與水稻耐逆性及水稻葉綠素含量相關(guān)的蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與水稻耐逆性及水稻葉綠素含量相關(guān)的蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為WSL蛋白，來自水稻品種Asominori，是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；（c）將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物葉綠素含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明對于進(jìn)一步闡明植物耐逆的分子機(jī)理并通過基因工程的技術(shù)和手段培育優(yōu)質(zhì)、耐逆的作物新品種具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】與水稻耐逆性及水稻葉綠素含量相關(guān)的蛋白及其編碼基因 和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與水稻耐逆性及水稻葉綠素含量相關(guān)的蛋白及其編碼基因和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是最重要的糧食作物之一，世界上一半以上人口以它為主食。水稻葉色突變 體是研究植物葉綠體發(fā)育、光形態(tài)建成和光合作用等過程的理想材料。在突變體的基礎(chǔ)上， 揭示葉綠體發(fā)育和形態(tài)建成的分子機(jī)制是提高水稻光能利用效率，增加產(chǎn)量的前提。另外， 葉綠體除了進(jìn)行光合作用以外，它還與細(xì)胞核以及線粒體存在著復(fù)雜的信號交流，以便協(xié) 同作用維持植物的正常生長發(fā)育。
[0003] PPR蛋白是一類植物中最大的蛋白家族之一，在水稻種具有480個成員，這類蛋白 一半都包含多個PPR重復(fù)序列。這個家族的大部分成員都定位于葉綠體或者線粒體中，但 是也有少數(shù)蛋白的定位未知。水稻種已經(jīng)報導(dǎo)的PPR蛋白到目前為止只有5個，其它成員 的功能及作用機(jī)制都不了解。已有報導(dǎo)顯示，PPR蛋白可以直接結(jié)合在某些前體RNA的特 定序列上，參與RNA的剪切、編輯、穩(wěn)定性調(diào)控及翻譯過程，在細(xì)胞質(zhì)雄性育性調(diào)控，胚胎形 成、細(xì)胞核與葉綠體間的信號傳遞，環(huán)境脅迫響應(yīng)等生物過程中發(fā)揮作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與水稻耐逆性及水稻葉綠素含量相關(guān)的蛋白及其編碼 基因和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為WSL蛋白，來自水稻品種Asominori，是如下（a)或 (b)或（c):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] (b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；
[0008] (c)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物葉綠素含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述（b)或（c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá) 得到。上述（b)或（c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中 缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在 其5'端和/或3'端連上標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0010] 編碼所述WSL蛋白的基因（WSL基因）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] 所述WSL基因是如下（1)或（2)或（3)或（4)或（5)的DNA分子：
[0012] (1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0013] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)的蛋白的 DNA分子；
[0014] (3)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物葉綠素含量相關(guān)的蛋 白的DNA分子；
[0015] (4)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼與與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；
[0016] (5)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼與與植物葉綠素含量相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0017] 所述嚴(yán)格條件為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜 交并洗膜。
[0018] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為抑制目的植物中編碼所述WSL蛋白 的基因的表達(dá)，得到耐逆性降低的轉(zhuǎn)基因植物。所述耐逆性具體可為耐鹽或耐脫落酸。
