專(zhuān)利名稱(chēng)：一種預(yù)防與消除優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)念珠菌污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和消除優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)念珠菌污染方法，即通過(guò)雙氯苯雙胍己燒(Chlorhexidine)預(yù)防和消除優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)念珠菌污染的方法，屬于體育科學(xué)、微生物學(xué)和人類(lèi)細(xì)胞生物學(xué)交叉學(xué)科和領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白色念珠菌(Candida Albicans)又稱(chēng)白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病。為條件致病性真菌。念珠菌病是真菌——念珠菌屬感染引起的口腔粘膜疾病。主要病原菌是白色念珠菌。25% 50%的正常人口腔中帶有此菌，以芽生孢子型存在，并不致病，但在某些因素的作用下，孢子長(zhǎng)成菌絲后而致病。由于近年來(lái)抗生素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，發(fā)生菌群失調(diào)或免疫力降低的幾率增高，使真菌感染者日益增多，發(fā)病率也在相應(yīng)增高。念珠菌性口炎又分為四型。①急性假膜型，又稱(chēng)為雪口病或鵝口瘡?？砂l(fā)生于任何年齡的人，但以新生兒最多見(jiàn)多發(fā)于出生后2 8日內(nèi)。好發(fā)于頰、舌、軟腭及唇部，在粘膜充血上，有散在的白色如雪的柔軟小斑點(diǎn)，后逐步融合成界限清楚的白色或藍(lán)白色的絲絨狀斑片，并可繼續(xù)蔓延擴(kuò)大，嚴(yán)重者可累及扁桃體、咽部、牙齦等處，呈滿(mǎn)口白斑雪片狀。斑片附著不十分緊密，稍用力可擦掉，暴露紅的粘膜糜爛面可輕度出血?；純簾┰瓴话?、啼哭、哺乳困難，有·時(shí)有輕度發(fā)熱，全身反應(yīng)一般較輕。②急性萎縮型，多見(jiàn)于成年人，常由于廣譜抗生素及皮質(zhì)類(lèi)固醇激素長(zhǎng)期應(yīng)用而致。大多數(shù)患者用抗生素等藥物前即有消耗性疾病，如白血病、營(yíng)養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂、腫瘤化療后等，或患某些皮膚病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、天皰瘡等，故又稱(chēng)為抗生素口炎。粘膜充血糜爛，舌背乳頭呈團(tuán)塊萎縮，周?chē)嗵υ龊瘢形队X(jué)異?；騿适В谇桓稍?，粘膜灼痛。③慢性肥厚型，又稱(chēng)增殖型念珠菌口炎?？梢?jiàn)于頰粘膜、舌背及腭部。頰部病損位于口角內(nèi)側(cè)三角區(qū)，呈結(jié)節(jié)狀或顆粒狀增生，或?yàn)楣讨o密的白色角質(zhì)斑塊，類(lèi)似一般粘膜白斑；腭部病損可由托牙性口炎發(fā)展而來(lái)，粘膜呈乳頭狀增生；舌背病損為絲狀乳頭增殖，色灰黑，稱(chēng)為毛舌。本型粘膜表層的假膜與上皮層附著緊密，不易剝脫。高齡患者應(yīng)及早活檢，明確診斷。④慢性萎縮型，又稱(chēng)托牙性口炎。常發(fā)生于上頜義齒的腭側(cè)面所接觸的腭、齦粘膜，女性多于男性。粘膜紅腫發(fā)亮，或呈黃白色的條索狀或斑點(diǎn)狀假膜?？梢圆l(fā)唇和口角的損害。雙氯苯雙胍己燒(chloehexidine,曾用名:洗必泰,氯已定)是上世紀(jì)50年代由英國(guó)帝國(guó)化學(xué)工業(yè)公司開(kāi)發(fā)的抗菌劑。已在藥品、醫(yī)療用品和個(gè)人衛(wèi)生用品(如漱口液、牙膏等)中廣泛應(yīng)用。氯已定為強(qiáng)堿性，生理pH呈雙陽(yáng)離子狀態(tài)。它不溶于水，但其雙葡萄糖酸鹽和雙醋酸鹽可溶于水。水溶液無(wú)色、無(wú)嗅、味極苦。局部應(yīng)用時(shí)，其氯苯基與皮膚黏膜的蛋白質(zhì)以共價(jià)結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組分的磷脂部分而產(chǎn)生持續(xù)的抗菌作用。高濃度呈殺菌作用。進(jìn)入胞漿損傷其胞漿膜，與細(xì)胞內(nèi)ATP和核酸形成不可逆的沉淀物。有抑殺真菌的作用，對(duì)部分病毒也有殺滅作用。對(duì)G+的MIC比對(duì)G-更低，與G+的細(xì)胞壁親和力更大。延長(zhǎng)暴露時(shí)間將增加對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的殺滅作用。外周血來(lái)源的細(xì)胞只有在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。和微生物培養(yǎng)相比，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)的要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類(lèi)、葡萄糖、或半乳糖外，還需要血清。對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)性更差，對(duì)環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都有很高的要求，一般需要嚴(yán)格監(jiān)控。