專利名稱：一種腺病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70 90nm的顆粒，由252個(gè)殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體、12個(gè)五聯(lián)體及12根纖毛，除此之外還有其他一些小蛋白，如V1、VII1、IX、IIIa和IVa2等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個(gè)三角形面的主要蛋白，12個(gè)頂端是5個(gè)五聯(lián)體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。自上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)血清型，其中人腺病毒迄今已發(fā)現(xiàn)有58種，分為A、B、C、D、E和F六個(gè)亞群。腺病毒對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可感染，但大多數(shù)腺病毒對于正常人，并不能引起致死性的感染，對于一些免疫抑制的病人(如HIV和骨髓移植)，腺病毒感染是引起死亡的主要原因之一，而且這些感染不分病毒型別，均有致死性。因此，開發(fā)一種新型的能夠檢測出所有已知腺病毒的快速檢測試劑是非常必要的。我國以及其它國家大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示，腺病毒又具有明顯的季節(jié)和地域流行特征，其中尤以B亞群的Adv3，7，11，14，16,21以及E亞群的Adv4發(fā)病率高，而且往往造成爆發(fā)流行。傳統(tǒng)腺病毒診斷檢測方法通常依賴病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢查，病毒分離費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性和準(zhǔn)確度差，而且一些腺病毒至今尚不能有效分離，血清學(xué)不僅靈敏度和特異性差，而且在腺病毒易感的兩個(gè)人群(免疫抑制人群和兒童)中均存在取樣依從性差的問題。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)在腺病毒檢測中的廣泛應(yīng)用，為臨床病原體的檢測提供了一種快速、特異、敏感、高效的手段，特別是TaqMan熒光定量PCR技術(shù)在腺病毒的檢測和分型中越來越顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)開發(fā)了多種基于常規(guī)PCR和熒光定量PCR的腺病毒通用檢測方法，但這些方法或只能進(jìn)行腺病毒的通用檢測，或只能按照腺病毒的亞群進(jìn)行病毒分型檢測。大量研究發(fā)現(xiàn)，由于TaqMan熒光定量PCR靈敏度非常高，在樣本熒光定量檢測過程中，很容易受到一些因素的影響而使結(jié)果不準(zhǔn)確:(I)樣本中存在許多物質(zhì)，會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，如糞便標(biāo)本中的膽鹽、血液中的血紅素及尿中的尿素等；(2)試驗(yàn)操作人員的操作失誤會造成樣本核酸的丟失，從而導(dǎo)致目的核酸量減少而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；(3)樣本分離過程中殘留的提取試劑如乙醇和酚等也能夠抑制擴(kuò)增反應(yīng)；(4)反應(yīng)系統(tǒng)的影響因素，如不合適的儲存條件所造成的目的片段降解、酶活性下降等導(dǎo)致的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，在做核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要設(shè)置嚴(yán)格的內(nèi)參照品來監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)行。根據(jù)所加內(nèi)標(biāo)物的不同，可分為外標(biāo)法定量PCR和內(nèi)標(biāo)法熒光定量PCR。由于外標(biāo)法存在不同標(biāo)本間擴(kuò)增效率的差異和標(biāo)本提取的細(xì)微變化都將導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的巨大差異，為了清除這種影響，國內(nèi)外都推崇采用內(nèi)標(biāo)法，即在試劑中加入競爭性或非競爭性內(nèi)標(biāo)，可有效檢測核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析中出現(xiàn)的誤差，從而避免假陰性結(jié)果。