[0019] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為抑制目的植物中編碼所述WSL蛋白 的基因的表達(dá)，得到葉綠素含量降低的轉(zhuǎn)基因植物。
[0020] 所述"抑制目的植物中編碼所述WSL蛋白的基因的表達(dá)"是通過在所述目的植物 中導(dǎo)入干擾載體實(shí)現(xiàn)的；所述干擾載體為將特異DNA片段甲和特異DNA片段乙分別插入表 達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述DNA片段甲如序列表的序列2自5'末端第 1至629位核苷酸所示；所述DNA片段甲和所述DNA片段乙反向互補(bǔ)。
[0021] 所述表達(dá)載體具體可為pCUbil390- Λ FAD2載體。
[0022] 所述干擾載體具體可為如下重組質(zhì)粒：骨架載體為pCUbi 1390-Λ FAD2載體，在其 Sac I酶切位點(diǎn)正向插入了序列表的的雙鏈DNA片段，在其SnaB I酶切位點(diǎn)插入了與序列 表的序列2自5'末端第1至629位核苷酸所示的雙鏈DNA片段反向互補(bǔ)的雙鏈DNA片段。
[0023] 所述干擾載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注 射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成 植株。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為水稻，如水稻品種 Asominori 〇
[0024] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼所述WSL蛋白的基因?qū)氤?發(fā)植物，得到耐逆性增加的轉(zhuǎn)基因植物。所述耐逆性具體可為耐鹽或耐脫落酸。所述出發(fā) 植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，如水稻Asominori。
[0025] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼所述WSL蛋白的基因?qū)氤?發(fā)植物，得到葉綠素含量增加的轉(zhuǎn)基因植物。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物， 具體可為水稻，如水稻Asominori。
[0026] 含有所述WSL基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0027] 所述WSL蛋白在調(diào)節(jié)植物耐逆性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述耐逆性 具體可為耐鹽或耐脫落酸。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，如水稻 Asominori 〇
[0028] 所述WSL蛋白在調(diào)節(jié)植物葉綠素合成和/或降解中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，如水稻Asominori。
[0029] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，缺失WSL基因的植株葉色黃化，對ΑΒΑ敏感性增強(qiáng)，對脫落酸 的耐逆性減低，對鹽脅迫的耐逆性降低，葉綠素含量減低。即WSL蛋白參與調(diào)解植物耐逆 性、參與調(diào)節(jié)光合反應(yīng)效率，與葉綠素含量相關(guān)。本發(fā)明對于進(jìn)一步闡明植物耐逆的分子機(jī) 理并通過基因工程的技術(shù)和手段培育優(yōu)質(zhì)、耐逆的作物新品種具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí) 意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖 1 為 pCUb i 1390- Λ FAD2 載體圖譜。
[0031] 圖2為正常條件培育時植株的表型。
[0032] 圖3為正常條件培育時植株的葉綠素含量。
[0033] 圖4為植株在ΑΒΑ或NaCl脅迫條件下生長的表型。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。N6 培養(yǎng)基：購自美國 PhytoTechnology Laboratories，貨號為 C167。
[0035] 通過篩選、序列比對、功能驗(yàn)證等程序，從水稻品種Asominori (Wu W, Zheng XM, Lu G, Zhong Z, Gao H, Chen L, Wu C, Wang HJ, Wang Q, Zhou K, Wang JL, Wu F, Zhang X，Guo X，Cheng Z，Lei C，Lin Q，Jiang L, Wang H，Ge S, Wan J (2013) Association of functional nucleotide polymorphisms at DTH2with the northward expansion of rice cultivation in Asia. Proc Natl Acad Sci U S A. 19; 110 (8): 2775-80,公眾可從中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)中發(fā)現(xiàn)一個新蛋白，將其命名為WSL蛋白。WSL蛋白如序列 表的序列1所示。將編碼WSL蛋白的基因命名為WSL基因，其cDNA的開放閱讀框如序列表 的序列2所示。