細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中還需要防止污染問(wèn)題，細(xì)菌、真菌、病毒等微生物及一些原生動(dòng)物均可導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的污染。白色念珠菌是最常見(jiàn)的一種真菌，主要侵犯于皮膚、粘膜，也可引起內(nèi)臟或全身感染。近年來(lái)由于廣譜抗生素的應(yīng)用、腫瘤的放化療、侵入性治療、器官移植的開(kāi)展，免疫抑制劑的大量應(yīng)用導(dǎo)致正常的菌群失調(diào)，白色念珠菌的感染較以往有明顯的增加。目前，由于大量的抗真菌藥物的廣泛和長(zhǎng)期使用，容易引起耐藥菌株的出現(xiàn)，給念珠菌感染的治療帶來(lái)很大的困難。由于洗必泰的普遍使用并且具有極強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌作用且毒性低，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、細(xì)菌芽孢、真菌及病毒等的抗菌作用，即使在有血清、血液等存在時(shí)仍有效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制并消除優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)白色念珠菌污染的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:(I)菌株的培養(yǎng):先將菌種接種于沙堡氏培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落接種于玉米瓊脂培養(yǎng)基上形成厚膜孢子，然后再結(jié)合糖發(fā)酵或其它生化試驗(yàn)加以鑒定。(2)接種菌液到 細(xì)胞中:將2X IOVml白色念珠菌菌液接種與30瓶生長(zhǎng)狀況良好，密度60%左右的細(xì)胞0.1ml/瓶。(3)分組實(shí)驗(yàn):將30瓶細(xì)胞分隨機(jī)分為三組，每組10瓶分別為對(duì)照組、含3%碳酸氫鈉DMEM、含1: 100000 (雙氯苯雙胍:DMEM)雙氯苯雙胍DMEM本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益:白色念珠菌是寄居在正常人體消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜上的正常菌群。一般不致病，僅在長(zhǎng)期的粒細(xì)胞減少、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、骨髓移植或?qū)嶓w器官移植及獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)等致機(jī)體免疫力減弱時(shí)，大量白色念珠菌的入侵才可能發(fā)病。有資料表明應(yīng)用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biologicalre-sponse modifer, BRM)防治深部真菌感染是可行的方法。傳統(tǒng)BRM如卡介苗(BCG)、IL-2、轉(zhuǎn)移因子等均存在著程度不同的毒副作用及價(jià)格較昂貴等缺點(diǎn)，使之在臨床應(yīng)用上受到一定的限制。由于大量的抗真菌藥物的廣泛和長(zhǎng)期使用，容易引起耐藥菌株的出現(xiàn)，給念珠菌感染的治療帶來(lái)很大的困難。由于洗必泰的普遍使用并且具有極強(qiáng)的廣譜抑菌、殺菌作用且毒性低，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、細(xì)菌芽孢、真菌及病毒等的抗菌作用，即使在有血清、血液等存在時(shí)仍有效具有廣譜抗菌消炎作用，含一定量的雙氯苯雙胍亦可預(yù)防和消除體外細(xì)胞培養(yǎng)念珠菌的污染。
具體實(shí)施方案:實(shí)施例中所用的主要儀器及試劑來(lái)源:(一)主要的儀器及設(shè)備DL-CJ-2N高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái):中國(guó)哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司
37.5°C 5% C02 培養(yǎng)箱:德國(guó) Heraeus 公司TDL-40B水平離心機(jī):中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司AR1530/C電子天平:美國(guó)OHAUS公司IX-71倒置相差顯微鏡:日本Olympus公司電熱恒溫水浴鍋,血球計(jì)數(shù)板,液氮貯存器:中國(guó)北京六一廠(chǎng)Pall超純水儀:德國(guó)Pall公司電動(dòng)移液器:德國(guó)Eppendorff公司超低溫冰箱:中國(guó)海爾公司培養(yǎng)板:美國(guó)Corning公司梯度PCR 儀:美國(guó) Applied Biosystems超純水儀Mi 11 ipore美國(guó)凝膠成像系統(tǒng):美 國(guó)Alpha Innotech紫外分光光度計(jì):美國(guó)UltrospecllOOpro GE紫外分光光度計(jì):美國(guó)ND-1OOONanodrop臺(tái)式高速低溫離心機(jī):德國(guó)Eppendorf( 二 )主要試劑及配制方法(I) 0.2M L-Glutamine:稱(chēng)取 1.46g L-Glutamine 溶于 50ml 三蒸水中，置于 37°C水浴鍋中加熱溶解，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)3% NaHCO3:稱(chēng)取3g NaHCO3溶于IOOml三蒸水中，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C