競爭性內(nèi)標(biāo)是在同一反應(yīng)內(nèi)，采用兩對不同的引物，同時(shí)擴(kuò)增來自檢測靶序列和內(nèi)標(biāo)序列，該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是制備簡單，可在一定程度上排除樣本間的差異，但有時(shí)存在目標(biāo)序列所用擴(kuò)增引物和探針與內(nèi)參序列所用引物和探針競爭的情況發(fā)生。而競爭性內(nèi)標(biāo)，則是構(gòu)建一個(gè)與靶序列相同的擴(kuò)增效率和引物結(jié)合微點(diǎn)僅探針結(jié)合位點(diǎn)不同的內(nèi)標(biāo)，在同一反應(yīng)管內(nèi)，靶基因與內(nèi)標(biāo)物和引物競爭性結(jié)合，進(jìn)行同步擴(kuò)增。不管是競爭性內(nèi)標(biāo)還是非競爭性內(nèi)標(biāo)，主要采用三種形式:1)質(zhì)?；駾NA、RNA片段:這種形式的內(nèi)標(biāo)制備簡單，但往往不穩(wěn)定，而且質(zhì)粒極易形成氣溶膠，很容易造成PCR過程的污染，特別是由于是DNA片段，往往不參與樣本提取的過程，只在熒光定量PCR的過程中加入，因此只能監(jiān)控PCR過程，而不能監(jiān)控樣本提取質(zhì)量的好壞。目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的腺病毒熒光定量PCR檢測的論文，主要是采用質(zhì)粒作為內(nèi)參照品或質(zhì)控品；2)病毒顆粒:主要包括減毒、滅活病毒或陽性患者血漿和血清，采用這些病毒顆粒作為內(nèi)參照品，可以監(jiān)控病毒顆粒的釋放和核酸提取效率，彌補(bǔ)了質(zhì)粒DNA或裸露DNA、RNA片段作為內(nèi)參品或質(zhì)控品的不足，但由于常規(guī)病毒顆粒制備運(yùn)輸困難，而且對于一些來源于病人標(biāo)本的病毒顆粒(HBV和HCV)也存在倫理學(xué)的問題，因此較少用；3)病毒樣顆粒:某些病毒如MS2噬菌體、絲狀噬菌體、Lamda噬菌體和煙草花葉病毒(TMV)的外殼可以耐受RNase和DNase的作用，因此可將外源性的靶序列包裹到這些病毒的外殼內(nèi)，就可以使其免受環(huán)境中的RNase和DNase的降解。這一技術(shù)比較經(jīng)典的是基于MS2噬菌體的ArmoredRNA技術(shù)制備的質(zhì)控品，由于這種病毒樣顆粒的穩(wěn)定性高，而且也容易制備，并在最大程度上模擬天然病毒，因此已經(jīng)在Roche和Abbott等公司的RNA診斷產(chǎn)品中廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用的、便捷的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。`本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒的使用方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、引物探針組合、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，還包括核酸提取用液及核酸提取用內(nèi)參照品；所述內(nèi)參照品為滅活的T4噬菌體，所述引物探針組合包括腺病毒核酸用引物探針及內(nèi)參照品用引物探針，所述內(nèi)參照品用引物探針為:SEQ ID NOl:CCATCCATAGAGAAAATATCAGAACGA ；SEQ ID N02:TAAATAATTCCTCTTTTCCCAGCG ；SEQ ID N03:AACCAGTAATTTCATCTGCTTCTGATGTGAGGC,其 5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，
3’端連接熒光淬滅基團(tuán)。進(jìn)一步地，所述腺病毒核酸用引物探針包括通用型引物探針:SEQ ID N04:GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT ；
SEQ ID N05:GCCCCAGTGGTCTTACATCATGCACATC ；SEQ ID N06: TGCACCAGACCCGGGCTCAGGAGGTACTCCGA,其 5’ 端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，3’