[0036] 根癌農(nóng)桿菌 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105):參考文 獻(xiàn)：New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Hood,Elizabeth E;Gelvin, Stanton B;Melchers, Leo S;Hoekema,Andre. Transgenic Research, 2(4) :p. 208-218-218 (1993).;公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0037] pCUbil390_ Λ FAD2 載體（參見圖 1)，記載在如下文獻(xiàn)中：Wax crystal-sparse leaf2, a rice homologue of WAX2/GL1, is involved in synthesis of leaf cuticular wax.Mao B.,et al.(2012).Planta235:39 - 52.;公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究 所獲得。
[0038] 實(shí)施例1、WSL基因抑制表達(dá)植株的獲得和鑒定
[0039] 一、WSL基因 RNA干擾載體(重組質(zhì)粒pCUbil390- Λ FAD2-WSL)的構(gòu)建
[0040] 1、WSL基因干擾片段的獲得
[0041 ] (1)使用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(購自天根生化科技(北京）有限公 司），提取水稻Asominori (Oryza sativa)的14天幼苗的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。
[0042] (2)以步驟（1)得到的cDNA為模板，用WSL-sense-F和WSL-sense-R組成的引物 對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0043] WSL-sense-F:5' -TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTG ATGGAGGCCGCCGCGTCGCTG-3' ；
[0044] WSL-sense-R: 5，-CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTC GTGTAACCCTGCTTCAACTTCATGC-3，。
[0045] (3)以步驟（1)得到的 cDNA 為模板，用 WSL-antisense-F 和 WSL-antisense-R 組 成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0046] WSL-antisense-F:5' -CGGGGATCCGTCGACTAC ATGGAGGCCGCCGCGTCGCTG-3' ；
[0047] WSL-antisense-R:5' -AGGTGGAAGACGCGTTAC GTGTAACCCTGCTTCAACTTCATGC-3'。
[0048] 2、WSL基因 RNA干擾載體(重組質(zhì)粒pCUbil390- Λ FAD2-WSL)的構(gòu)建
[0049] (1)用限制性內(nèi)切酶Sac I酶切pCUbil390-AFAD2載體，回收約12060bp的線性 質(zhì)粒。
[0050] (2)采用clontech infusion kit (大連寶生物公司，按說明書操作）將步驟1的 (2) 得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過同源重組整合入步驟（1)得到的線性質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒 pCUbil390- Λ FAD2-sense-WSL。
[0051] (3)用限制性內(nèi)切酶SnaB I酶切重組質(zhì)粒pCUbil390- Λ FAD2-sense-WSL，回收 約12689bp的線性質(zhì)粒。
[0052] (4)采用clontech infusion kit (大連寶生物公司，按說明書操作）將步驟1的 (3) 得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過同源重組整合入步驟（3)得到的線性質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒 pCUbil390- Λ FAD2-WSL。
[0053] 根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pCUbil390-AFAD2_WSL進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：骨架載體 為pCUbil390- Λ FAD2載體，在其Sac I酶切位點(diǎn)正向插入了序列表的序列2自5'末端第 1至629位核苷酸所示的雙鏈DNA片段，在其SnaB I酶切位點(diǎn)插入了與序列表的序列2自 5'末端第1至629位核苷酸所示的雙鏈DNA片段反向互補(bǔ)的雙鏈DNA片段。
[0054] 二、WSL基因抑制表達(dá)植株的獲得
[0055] 1、將重組質(zhì)粒pCUbil390- Λ FAD2-WSL導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105,得到重組農(nóng)桿菌 EHA105/pCUbil390- Λ FAD2-WSL。