保存?zhèn)溆谩?3) DMEM培養(yǎng)基:將一個(gè)包裝的DMEM干粉與2.2gNaHC03溶于適量三蒸水中，定容至1000ml，調(diào)pH7.0左右，0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，500ml/瓶分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?4) DMEM 全培養(yǎng)基:RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% FBS+1%雙抗+1% L-Glutamine，調(diào)節(jié)pH7.0，0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?5)含碳酸氫鈉DMEM全培養(yǎng)基:DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10 % FBS+1 %雙抗+1 %L-Glutamine+4ml 3% NaHCO3,調(diào)節(jié)pH7.0,0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?6)含雙氯苯雙胍DMEM全培養(yǎng)基:DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% FBS+1%雙抗+1%L-Glutamine+150 μ I雙氯苯雙胍，調(diào)節(jié)ρΗ7.0,0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?7)沙保氏培養(yǎng)基:0X10D沙保氏液體培養(yǎng)基(CM0147)英國(guó)(8)白色念珠菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心實(shí)施例1白色念珠菌的培養(yǎng)將菌種接種在沙保氏培養(yǎng)基上,37°C培養(yǎng),l-2d長(zhǎng)出菌落,挑取單菌落分別接種于玉米瓊脂培養(yǎng)基和玉米吐溫80培養(yǎng)基中，然后蓋上無(wú)菌的蓋片。37°C溫箱中培養(yǎng)，分別于24，48，72h進(jìn)行鏡檢。結(jié)果:48h觀(guān)察，培養(yǎng)基中全部長(zhǎng)出菌落，菌落圓形，白色或微呈奶油色，閃光，邊緣光滑，表面無(wú)褶皺。實(shí)施例2接種菌液到細(xì)胞中并分組處理將2X107/ml白色念珠菌菌液接種與30瓶生長(zhǎng)狀況良好，密度60%左右的細(xì)胞
0.1ml/瓶，將30瓶細(xì)胞分隨機(jī)分為三組，每組10瓶分別為對(duì)照組、含3%碳酸氫鈉DMEM、含I: 100000 (雙氯苯雙胍:DMEM)雙氯苯雙胍DMEM置于37.5°C, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天對(duì)其進(jìn)行觀(guān)察。在培養(yǎng)7對(duì)其進(jìn)行DNA提取，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)論:經(jīng)過(guò)所有試驗(yàn)，含雙氯苯雙胍DMEM全培養(yǎng)基能有效地控制和消除優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)白色念珠菌污染，因此含一定量的雙氯苯雙胍亦可預(yù)防和消除體外細(xì)胞培養(yǎng)念珠菌的 污染。
權(quán)利要求
1.一種高效預(yù)防并消除冰雪運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)白色念珠菌污染的方法，其特征在于，用1: 100000 (雙氯苯雙胍:DMEM)雙氯苯雙胍DMEM (含3%碳酸氫鈉)對(duì)白色念珠菌(3X 107/ml)污染的優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消除，經(jīng)PCR檢測(cè)雙氯苯雙胍可預(yù)防和消除體外細(xì)胞培養(yǎng)念珠 菌的污染。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效率預(yù)防和消除優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員體外細(xì)胞培養(yǎng)白色念珠菌污染的方法。體外細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌、真菌、病毒等微生物及一些原生動(dòng)物均可導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。白色念珠菌是最常見(jiàn)的一種真菌，抗真菌藥物的廣泛和長(zhǎng)期使用，容易引起耐藥菌株的出現(xiàn)，給念珠菌污染的消除帶來(lái)很大的困難。本發(fā)明利用含1:100000(雙氯苯雙胍DMEM)雙氯苯雙胍DMEM可預(yù)防和消除白色念珠菌。該方法高效，簡(jiǎn)潔、普遍適用。
文檔編號(hào)C12Q1/20GK103233059SQ201310123110
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者費(fèi)郁紅, 李克良, 馬喜強(qiáng), 張文秀, 王會(huì), 關(guān)偉軍 申請(qǐng)人:哈爾濱體育學(xué)院