端連接熒光淬滅基團(tuán)。進(jìn)一步地，所述腺病毒核酸用引物探針還包括B和E亞群分型引物探針:SEQ ID N07:GATGGCCACCCCATCGATGMTGCSEQ ID N08:GCGAACTGCACCAGACCCGGACSEQ ID N09:TACATGCACATCGCCGGACAGGAMGCTTCGGAGT，其5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，
3’端連接熒光淬滅基團(tuán)。進(jìn)一步地，所述5’端熒光報(bào)告基團(tuán)為R0X、FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5，3’端熒光萃滅基團(tuán)為 TAMRA、BHQ1、BHQ2 或 BHQ3。進(jìn)一步地，所述核酸提取用液包括裂解液、核酸結(jié) 合液、洗滌液，其中:裂解液主要是由如下組份組成:胍鹽濃度為5-8M ;Tris-HCl濃度為IO-1OOmM, pH值為5.0-6.7 ;EDTA濃度為IO-1OOmM ;核酸結(jié)合液是由非結(jié)晶的二氧化硅經(jīng)鹽酸處理配制而成；洗滌液是用DEPC處理的去離子水配制70%的乙醇。上述腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒的使用方法，包括熒光定量PCR檢測反應(yīng)，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)前還采用所述核酸提取用液進(jìn)行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取過程中加入所述內(nèi)參照品，對應(yīng)地，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)中加入所述的內(nèi)參照品用引物探針。由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下有益效果:(I)相對以往發(fā)表的文獻(xiàn)(只提供擴(kuò)增方法，在提取上采用商品化的提取試劑)，本試劑盒提供從核酸提取以及PCR擴(kuò)增的全過程試劑，按照此試劑盒進(jìn)行操作，不需要其它額外試劑就可完成腺病毒的檢測工作，具有便捷的特點(diǎn)。同時(shí)，以往方法往往采用質(zhì)粒作為內(nèi)參照品，且質(zhì)粒不參與核酸提取的過程，而本發(fā)明采用滅活的T4噬菌體作為核酸提取用內(nèi)參照品，同時(shí)針對T4噬菌體設(shè)計(jì)特異性的引物探針，在樣本提取前就把T4噬菌體加入到樣品中，這樣加入的T4噬菌體可與可能出現(xiàn)的病毒核酸一同被提取出來，通過檢測T4噬菌體核酸提取量的多少以及提取的核酸樣本中是否含有抑制下游PCR反應(yīng)的物質(zhì)，因此就可以監(jiān)控樣本提取過程是否有效，滅活的T4噬菌體具有制備方便、成本低廉且穩(wěn)定的特點(diǎn)。(2)通過針對腺病毒的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性的引物探針，可用于腺病毒所有血清型的檢測。(3)通過針對常見流行的AdvB和AdvE兩個(gè)亞群的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性的引物探針，引物和探針與其它血清型的腺病毒反應(yīng)無交叉，只特異性地檢測AdvB和AdvE兩個(gè)亞群。(4)該試劑盒不僅可以完成對所有腺病毒的檢測，而且還可以對引起常見流行的AdvB和AdvE兩個(gè)亞群的腺病毒進(jìn)行分型檢測。(5)核酸提取用液可以在15min內(nèi)從糞便、血清以及口腔拭子等標(biāo)本中提取高質(zhì)量的核酸，滿足下游PCR反應(yīng)需求。下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖1是從口腔拭子中檢測腺病毒7型的檢測結(jié)果示意圖；其中Ia為分型引物探針檢測陽性質(zhì)控，Ib為通用引物探針檢測陽性質(zhì)控，Ic為分型引物探針檢測Adv7，Id為通用引物探針檢測Adv7，Ie為內(nèi)參照品，If為陰性質(zhì)控；圖2是從糞便標(biāo)本中檢測腺病毒40型的檢測結(jié)果示意圖；其中2a為通用引物探針檢測陽性質(zhì)控，2b為分型引物探針檢測陽性質(zhì)控，2c為通用引物探針檢測Adv40，2d為內(nèi)參照品，2e為陰性質(zhì)控；圖3是從血清標(biāo)本中檢測腺病毒3型的檢測結(jié)果示意圖；其中3a為分型引物探針檢測陽性質(zhì)控，3b為通用引物探針檢測陽性質(zhì)控，3c為分型引物探針檢測Adv3，3d為通用引物探針檢測Adv3，3e為內(nèi)參照品，3f為陰性質(zhì)控；圖4是試劑盒的非特異性檢測結(jié)果示意圖；其中4a為分型引物探針檢測陽性質(zhì)控，4b為通用引物探針檢測陽性質(zhì)控，4c為內(nèi)參照品，4d為非特異性檢測樣品；圖5是試劑盒的通用引物探針靈敏度檢測結(jié)果示意圖(圖中自左至右所對應(yīng)的病毒滴度依次為 IO7, IO6, IO5, IO4, IO3TCID50M )。