[0056] 2、WSL基因抑制表達(dá)植株的獲得
[0057] 將 EHA105/pCUbil390- Λ FAD2-WSL 轉(zhuǎn)入水稻 Asominori (以下簡稱野生型水稻） 胚的愈傷組織中，具體步驟如下：
[0058] (1)用含50 μ mol/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基懸浮重組農(nóng)桿菌EHA105/ pCUbil390- Λ FAD2-WSL，得到 0D6(l(lmi ?5 的菌懸液。
[0059] (2)取水稻Asominori的成熟胚愈傷組織與步驟（1)得到的菌懸液混合，侵染 30min，用濾紙吸干菌液后將愈傷組織放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含0. 03924mg/L乙酰丁香酮的 固體N6培養(yǎng)基）上，24°C培養(yǎng)3天。
[0060] (3)將步驟（2)得到的愈傷接種至含150mg/L G418的固體N6培養(yǎng)基上，24°C培養(yǎng) 16天。
[0061] (4)取步驟（3)得到的健康愈傷，接種至含200mg/L G418的固體N6培養(yǎng)基上，24°C 培養(yǎng)，每15天繼代一次。
[0062] (5)取步驟（4)得到的健康愈傷，接種至分化培養(yǎng)基(含150mg/L G418、2mg/L激 動素、0. 05mg/L萘乙酸的固體N6培養(yǎng)基）上，24°C培養(yǎng)45天(此時植株地上部分高度約為 15cm)，打開瓶口煉苗3天，然后移栽至溫室栽培，即為?；代植株。
[0063] (6)將?；代植株自交，收獲種子并培育為植株，即為1\代植株。
[0064] (7)將?；代植株和?\代植株提取基因組DNA并采用1390-F和FAD2-R組成的引 物對進(jìn)行PCR鑒定。1390-F對應(yīng)于圖1的10707-10730bp，F(xiàn)AD2-R引物對應(yīng)于圖1中的第 10827-10846bp，如果擴(kuò)增出大小約為728bp的條帶，則說明為陽性植株。
[0065] 1390-F :5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3' ；
[0066] FAD-R :5, -GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3,。
[0067] 對于某一 ?；代植株，如果該植株及其?\代植株P(guān)CR鑒定均為陽性，該植株為純合 的WSL基因抑制表達(dá)植株，該植株及其自交后代為一個WSL基因抑制表達(dá)株系。共得到41 個WSL基因抑制表達(dá)株系。
[0068] 三、轉(zhuǎn)空載體水稻的獲得
[0069] 用 pCUbil390- Λ FAD2 載體代替重組質(zhì)粒 pCUbil390- Λ FAD2-WSL 進(jìn)行步驟二， 得到轉(zhuǎn)空載體植株。
[0070] 四、在正常培養(yǎng)的條件下的表型和葉綠素含量
[0071] 將?\代WSL基因抑制表達(dá)植株(隨機(jī)取的一個WSL基因抑制表達(dá)株系，命名為 RNAi-3)、I\代轉(zhuǎn)空載體植株和水稻品種Asominori (用WT表示）的種子(每個株系30粒種 子）浸泡3天后播種于培養(yǎng)土中，生長10天拍照并測量葉綠素含量。
[0072] 葉綠素測定方法參照（Wu Z, Zhang X，He B, Diao L, Sheng S, Wang J, Guo X，Su N, Wang L, Jiang L, Wang C, Zhai H, Wan J. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis.Plant Physiol. 2007S印；145 (1) : 29-40)。
[0073] 表型照片見圖2，B為A的局部放大圖。水稻品種Asominori與轉(zhuǎn)空載體植株的表 型一致。與水稻品種Asominori相比，WSL基因抑制表達(dá)植株的葉片邊緣白化。
[0074] 葉綠素（Chi)含量的檢測結(jié)果見圖3C (FW代表鮮重)。葉綠素 a (Chi a)的含量 和葉綠素 b (Chi b)的含量的比值見圖3D。水稻品種Asominori與轉(zhuǎn)空載體植株的葉綠素 含量一致，葉綠素 a的含量和葉綠素 b的含量的比值也一致。WSL基因抑制表達(dá)植株的葉綠 素含量顯著低于水稻品種Asominori，但葉綠素 a的含量和葉綠素 b的含量的比值沒有顯著 差異。
[0075] 五、對ΑΒΑ的耐受性
[0076] 將?\代WSL基因抑制表達(dá)植株(隨機(jī)取的一個WSL基因抑制表達(dá)株系，命名為 RNAi-3)、I\代轉(zhuǎn)空載體植株和水稻品種Asominori (用WT表示）的種子(每個株系50粒種 子）浸泡3天后播種于MS培養(yǎng)基中，從種子萌發(fā)開始計時，培養(yǎng)4天后將幼苗轉(zhuǎn)移至含有 1. 5 μ Μ ΑΒΑ的MS培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)10天，觀察表型并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0077] 照片見圖4A。水稻品種Asominori與轉(zhuǎn)空載體植株的表型一致。水稻品種 Asominori的長勢顯著優(yōu)于WSL基因抑制表達(dá)植株。結(jié)果表明，抑制WSL基因表達(dá)后植株對 ΑΒΑ的耐受性降低了。
[0078] 五、對NaCl的耐受性
