專利名稱：一種β-瓊膠酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因篩選應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種β -瓊膠酶及其應(yīng)用，即一種來源于嗜瓊膠卵鏈菌(Catenivulum agarivorans gen.nov.sp.ηον.) YMOl 的 β -瓊膠酶基因ΥΜ01-3及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在自然環(huán)境中，瓊膠酶的分布較廣，很多微生物和一些海洋軟體動物都能產(chǎn)生瓊膠酶。現(xiàn)階段，絕大多數(shù)被分離研究的瓊膠酶都是來自微生物，而海洋細(xì)菌又是產(chǎn)瓊膠酶最多的類群。瓊膠降解菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛，在海洋植物、動物、海水及海洋沉積物中均有分布。根據(jù)氨基酸序列的相似性，瓊膠酶被歸屬為糖苷水解酶家族(Glycosidehydrolase family)中的GH- 16,GH- 50和GH- 86。根據(jù)瓊膠酶降解瓊脂糖作用方式不同，可以把瓊膠酶分為兩類:α -瓊膠酶和β -瓊膠酶。α -瓊膠酶裂解瓊脂糖的α _1，3糖苷鍵，生成以D-半乳糖為非還原性末端和以3，6-內(nèi)醚-a - L-半乳糖為還原性末端的的瓊寡糖系列；β -瓊膠酶裂解瓊脂糖的1，4糖苷鍵，生成以β- D-半乳糖為還原性末端和以3，6-內(nèi)醚-a - L-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖系列。已有證據(jù)表明，這些瓊膠寡糖尤其是新瓊寡糖具有很多的生理和生物活性。例如新瓊寡糖對黑色素瘤細(xì)胞具有保濕和美白效果，還具有抑制微生物生長，刺激巨噬細(xì)胞活性的作用；瓊膠寡糖在體內(nèi)體外都具有清除ROS (Reactive Oxygen Species,活性氧簇)造成的氧化損傷的作用，因此可以應(yīng)用在化妝品和保健品領(lǐng)域。綜上所述，可以看出瓊寡糖在功能食品、藥物、化妝品等領(lǐng)域都有非常廣泛的應(yīng)用前景。目前常用的瓊寡糖生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和酶解法兩種。傳統(tǒng)的化學(xué)制備方法反應(yīng)條件比較劇烈，專一性差，很難得到單一大小的寡糖，而且水解產(chǎn)物容易破壞，不利于產(chǎn)物的分析和回收，這些都限制了瓊寡糖`的使用。而瓊膠酶酶解法由于高度專一高效，反應(yīng)條件溫和，易于控制，產(chǎn)物不易被破壞，因此有利于特定寡糖的大量制備和回收，必將成為瓊寡糖生產(chǎn)的主要方法。雖然瓊膠酶制備寡糖具有很多優(yōu)勢，但目前在工業(yè)上并沒有得到廣泛應(yīng)用。這主要是因?yàn)槟壳鞍l(fā)現(xiàn)和研究較多的是中溫瓊膠酶。由于提取純化的費(fèi)用高、酶產(chǎn)量低，貯藏和處理過程中酶活容易損失，貯存期短、運(yùn)輸費(fèi)用高等缺點(diǎn)，導(dǎo)致這些酶的應(yīng)用受到限制；而耐高溫瓊膠酶由于具有良好的高溫穩(wěn)定性，壽命一般長于中溫酶，而且制備和使用過程中不需要冷卻設(shè)備，可以顯著降低成本，因此，在工業(yè)上具有更廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種β -瓊膠酶基因及其應(yīng)用，所提供的β -瓊膠酶具有耐高溫的特性，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種β -瓊膠酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。用于編碼本發(fā)明β_瓊膠酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID Ν0:2。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種用于表達(dá)上述β -瓊膠酶的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的β -瓊膠酶用于降解瓊膠制備新瓊寡糖。本發(fā)明的β -瓊膠酶具有耐高溫的特性，能夠特異性地降解瓊膠產(chǎn)生聚合度為4-10的新瓊寡糖，終產(chǎn)物為新瓊四糖和新瓊六糖，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1:本發(fā)明的β-瓊膠酶的耐高溫效果檢測(顯示降解圈)，其中左邊樣品未煮過，右邊樣品沸水煮過5min ；圖2:本發(fā)明的β -瓊膠酶的應(yīng)用效果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明，并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。實(shí)施例1: β -瓊膠酶基因ΥΜ01-3的分離通過對嗜瓊膠卵鏈菌YMOl進(jìn)行全基因組測序得到15個(gè)瓊膠酶基因及其基因序列，包括13個(gè)β -瓊膠酶基因和2個(gè)α -瓊膠酶基因，ΥΜ01-3是其中的一個(gè)β -瓊膠酶基因。利用生物學(xué)軟件 Primer5.0 設(shè)計(jì)上游引物(5' - CCGGAATTCATGTATGCAGCAGACTGGGAT-3')和下游引物(5' - CCGCTCGAGTTGGAACTTCCATTGCTGG-3')以基因組 DNA 為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)組成如下(25 μ I反應(yīng)體系):ddH20 10.5 μ 1、上游和下游引物各0.5 μ 1，DNA模板 1μ 1,2XMasterMix 12.5 μ I。