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明的一種腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，包括核酸提取用液(裂解液、核酸結(jié)合液、洗滌液)、PCR反應(yīng)液、引物探針組合、核酸提取用內(nèi)參照品、陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品。( I)裂解液裂解液是主要由如下組份組成:胍鹽(異硫氰酸胍、鹽酸胍)，濃度為5-8M;Tris-HCl 濃度為 IO-1OOmM, pH 值為 5.0-6.7 之間，EDTA 濃度為 IO-1OOmM0(2)核酸結(jié)合液核酸結(jié)合液是由非結(jié)晶的二氧化硅經(jīng)鹽酸處理配制而成，在酸性條件下，經(jīng)裂解液裂釋放的病毒核酸可以結(jié)合到結(jié)合酸結(jié)合液中的二氧化硅顆粒上。(3)洗滌液用DEPC處理的去離子水配制70%的乙醇。(4) PCR 反應(yīng)液包括Tris-HCl, 5_50mM，pH 為 8.0-8.5，KCl 濃度在 50_100mM 之間，MgCl2 濃度在
1.5-5.0mM 之間，dNTP (0.2-0.5 μ M),化學(xué)修飾的熱啟動酶(0.0125-0.125Units/y I) ,UNG酶(0.5-1.0Unit/ 反應(yīng))，非離子變性劑(Tween-20, Triton X-100, NP40) (0.05-0.1%)等。( 5 )引物探針組合(包括腺病毒核酸用弓丨物探針及內(nèi)參照品用引物探針)引物和探針是根據(jù)靶基因序列合成的特異性的寡核苷酸片段，均經(jīng)HPLC純化，探針在5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，常見的熒光基團(tuán)為FAM、VIC、HEX、Cy3、Cy5和R0X，探針在3’端標(biāo)記萃滅基團(tuán)，常見的萃滅基團(tuán)為TAMRA、BHQU BHQ2和BHQ3，引物和探針在PCR反應(yīng)體系中的濃度為200-900nM。本發(fā)明所用的引物和探針序列如下:針對T4噬菌體的rIIA基因(X52686.1)設(shè)計(jì)引物和探針，該引物探針與人基因組無交叉，相關(guān)序列如下，核苷酸位置為該引物或探針在X52686.1序列上的位置:SEQ ID NOl:CCATCCATAGAGAAAATATCAGAACGA (2165-2139)；
SEQ ID N02:TAAATAATTCCTCTTTTCCCAGCG (2088-2065)；SEQ ID N03:HEX-AACCAGTAATTTCATCTGCTTCTGATGTGAGGC-BHQI (2122-2090)。針對所有腺病毒hexon基因在所有腺病毒的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，該引物和探針可檢測所有已知的58個(gè)腺病毒血清型。SEQ ID N04:GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT ；SEQ ID N05:GCCCCAGTGGTCTTACATCATGCACATC ；SEQ ID N06:FAM-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGAGGTACTCCGA_BHQ1。針對所有腺病毒B和E兩個(gè)亞群hexon基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，該引物和探針可檢測已知的腺病毒B和E兩個(gè)亞群，而不能檢測A，C，D, F亞群，引物探針序列如下，核苷酸位置為該引物或探針在JX423388.1序列上的位置。SEQ ID N07:GATGGCCACCCCATCGATGMTGC (18351-18373)；SEQ ID N08:GCGAACTGCACCAGACCCGGAC (18446-18425)；SEQ ID N09:R0X-TACATGCACATCGCCGGACAGGAMGCTTCGGAGT-BHQ2 (18385-18418)。(6)內(nèi)參照品是經(jīng)大腸桿菌培養(yǎng)的T4噬菌體，并經(jīng)加熱和紫外線雙重滅活，并經(jīng)大腸桿菌增殖確保100%滅活。在使用試劑盒提取樣本核酸前，按照5-50 μ I體積加入到每個(gè)樣本中，隨樣本核酸的提取，Τ4噬菌體的DNA也被提取出來。