[0079] 將?\代WSL基因抑制表達(dá)植株(隨機(jī)取的一個WSL基因抑制表達(dá)株系，命名為 RNAi-3)、I\代轉(zhuǎn)空載體植株和水稻品種Asominori (用WT表示）的種子(每個株系50粒種 子）浸泡3天后播種于含有150mM NaCl的MS培養(yǎng)基并培養(yǎng)10天，觀察表型并拍照。實(shí)驗(yàn) 重復(fù)3次。
[0080] 照片見圖4B。水稻品種Asominori與轉(zhuǎn)空載體植株的表型一致。水稻品種 Asominori的長勢顯著優(yōu)于WSL基因抑制表達(dá)植株。結(jié)果表明，抑制WSL基因表達(dá)后植株對 NaCl的耐受性降低了。
[0001] 序列表 <110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 <120〉與水稻耐逆性及水稻葉綠素含量相關(guān)的蛋?及其編碼基因和應(yīng)用 <130> CGGNAY132333 <160> 2 <210> 1 <211> 650 <212〉 PRT <213> 水稻 Asominori <400> 1 Met Glu Ala Ala Ala Ser Leu Pro Leu Pro Ala Ser Arg Phe Leu Ser 15 10 15 Pro Pro Pro His Pro Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys 20 25 30 Ser Arg Arg Asn lie Ser Cys Ala Arg Ala Ala Pro Arg Ala Leu Glu 35 40 45 Ala Pro Gin Ala Ser Arg Pro Pro Pro Arg Pro Ser Pro Arg Arg Ser 50 55 60 Ala Val Ala Glu Val Lys Ala Ala Pro Asp Pro Val Ala Ala Leu Thr 65 70 75 80 Arg Phe Glu Asp Val Leu Gin Thr Gin Asp Cys Asn lie lie Leu Arg 85 90 95 His Tyr Gly Glu Thr Arg Arg Trp Asp Glu Leu Ser Lys Val Phe Gly 100 105 110 Trp Met Gin Glu His Asp Met Leu Asn ile Ala Ser Tyr Ser Ser Tyr 115 120 125
[0002] Phe Lys Tyr Leu Gly Leu Ser Arg Asn Pro Ala Arg Ala Leu Gin Val 130 135 140 Tyr Gly Ala lie Arg Gin Asn Pro Thr Arg lie His Val Ser Val Cys 145 150 155 160 Asn Ser Val Leu Gly Cys Leu Val Lys Asn Gly Arg Phe Asp Ser Ser 165 170 175 Phe Lys Leu Tyr Asp Glu Met lie Arg Glu Gly Leu Ser Pro Asp Leu 180 185 190 Phe Thr Tyr Ser Thr Leu Leu Ser Gly Cys Met Lys Leu Lys Gin Gly 195 200 205 Tyr Thr Lys Ala Met Glu Leu Val Asn Glu Leu Asn Ser Arg Gly Phe 210 215 220 Gin Met Asp Ser Val lie Tyr Gly Thr Leu Leu Ala lie Cys Ala Ser 225 230 235 240 His Asn Cys Cys Glu Lys Ala Glu Glu Tyr Phe Gin Lys Met Lys Asp 245 250 255 Glu Gly His Lys Pro Asn Leu Phe His Tyr Ser Ser Leu Leu Asn Ala 260 265 270 Tyr Ser Glu Asn Ala Asn Tyr Glu Lys Ala Asp Leu Leu Met Lys Asp 275 280 285 Leu Arg Ser Ser Gly Leu Thr Pro Asn Lys Val lie Leu Thr Thr Leu 290 295 300 Leu Lys Val Tyr Ser Lys Gly Gly Leu Phe Glu Lys Ala Arg Glu Leu 305 310 315 320 Leu Thr Glu Leu Glu Ala Ser Gly Phe Ala Gin Asp Glu Met Pro Tyr 325 330 335 Cys lie Leu lie Asp Gly Leu Val Lys Glu Arg Lys lie Trp Glu Ala 340 345 350 Met lie Leu Phe Asn Asp Met Lys Glu Lys Gly Val Lys Ser Asp Gly 355 360 365
