免疫檢測(cè)技術(shù)和推動(dòng)檢測(cè)檢疫產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要資源。本發(fā)明應(yīng)用與抗副溶血性弧菌單克隆抗體偶聯(lián)的納米磁珠，即免疫磁珠(Immunomagnetic Beads, IMB),其具有選擇性好,特異性強(qiáng)，能起到富集濃縮細(xì)菌的作用，有效避免或減少漏檢，且可去除食品樣品中抑制核酸擴(kuò)增的成分。將免疫磁珠分離(Immunomagnetic separation, IMS)與LAMP技術(shù)相結(jié)合，建立IMS-LAMP檢測(cè)方法，可以極大地提高檢測(cè)效率。并由此開發(fā)了副溶血性弧菌IMS-LAMP檢測(cè)試劑盒，具有廣闊的應(yīng)用前
景

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測(cè)副溶血性弧菌的LAMP引物。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確的副溶血性弧菌的LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種副溶血性弧菌的IMS-LAMP檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一組檢測(cè)副溶血性弧菌的引物，該組引物是依據(jù)NCBI收錄號(hào)M36437對(duì)應(yīng)的基因序列設(shè)計(jì)的，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQ ID N0.6所不喊基序列的寡核苷酸組成；其中SEQ ID N0.1為外側(cè)上游引物，SEQ ID N0.2為外側(cè)下游引物，SEQID N0.3為內(nèi)側(cè)上游引物，SEQ ID N0.4為內(nèi)側(cè)下游引物，SEQ ID N0.5為環(huán)狀上游引物，SEQID N0.6為環(huán)狀下游引物。詳見表I。表I引物序列
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)副溶血性弧菌的引物，其特征在于，由序列表SEQ ID N0.1至序列表SEQID N0.6所示的堿基序列組成；其中SEQ ID N0.1為外側(cè)上游引物，SEQ ID N0.2為外側(cè)下游引物，SEQ ID N0.3為內(nèi)側(cè)上游引物，SEQ ID N0.4為內(nèi)側(cè)下游引物，SEQ ID N0.5為環(huán)狀上游引物，SEQ ID N0.6為環(huán)狀下游引物。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)副溶血性弧菌的引物在制備檢測(cè)副溶血性弧菌試劑盒中的應(yīng)用。
3.一種副溶血性弧菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下物質(zhì): (1)偶聯(lián)有抗副溶血性弧菌單克隆抗體的免疫磁珠； (2)LAMP反應(yīng)液，其包括:序列表SEQ ID N0.1所示的外側(cè)上游引物，序列表SEQ IDN0.2所示的外側(cè)下游引物，序列表SEQ ID N0.3所示的內(nèi)側(cè)上游引物，序列表SEQ ID N0.4所示的內(nèi)側(cè)下游引物，序列表SEQ ID N0.5所示的環(huán)狀上游引物，序列表SEQ ID N0.6所示的環(huán)狀下游引物； (3)Bst DNA 聚合酶； (4)陰性對(duì)照； (5)陽(yáng)性對(duì)照；(6)顯色液=SYBRGreen I染料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌單克隆抗體為保藏編號(hào)為CGMCC N0.6061的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒,其特征在于,所述LAMP反應(yīng)液還包括ThermoPol緩沖液、dNTPs和MgSO4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)液中各種成分的使用終濃度為 IXThermoPol 緩沖液、1.6mM dNTPs、2.0mM MgS04、0.2 μ M 外側(cè)上游引物、0.2 μ M 外側(cè)下游引物、2.Ομ M內(nèi)側(cè)上游引物、2.Ομ M內(nèi)側(cè)下游引物、1.Ομ M環(huán)狀上游引物、1.Ομ M環(huán)狀下游引物。
7.一種副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: O免疫磁珠富集菌體； 2)提取菌體的DNA； 3)進(jìn)行LAMP反應(yīng)；反應(yīng)條件為65°C恒溫反應(yīng)60min，85°C2min使酶失活，反應(yīng)結(jié)束； 4)通過反應(yīng)體系顏色變化和/或電泳檢測(cè)進(jìn)行結(jié)果判定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中，進(jìn)行LAMP反應(yīng)時(shí)，使用的引物為序列表SEQ ID N0.1所示的外側(cè)上游引物，序列表SEQ ID N0.2所示的外側(cè)下游引物，序列表SEQ ID N0.3所示的內(nèi)側(cè)上游引物，序列表SEQ ID N0.4所示的內(nèi)側(cè)下游引物，序列表SEQ ID N0.5所示的環(huán)狀上游引物，序列表SEQ ID N0.6所示的環(huán)狀下游引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中，所述免疫磁珠為偶聯(lián)有抗副溶血性弧菌單克隆抗體的免疫磁珠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌單克隆抗體為保藏編號(hào)為CGMCC N0.6061的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，具體涉及一組檢測(cè)副溶血性弧菌的引物，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的寡核苷酸序列，及含有這些引物的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)C12R1/63GK103160603SQ20131011957
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者曾靜, 魏海燕, 張蕾, 張西萌, 張琳, 馬丹 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心