正常情況下，在熒光定量PCR檢測中，應(yīng)均為陽性，Ct值在25-30Ct之間，如為陰性，則證明樣本提取效率不高、樣本中存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)或PCR反應(yīng)的試劑出現(xiàn)問題。(7)陽性質(zhì)控品為體外培養(yǎng)的腺病毒3型培養(yǎng)物，并經(jīng)加熱和紫外線雙重滅活。在試劑盒中陽性質(zhì)控品作為一個(gè)陽性對照，參與樣本提取和PCR反應(yīng)過程，作為一個(gè)獨(dú)立于樣品的質(zhì)控品，監(jiān)控反應(yīng)體系是否正常，正常情況下不論腺病毒通用(SEQ ID N04、5、6)還是腺病毒AdvBMdvE分型(SEQ ID N07、8、9)均為陽性，如為陰性，證明反應(yīng)過程出現(xiàn)異常，應(yīng)重復(fù)檢測。(8)陰性質(zhì)控品為體外培養(yǎng)的HSV-1病毒，并經(jīng)加熱和紫外線雙重滅活。在試劑盒中陰性質(zhì)控品作為一個(gè)陰性對照，參與樣本提取和PCR反應(yīng)過程，作為一個(gè)獨(dú)立于樣品的陰性質(zhì)控品，正常情況下應(yīng)為陰性，如在熒光定量PCR過程中有起峰或有明顯Ct值，證明樣本被污染，反應(yīng)無效,應(yīng)重新重復(fù)試驗(yàn)。上述腺病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的使用方法，包括熒光定量PCR檢測反應(yīng)，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)前還采用上述核酸提取用液進(jìn)行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取過程中加入上述內(nèi)參照品，對應(yīng)地，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)中加入上述的內(nèi)參照品用引物探針。所有PCR反應(yīng)在一個(gè)管內(nèi)完成，這樣通過一次PCR反應(yīng)檢測所有可能出現(xiàn)的腺病毒，如果腺病毒通用檢測為陽性，證實(shí)樣品中存在可通過分型檢測確認(rèn)是否為常見的流行株。實(shí)施例1:從口腔拭子中檢測腺病毒7型

1、各種試劑準(zhǔn)備:
裂解液配制:準(zhǔn)確稱取30g異硫氰酸胍，溶于25ml 0.1M Tris-HCl (pH6.4)，然后加入 8.8ml 0.5M EDTA (pH 8.0)、13.2ml ddH20，充分混勻后備用。核酸結(jié)合液配制:準(zhǔn)確稱取3g非結(jié)晶型二氧化硅，溶于25ml ddH20中，充分混勻后室溫下靜置24h ;去上清22ml，再加22ml ddH20混勻，室溫下靜置5h ;去上清22ml，將剩余懸液充分混勻后，添加7μ I濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，終濃度為lg/ml。將上述懸液裝入小玻璃瓶中，高壓滅菌，室溫避光保存。洗滌液配制:用DEPC處理的去離子水配制70%的乙醇，作為洗滌液。2、病毒核酸提取:( I)取以前實(shí)驗(yàn)室凍存的咽拭子樣本棉簽，該病人已經(jīng)常規(guī)PCR測序方法驗(yàn)證，感染了腺病毒7型，其它腺病毒為陰性。取咽拭子棉簽，迅速將棉簽放入裝有3 5ml保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。(2)提取基·因組DNA前，請將咽拭子在保存液中充分?jǐn)噭?0次，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等；(3)取3只1.5ml滅菌離心管，分別加入浸過咽拭子的保存液100 μ 1，陽性質(zhì)控品100 μ 1，陰性質(zhì)控品100μ I ;(4)在上述的1.5ml離心管內(nèi)各加入10 μ I的內(nèi)參照品；(5)加入200 μ I裂解液，震蕩混勻；(6)加入10 μ I核酸結(jié)合液，震蕩15s，6000 Xg離心I分鐘，小心棄去所有液體，留