[0003] Tyr Ala Phe Ser lie Met lie Ser Ala Leu His Arg Gly Gly Tyr Arg 370 375 380 Glu Glu Ser Lys Gin Leu Ala Lys Glu Phe Glu Ala Lys Asn Ala Thr 385 390 395 400 Tyr Asp Leu Val Met Leu Asn Thr Ser Leu Arg Ala Tyr Cys Ser Thr 405 410 415 Asn Asp Met Glu Ser Val Met lie Met Leu Arg Lys Met Asp Glu Ser 420 425 430 Asn lie Ser Pro Asp Ala lie Thr Phe Asn Thr Leu Tie Arg Tyr Phe 435 440 445 Cys Met Ala Lys Val Tyr His Leu Ala Tyr Lys Thr lie Gin Asp Met 450 455 460 His Thr Lys Gly His Gin Leu Asn Glu Glu Leu Cys Ser Glu lie Met 465 470 475 480 Met Gin Leu Gly Glu Ala Gly Phe Pro Ser Glu Ala Phe Ser Val Tyr 485 490 495 Asn Met Leu Arg Tyr Gly Lys Arg Thr Val Cys Lys Ser Leu His Glu 500 505 510 Lys Val Leu Cys lie Leu Val Pro Ala Gly Leu Leu Lys Asp Ala Tyr 515 520 525 Val Val Val Lys Asp Asn Ser Glu Phe lie Ser Arg Arg Ser Leu Gly 530 535 540 Asn Phe Ala Arg Ser Phe Met Ala Ser Gly Asn lie Asn Leu lie Asn 545 550 555 560 Asp Val Met Lys Ala Val His Arg Ser Gly Trp Arg lie Ser Gin Asp 565 570 575 lie Phe Gly Lys Ala lie Gin Arg Tyr lie Gin Lys Pro Asp Lys Lys 580 585 590 Gin Leu Leu Leu Cys Leu Leu Asp Trp Met Thr Gly Gin Gly Tyr Ser 595 600 605
[0004] Val Asp Scr Scr Scr Arg Asn Leu Leu Leu Arg Asn Ala Gin Leu Phe 610 615 620 Gly Gin Lys Gin Leu lie Ala Glu lie Leu Ser Lys Gin Gin Gly Ala 625 630 635 640 Ser Arg lie Thr Ser Gin Arg His Gin Lys 645 650 <210〉 2 <211〉 1953 <212> DNA <213> 水稻 Asominori <400〉 2 atggaggccg ccgcgtcgct gccgctcccc gcctcccgct tcctctcccc tcctcctcat 60 ccaacgccag cggcggcggc ggcggcggcg tgctgctccc gacggaacat ctcctgcgcc 120 cgcgccgccc cccgggcgct ggaagccccg caggcctcga ggccgccacc gcggccgtcg 180 cclcggcgca gcgccglcgc ggaggtcaag gccgcccccg accccglcgc cgcaclcacc 240 aggttcgagg atgtgctgca gficficiiggac tgcaficatafi tcctgcgcca ctacggtgaa 300 accaggcgct gggatgaget atctaaggtc ttcgggtgga tgeaggagea cgacatgctc 360 aacattgcgt cttacagcag ttacttcaag taccttgggt tgagccgcaa ccctgcccga 420 gcgctgcaag tgtacggtgc tatccgagaa aacccgacaa ggatccatgt ctccgtttgt 480 aactcggtcc tcgggtgctt ggtgaagaac gggaggttcg atageagett caagctttat 540 gatgagatga taegagaagg tctatcaccc gatctgttca cctacagtac ccttctgtca 600 gggtgcatga agttgaagca gggttacact aaggccatgg aattagttaa tgagctgaat 660 tcccgtggtt ttcagatgga tagtgtaata tatggcactc tcctggctat atgegegtea 720 cataactgct gegagaagge tgaggaatat tttcagaaaa tgaaggaega aggacacaag 780 cctaatctat tccatta/tag ctctctgttg aatgeatatt cagaaaatgc taattatgaa 840 aaggctgatc tgttgatgaa agatttgagg tcctcagggt taacaccgaa caaggttata 900 ctcaccactt tgttaaaggt gtattctaaa ggtggtctct ttgagaagge aagggaactg 960 ctaactgaac tggaagette aggct.tcgca caggatgaga tgccttactg catattgatt 1020 gatggccttg tcaaagaacg gaagatatgg gaagccatga ttctatttaa tgatatgaaa 1080