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性 lmin，60°C退火lmin，72°C延伸1.5min，72°C終延伸lOmin，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物回收得到瓊膠酶基因YM01-3，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 2，其翻譯的酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。多個(gè)測序結(jié)果也獲得了相同的結(jié)果。實(shí)施例2:大腸桿菌克隆載體I3UCm-T — YMO1-3的構(gòu)建將β -瓊膠酶基因ΥΜ01-3與載體PUCm-T的連接，采用DNA Ligation Kit連接，連接體系(10 μ I)如下:Solution I 5 μ 1，DNA 片段 4 μ l，PUCm_T 載體 I μ I。16°C連接 16h所得到的連接液即可獲得大腸桿菌克隆載體PUCm-T — YMO1-3，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。實(shí)施例3:大腸桿菌重組株JM109—PUCm-T — YMO1-3的構(gòu)建加入200 μ I解凍的感受態(tài)Ε.coli JM109和10 μ I實(shí)施例2得到的連接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培養(yǎng)基800 μ 1，37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。菌液與4μ I IPTG及40μ1 X-gal混合后涂布于含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12-14h。挑取白色菌落做PCR及雙酶切檢測，酶切體系(20 μ I)如下:ddH208μ l，PUCm-T—YM01-3 質(zhì)粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ 1，Xhol I I μ I, IOXH Buffer 2μ1，瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)1260bp特異帶者為陽性轉(zhuǎn)化克隆，即含有I3UCm-T — YMO1-3的大腸桿菌JM109—PUCm-T—YM01-3。將Iml陽性克隆菌液送測，以M13測序通用引物測定外源插入序列YMO1-3核苷酸序列。實(shí)施例4:大腸桿菌表達(dá)載體pET24a(+) — YM01-3的構(gòu)建克隆載體PUCm-T — YM01-3和表達(dá)載體pET24a(+)分別用EcoR I和Xhol I雙酶切，酶切體系(20 μ I)如下:反應(yīng)體系1:ddH20 8 μ 1，PUCm-T-YMO1-3 質(zhì)粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ I,Xhol I I μ I, IOXH Buffer 2 μ I反應(yīng)體系2:ddH20 8 μ 1，pET24a(+)質(zhì)粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ 1，Xhol I I μ I,IOXH Buffer 2 μ 137°C酶切2小時(shí)，電泳后分別回收兩個(gè)目的片段1260bp和5.3Kb，二者分別與瓊膠酶YMOl基因全長片段與表達(dá)載體PET24a⑴片段大小相同，用DNALigation Kit 連接,連接體系(10 μ I)如下:Solution I 5μl,DNA片段l.5μl,pET24a(+)載體1.1μ 1，ddH20 2.4μ1。16°C連接16小時(shí)即可獲得大腸桿菌表達(dá)載體pET24a(+) —YMO1-3，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。實(shí)施例5:大腸桿菌重組株BL21 (DE3) —pET24a (+) -YMO1-3的構(gòu)建加入200 μ I解凍的感受態(tài)Ε.coli JM109和10 μ I實(shí)施例4得到的連接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培養(yǎng)基800 μ 1，37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。菌液涂布于含有100 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12-14h。挑取白色菌落做雙酶切檢測，酶切體系(10 μ I)如下:ddH20 4μl，pET24a(+)—YM01-3質(zhì)粒DNA 4 μ 1，EcoR I 0.5 μ I, Xhol I 0.5 μ I, IOXH Buffer I μ I。瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn) 1260bp特異帶者為陽性轉(zhuǎn)化克隆，即含有pET24a (+) — YMO1-3的大腸桿菌重組株BL21 (DE3) —pET24a (+)—YM01-3。實(shí)施例6:重組β -瓊膠酶的制備挑取大腸桿菌重組株BL21 (DE3) 一 pET24a⑴一 YMO 1_3單克隆于含有濃度為100 μ g/ml卡那霉素的LB的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1%接種量接種至200ml含有100 μ g/ml卡那霉素的LB的液體培養(yǎng)基中，37°C 150rpm振蕩培養(yǎng)至OD6c 為0.4-0.5，加入終濃度為0.1mMIPTG, 16°C誘導(dǎo)表達(dá)10_12h。