沉淀；(7)加入500 μ I的裂解液混勻，8000rpm離心，去除液體；(8)加入400 μ I洗滌液，震蕩混勻，如沉淀不能分散，必須用移液器吸頭吹打至懸勻；(9) 12000Xg離心I分鐘，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)；(10)重復(fù)步驟(8)- (9)—次;(11)加入Iml冰丙酮，震蕩混勻；(12) 12000Xg離心I分鐘，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)；(13)將裝有沉淀的離心管置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干15分鐘(也可使用開放式加熱器于60°C干燥5分鐘，需防止樣本交叉污染)，加入30 μ I預(yù)熱至70°C的DEPC水，如沉淀不能分散，用移液器吸頭吹打至懸勻上清，離心30s，上清可直接用于檢測，或?qū)⑸锨遛D(zhuǎn)移至另一無RNANsae污染的1.5ml管子中凍存于_80°C備用。3、PCR 檢測:按標(biāo)本數(shù)量(需包含陰性質(zhì)控品及陽性質(zhì)控品)分裝HAdvPCR反應(yīng)液。按每管38 μ I分裝至0.2mlPCR反應(yīng)管/板中。在分裝好的各反應(yīng)管/板分別加入處理好的DNA樣品2μ 1、陰陽質(zhì)控品各2μ I。最終體系各個(gè)組分的濃度如下:15mM Tris-HCl (pH8.0), 50mMKCl，5mM MgCl2, 0.2 μ M dNTP, 0.05% Tween-20, 0.05%, NP-40, 0.06U/ μ I 化學(xué)修飾的熱啟動酶，0.5Unit UNG 酶引物濃度如下:500mM (SEQ ID N04、5、7、8)，200mM(SEQ ID NOU2),200mM(SEQ ID N03、6、9)。短暫離心使所有試劑集中到反應(yīng)管底部(不能有氣泡)，確定蓋好管蓋或封膜后，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
在按以下方案運(yùn)行儀器程序:(I) UNG 反應(yīng):50 °C 2min ；(2)預(yù)變性:95℃ 1Omin ；(3)PCR: (95°C 1Osec, 55°C 20sec, 65°C 20sec) 40 個(gè)循環(huán)；65°C時(shí)分別檢測 FAM、Rox、HEX通道熒光信號，選擇反應(yīng)體系40 μ I。檢測結(jié)果如圖1所示:所有標(biāo)本的內(nèi)參照品擴(kuò)增也均為陽性，表明樣品提取以及擴(kuò)增過程有效。咽拭子標(biāo)本中腺病毒通用引物探針以及AdvB&E分型引物探針均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線，陽性質(zhì)控品的兩個(gè)腺病毒擴(kuò)增也均為陽性，陰性質(zhì)控品兩個(gè)腺病毒的檢測為陰性，表明該試劑盒可有效檢測出腺病毒7型，并在分型檢測中有效區(qū)分出為AdvB&E流行株。實(shí)施例2:從糞便中檢測腺病毒40型1、病毒核酸提取:取實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)常規(guī)PCR測序驗(yàn)證的腺病毒40型陽性水樣便懸液，5000Xg離心lmin，吸上清100 μ I進(jìn)行HAdV DNA提取，同時(shí)設(shè)立陰陽性質(zhì)控各一，在上述試管內(nèi)加入10 μl的內(nèi)參照品，并加入200 μl裂解液裂和1Oμl核酸結(jié)合液，震蕩15s，6000 X g離心I分鐘，小心棄去所有液體，留沉淀，分別用500μl裂解液洗滌沉淀一次、400 μl洗滌液洗滌沉淀兩次以及1ml的冷丙酮洗滌沉淀一次，最后用30 μl預(yù)熱至70°C的DEPC水進(jìn)行洗脫。2、PCR加樣與熒光定量PCR檢測同實(shí)施例13、檢測結(jié)果如圖2所示:所有標(biāo)本的內(nèi)參照品擴(kuò)增也均為陽性，表明樣品提取以及擴(kuò)增過程有效。糞便標(biāo)本僅腺病毒通用引物探針檢測為陽性，AdvB&E分型引物探針檢測為陰性，陽性質(zhì)控品的兩個(gè)腺病毒擴(kuò)增均為陽性，陰性質(zhì)控兩個(gè)腺病毒的檢測為陰性，表明該試劑盒可有效檢測出糞便中的腺病毒40型，但由于腺病毒40型屬于腺病毒F亞群，因此在AdvB&E分型檢測中為陰性，進(jìn)一步證明該試劑盒在分型檢測中的特異性。實(shí)施例3:從血清中檢測腺病毒3型1、病毒核酸提取取HBV、HIV、HCV陰性血清1ml，加入10 μl體外培養(yǎng)的腺病毒3型病毒培養(yǎng)物，充分混勻，取100 μl進(jìn)行HAdV DNA提取，同時(shí)設(shè)立陰陽性質(zhì)控各一，在上述試管內(nèi)加入10 μl的內(nèi)參照品，并加入200 μl裂解液裂和10 μl核酸結(jié)合液，震蕩15s，6000Xg離心1分鐘，小心棄去所有液體，留沉淀，分別用500 μl裂解液洗滌沉淀一次、400 μl洗滌液洗滌沉淀兩次以及1ml的冷丙酮洗滌沉淀一次，最后用30 μl預(yù)熱至70°C的DEPC水進(jìn)行洗脫。2、PCR加樣與熒光定量PCR檢測同實(shí)施例13、檢測結(jié)果如圖3所示:所有標(biāo)本的內(nèi)參照品擴(kuò)增也均為陽性，表明樣品提取以及擴(kuò)增過程有效。在加入體外培養(yǎng)腺病毒的人血清標(biāo)本中腺病毒通用引物探針以及AdvB&E分型引物探針均出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線，陽性質(zhì)控品的兩個(gè)腺病毒擴(kuò)增也均為陽性，陰性質(zhì)控兩個(gè)腺病毒的檢測為陰性，表明該試劑盒可有效檢測出血清標(biāo)本中的腺病毒3型，并在分型檢測中有效區(qū)分出為AdvB&E流行株，血清中的干擾物質(zhì)不影響檢測。實(shí)施例4:試劑盒的非特異性檢測1、病毒核酸提取