[0005] gaaaaaggtg tcaaatctga tggctatgca ttcagtatca tgatatcagc attacatcga 1140 ggLggctatc gtgaagagLc fcuuiacaaci L gcaatiagtuiL tlgaggccaa gaatgcaaca 1200 tatgatctgg ttatgcttaa tacatcactt cgtgcttact gcagcaccaa tgatatggaa 1260 agtgtaatga tcatgcttag gaaaatggat gaatcgaaca tatcgcctga tgctatcaca 1320 tttaatacct taataaggta cttctgcatg gcaaaggtct atcacctagc atacaagaca 1380 attcaagata tgcatacaaa gggccatcaa ttgaatgagg agctttgttc tgagataatg 1440 atgcagctag gagaagcggg ttttccttct gaagcatttt ctgtgtataa tatgttgaga 1500 tatggaaaga gaacagtgtg taaatc.tctt catgagaagg ttttatgtat cttagttcca 1560 gctggacttc tcaaggatgc atacgtagtt gttaaggaca attccgagtt catatctcga 1620 cgctcgctgg ggaattttgc tagatctttc atggcatcag gcaacataaa tttgattaac 1680 gatgttatga aagcagtaca ccgttcagga tggcgtatta gccaggatat ctttgggaaa 1740 gcaattcagc gatacattca gaaacct.gat aagaagcagc tactgctttg cctcttggac 1800 t.ggatgactg gtcaaggcta ttctgtggac tcatcatcaa ggaacttgct tttgagaaat 1860 gcccaactct ttggccaaaa gcaacttat.a gctgaaatcc tttccaagca gcagggagca 1920 tcaaggatca caagtcaaag gcaccaaaaa tag 1953
【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下（a)或（b)或（c): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)； (c) 將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物葉綠素含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下（1)或（2)或（3)或（4)或 (5)的DNA分子： (1) 編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)的蛋白的DNA 分子； (3) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物葉綠素含量相關(guān)的蛋白的 DNA分子； (4) 與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同 源性且編碼與與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (5) 與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同 源性且編碼與與植物葉綠素含量相關(guān)蛋白的DNA分子。
4. 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為抑制目的植物中編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因的 表達(dá)，得到耐逆性降低的轉(zhuǎn)基因植物。
5. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為抑制目的植物中編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因的 表達(dá)，得到葉綠素含量降低的轉(zhuǎn)基因植物。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述"抑制目的植物中編碼權(quán)利要求1 所述蛋白的基因的表達(dá)"是通過在所述目的植物中導(dǎo)入干擾載體實(shí)現(xiàn)的；所述干擾載體為 將特異DNA片段甲和特異DNA片段乙分別插入表達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì) 粒；所述DNA片段甲如序列表的序列2自5'末端第1至629位核苷酸所示；所述DNA片段 甲和所述DNA片段乙反向互補(bǔ)。
7. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因?qū)氤霭l(fā)植物， 得到耐逆性增加和/或葉綠素含量增加的轉(zhuǎn)基因植物。
8. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
9. 權(quán)利要求1所述蛋白在調(diào)節(jié)植物耐逆性中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1所述蛋白在調(diào)節(jié)植物葉綠素合成和/或降解中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK104098661SQ201310122668
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月10日
【發(fā)明者】萬建民, 吳赴清, 譚俊杰, 譚振華, 林啟冰, 王潔, 王久林, 程治軍, 郭秀平, 張欣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所