誘導(dǎo)菌液4°C 12000rpm離心lOmin，收集菌體，菌體用IOmllXNi 柱結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl , PH=8.0 ；10 mM咪唑；0.5 mMNaCl)重懸并進(jìn)行超聲波破碎，破碎后4°C 12000rpm離心lOmin，收集上清液，破碎沉淀用2ml結(jié)合緩沖液沖洗，離心收集上清，將兩次上清液混合。上清液上至用平衡好的Ni柱，用10 倍體積 IXNi 柱洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl , PH=8.0 ；20 mM 咪唑；0.5 mM NaCl)洗脫，然后依次用不同濃度(50 mM,100 mM,150 mM, 200 mM，250mM)咪唑的洗滌緩沖液洗滌親和柱，最后用濃度為500mM咪唑的洗脫液洗滌親和柱，收集洗脫液。洗脫液于透析液(20mMTris-HCl，PH=8.0 ；0.85 (g/v)NaCl, 10% 甘油(v/v))中透析 24h 后 SDS-PAGE 檢測洗脫液中蛋白分布，合并含單一目的條帶的洗脫液即可得到重組β_瓊膠酶，其氨基酸序列見。用Bradford法測定目的蛋白的濃度，分裝后將蛋白凍于_20°C保存以備用。實(shí)施例7:重組β -瓊膠酶活性檢測及其酶學(xué)性質(zhì)將同樣大小的圓濾紙片放在2%的瓊脂糖平板上，分別取10微升未處理的純化的重組酶和沸水中煮5min的純化的重組酶滴在濾紙片上，37°C放置3h，然后用盧戈氏碘液染色，結(jié)果可在棕色背景上看到兩個(gè)明顯的透明圈(見附圖1)，說明純化的重組酶有活性且煮5min后仍有活性。用DNS試劑法測得此瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)如下:1、最適溫度為60°C2、溫度穩(wěn)定性:0°C -100°C下放置lh，其中0°C _50°C能保持90%的活性，60°C下還能保持30%的活性。3、最適 PH 為 6.04、PH穩(wěn)定性:PH=4 PH=Il緩沖液中放置12h，其中PH=4_9能保持87%的活性。5、不同離子對酶活的影響:重金屬離子如Fe3+、Mn2+、Cu2+、Ni2+對酶活有明顯的抑制作用，其他金屬離子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+以及β _巰基乙醇，尿素對酶活影響不大6、酶比活:在底物濃度為0.25%瓊脂糖，PH=6，60°C下測得酶比活為174.4U/mg7、酶促動力學(xué)參數(shù):Km=3.5mg/ml ；Vmax=llll.lU/mg實(shí)施例8:表達(dá)產(chǎn)物用于制備新瓊寡糖制備新瓊寡糖時(shí)，將瓊脂糖溶于20mM Tris-HCl緩沖液(PH=8.0)中配成濃度為
0.25%的溶液，按重組酶體積:反應(yīng)體系體積=1-2:1000加入實(shí)施例6中所得的重組β -瓊膠酶，混合均勻后，50。。溫浴24h,反應(yīng)不同時(shí)間(5min、lOmin、15min、30min、lh、3h、6h、12h、24h),于_20°C終止反應(yīng)，12000rpm離心lOmin,上清即作為薄層層析的樣品。薄層層析板使用前置于110°C烘箱中干燥lh。在層析板上距離底部Icm處用鉛筆劃出底線，將樣品ΙΟμΙ點(diǎn)于底線上，用風(fēng)筒吹干，置于自制層析缸中展層。展開劑配方為正丁醇:冰乙酸:水=2:1:1 (體積比)。待前沿線到達(dá)離層析板頂端Icm處時(shí)停止展層，烘箱中干燥。最后往層析板噴灑顯色劑(2% 二苯胺丙酮溶液5ml, 2%苯胺丙酮溶液5ml,三氯乙酸5g)，105°C烘箱中顯色。顯色結(jié)果顯示了降解產(chǎn)物隨時(shí)間的變化(見圖2)。根據(jù)以上結(jié)果，進(jìn)行降解產(chǎn)物一新瓊寡糖聚合度的分析，具體方法如下:同一塊薄層層析板上點(diǎn)一個(gè)樣品，展層結(jié)束后，遮住層析板的四分之三面積，只往剩下的四分之一上噴灑上述顯色劑進(jìn)行顯色。顯色后對照顯色部分的條帶，將未顯色部位的對應(yīng)條帶刮下，加入一定體積的去離子水浸泡，12000 rpm離心lOmin，取上清凍干后即作為做質(zhì)譜的樣品。質(zhì)譜分析表明降解過程能產(chǎn)生聚合度為4-10的新瓊寡糖，終產(chǎn)物為新瓊四糖和新瓊六糖。
權(quán)利要求
1. 一種β-瓊膠酶，所述的β-瓊膠酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.用于編碼權(quán)利要求1所述的瓊膠酶的基因，其核苷酸序列為SEQID Ν0:2。
3.—種重組表達(dá)載體，所述的重組表達(dá)載體用于表達(dá)利要求I所述的瓊膠酶。
4.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，插入有權(quán)利要求2所述的基因。
5.權(quán)利要求1所述的β-瓊膠酶在降解瓊膠制備新瓊寡糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-瓊膠酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1，編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明的β-瓊膠酶具有耐高溫的特性，能夠特異性地降解瓊膠產(chǎn)生聚合度為4-10的新瓊寡糖，終產(chǎn)物為新瓊四糖和新瓊六糖，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/56GK103194435SQ20131012238
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者史曉翀, 張曉華, 董素潔, 崔方元 申請人:中國海洋大學(xué)