取5支試管分別加入10 μ I HBV陽性血清、CMV細(xì)胞培養(yǎng)物、HPV陽性標(biāo)本、大腸桿菌和HSV-2細(xì)胞培養(yǎng)物，充分混勻，取100 μ I進(jìn)行HAdV DNA提取，同時(shí)設(shè)立陰陽性質(zhì)控各一，在上述試管內(nèi)加入10 μ I的內(nèi)參照品，并加入200 μ I裂解液裂和10 μ I核酸結(jié)合液，震蕩15s，6000 Xg離心I分鐘，小心棄去所有液體，留沉淀，分別用500 μ I裂解液洗滌沉淀一次、400 μ I洗滌液洗滌沉淀兩次以及Iml的冷丙酮洗滌沉淀一次，最后用30 μ I預(yù)熱至70°C的DEPC水進(jìn)行洗脫。2、PCR加樣與熒光定量PCR檢測同實(shí)施例13、檢測結(jié)果如圖4所示:所有標(biāo)本的內(nèi)參照品擴(kuò)增均為陽性，表明樣品提取以及擴(kuò)增過程有效，在所有標(biāo)本中僅陽性質(zhì)控的腺病毒通用和AdvB&E分型檢測為陽性，其它標(biāo)本均為陰性，證實(shí)該試劑盒與其它常見的DNA病毒和大腸桿菌沒有交叉反應(yīng)。實(shí)施例5:試劑盒的靈敏度 檢測將107TCID5(l/ml的腺病毒3型病毒溶液，做1:10系列稀釋，提取基因組DNA，采用Adv通用和分型檢測的PCR引物和探針進(jìn)行檢測，結(jié)果本試劑盒通用PCR引物探針可以檢測到IO3TCID5cZml滴度的腺病毒3型(圖5)，采用分型檢測的引物探針可以檢測到5X103TCID50/ml滴度的腺病毒3型。最后應(yīng)說明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>北京博海通達(dá)生物科技有限公司〈120〉一種腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒及其使用方法<160>9<170>PatentIn Version 3.3<210>1〈211>27<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Iccatccatag agaaaatatc agaacga27<210>2<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>2taaataattc ctcttttccc agcg24<210>3
<211>33<212>DNA〈213〉人工序列<400>3aaccagtaat ttcatctgct tctgatgtga ggc33<210>4<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>4gccacggtgg ggtttctaaa ctt23<210>5<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<400>5gccccagtgg tcttacatca tgcacatc28<210>6<211>32<212>DNA〈213〉人工序列<400>6tgcaccagac ccgggctcag gaggtactcc ga32<210>7<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>7gatggccacc ccatcgatgm tgc23<210>8<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>8
gcgaactgca ccagacccgg ac22<210>9<211>34<212>DNA〈213〉人工序列
權(quán)利要求
1.一種腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、引物探針組合、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，其特征在于，還包括核酸提取用液及核酸提取用內(nèi)參照品； 所述內(nèi)參照品為滅活的T4噬菌體，所述引物探針組合包括腺病毒核酸用引物探針及內(nèi)參照品用引物探針，所述內(nèi)參照品用引物探針為:SEQ ID NOl:CCATCCATAGAGAAAATATCAGAACGA ；SEQ ID N02:TAAATAATTCCTCTTTTCCCAGCG ； SEQ ID N03:AACCAGTAATTTCATCTGCTTCTGATGTGAGGC,其 5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所述腺病毒核酸用引物探針包括通用型引物探針:SEQ ID N04:GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT ；SEQ ID N05:GCCCCAGTGGTCTTAC ATCATGCACATC ； SEQ ID N06:TGCACCAGACCCGGGCTCAGGAGGTACTCCGA，其 5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所述腺病毒核酸用引物探針還包括B和E亞群分型引物探針:SEQ ID N07:GATGGCCACCCCATCGATGMTGCSEQ ID N08:GCGAACTGCACCAGACCCGGAC SEQ ID N09:TACATGCACATCGCCGGACAGGAMGCTTCGGAGT，其 5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所述5’端熒光報(bào)告基團(tuán)為R0X、FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5，3’端熒光萃滅基團(tuán)為TAMRA、BHQ1、BHQ2 或 BHQ3。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所述5’端熒光報(bào)告基團(tuán)為R0X、FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5，3’端熒光萃滅基團(tuán)為TAMRA、BHQl、BHQ2或BHQ3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所述核酸提取用液包括裂解液、核酸結(jié)合液、洗滌液，其中: 裂解液主要是由如下組份組成:胍鹽濃度為5-8M ；Tris-HCl濃度為IO-1OOmM, pH值為5.0-6.7 ；EDTA 濃度為 IO-1OOmM0 核酸結(jié)合液是由非結(jié)晶的二氧化硅經(jīng)鹽酸處理配制而成； 洗滌液是用DEPC處理的去離子水配制70%的乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒的使用方法，包括熒光定量PCR檢測反應(yīng)，其特征在于，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)前還采用所述核酸提取用液進(jìn)行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取過程中加入所述內(nèi)參照品，對應(yīng)地，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)中加入所述的內(nèi)參照品用引物探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腺病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、引物探針組合、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，還包括核酸提取用液及核酸提取用內(nèi)參照品；所述內(nèi)參照品為滅活的T4噬菌體，所述引物探針組合包括腺病毒核酸用引物探針(通用SEQ ID NO4-6；分型SEQ ID NO7-9)及內(nèi)參照品用引物探針(SEQ ID NO1-3)，其中SEQ ID NO3、6、9的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接熒光淬滅基團(tuán)；本發(fā)明還公開了上述試劑盒的使用方法，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)前還采用核酸提取用液進(jìn)行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取過程中加入所述內(nèi)參照品；本發(fā)明的試劑盒及其使用方法具有使用便捷、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，其不僅可以對所有腺病毒進(jìn)行檢測，還可以對B和E亞群進(jìn)行分型。
文檔編號C12Q1/70GK103160619SQ201310122739
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者辛忠濤, 牛宇辰, 姜曰曉, 張英民 申請人:北京博海通達(dá)生物科技有限公司