專利名稱：食品過敏原羽扇豆成分lamp現(xiàn)場快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及食品中食品過敏原羽扇豆成分的LAMP檢測方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
食物過敏是人們對食品產(chǎn)生的一種不良反應(yīng)，屬機體對外源物質(zhì)產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)，目前，國際公認(rèn)的主要八大類過敏食品為:大豆、花生、小麥、蛋、奶、魚、堅果、甲殼類。食物過敏的一般癥狀包括嘔吐、腹痛、腹瀉等，也包括皮膚反應(yīng)及呼吸道癥狀，嚴(yán)重情況下甚至?xí)霈F(xiàn)系統(tǒng)性過敏性休克或死亡。對于食物過敏治療尚無特效方法，嚴(yán)格避免食用含有過敏原成分的食品是最有效的療法。完全的食物禁忌很難實現(xiàn)，因為食物過敏原可能隱藏在其它食物當(dāng)中。為保護過敏人群，各國政府和國際組織相繼修改和出臺規(guī)范食品中過敏原標(biāo)識的法律法案，對食品標(biāo)簽上過敏原成分的標(biāo)注作出嚴(yán)格規(guī)定。美國、歐盟、加拿大等國要求強制性標(biāo)識大豆、小麥等主要食品過敏原種類。
羽扇豆(Lupinus polyphyllus),豆科蝶形花亞科羽扇豆屬，一年生或多年生草本植物，根據(jù)用途可分為觀賞羽扇豆和食用羽扇豆。食用羽扇豆蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，含油量為5-20%，現(xiàn)在，農(nóng)作物種用品種主要有白花羽扇豆、窄葉羽扇豆、黃花羽扇豆和珍珠羽扇豆，在澳大利亞和歐洲、亞洲及非洲的許多國家都有廣泛的種植。由于其特殊的功能性及營養(yǎng)學(xué)特性，羽扇豆已較多的運用于食品加工中，另外一方面，羽扇豆可以取代大豆而應(yīng)用于食品中，這樣就減少了食品中轉(zhuǎn)基因大豆存在的風(fēng)險。但羽扇豆致敏性給很多敏感個體帶來了困擾，歐盟法規(guī)要求強制性標(biāo)識過敏原羽扇豆成分。羽扇豆過敏常常是發(fā)生與花生過敏交叉反應(yīng)而引起的，對花生過敏的病人極有可能對羽扇豆也過敏，其過敏癥狀主要表現(xiàn)為接觸性風(fēng)疹和哮喘。因此對羽扇豆成分的檢測尤為重要。
目前關(guān)于食品成分的檢測方法有電泳、色譜、免疫化學(xué)、DNA技術(shù)等。對于食品中食品過敏原成分的檢測研究，目前主要有以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的方法(如ELISA方法)和以基因為基礎(chǔ)的方法(如PCR方法)，這兩種方法都需要高端儀器設(shè)備、專業(yè)操作人員。本領(lǐng)域目前還沒有檢測效果良好且操作簡單、設(shè)備要求低的特異性檢測食品過敏原羽扇豆成分的試劑和方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于 提供食品過敏原羽扇豆成分LAMP現(xiàn)場快速檢測方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種鑒定食品過敏原羽扇豆成分的方法，所述方法包括:
以待測樣品的DNA為模板，以特異性擴增羽扇豆ITSl基因的引物進(jìn)行擴增；若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中包含食品過敏原羽扇豆成分。
在一個優(yōu)選例中，所述的擴增是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)。
在另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴增羽扇豆ITSl基因的引物包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游內(nèi)引物EQ ID NO: 3，下游內(nèi)引物SEQ ID N0:4。在另一優(yōu)選例中，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增包括:63土rc (較佳地63±0.5°C )恒溫反應(yīng)60 土 IOmin (較佳地60 土 5min)，然后在80 ± 2°C (較佳地80 ± I °C )滅活5 土 Imin (較佳地5±0.5min)，結(jié)束反應(yīng)。 在另一優(yōu)選例中，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的體系中包括引物、Mg2+、甜菜堿、dNTPs ；其中，Mg2+ 濃度 6±lmM ;甜菜堿濃度 0.8±0.IM ；dNTPs 濃度 1.6±0.2mM。在另一優(yōu)選例中，在環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)結(jié)束后，在擴增產(chǎn)物中加入SYBR GreenI熒光染料觀察顏色變化，沒有擴增產(chǎn)物的陰性管呈橙色，有擴增產(chǎn)物的陽性管為綠色在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣品是食品或飼料。在本發(fā)明的另一方面，提供一種引物，所述引物是LAMP擴增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游內(nèi)引物EQ ID NO:3，下游內(nèi)引物SEQ IDN0:4。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于從待測樣品中鑒定食品過敏原羽扇豆成分。在本發(fā)明的另一方面，提供一種鑒定食品過敏原羽扇豆成分的試劑盒，其中包括所述的引物。

在一個優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括:含有羽扇豆成分的檢測標(biāo)準(zhǔn)品；DNA提取試劑；pH 緩沖試劑(如 Tris-HCl (PH8.8))；鉀離子溶液；鎂離子溶液；銨離子溶液；Tween20 ；甜菜堿；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；熒光染料(如SYBR Green I熒光染料);和/或說明鑒定食品過敏原羽扇豆成分的方法的使用說明書。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、食品過敏原羽扇豆LAMP檢測引物反應(yīng)時間的實時濁度擴增圖譜。其中，CH1-3:陰性對照；CH4-6:陽性對照。圖2、食品過敏原羽扇豆LAMP檢測引物體系優(yōu)化的實時濁度擴增圖譜。其中，CH1-2:陰性對照，CH3-4:陽性對照。圖3、食品過敏原羽扇豆成分LAMP特異性檢測的實時濁度圖譜。其中，A:CH1_8依次為黃花羽扇豆、大豆、鷹嘴豆、扁豆、四季豆、豌豆、白云豆、綠豆；B:CHl-8依次為豇豆、蠶豆、大米、玉米、燕麥、小麥、蕎麥、花生；C:CHl-8依次為杏仁、核桃、芹菜、胡蘿卜、土豆、番茄、梨、桔子；D:CHl-8依次為西柚、牛奶、雞蛋、羊奶、鴨蛋、鵝蛋、鴿子蛋、豬肉；D:CHl-6依次為白花羽扇豆、草蝦、螃蟹、三文魚、陰性對照、陰性對照。
圖4、食品過敏原羽扇豆成分LAMP特異性檢測的顯色法檢測結(jié)果。
其中，1-37依次為:黃花羽扇豆、陰性對照、白花羽扇豆、大豆、鷹嘴豆、扁豆、四季豆、豌豆、白云豆、綠豆、豇豆、蠶豆、大米、玉米、燕麥、小麥、蕎麥、花生、杏仁、核桃、芹菜、胡蘿卜、土豆、番茄、梨、桔子、西柚、牛奶、羊奶、雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鴿子蛋、豬肉、草蝦、螃蟹、三文魚。
圖5、食品過敏原羽扇豆成分LAMP靈敏度檢測的實時濁度圖譜。
其中，CHl:1% 羽扇豆；CH2:0.1% 羽扇豆；CH3:0.05% 羽扇豆；CH4:0.01% 羽扇豆；CH5:0.005%羽扇豆；CH6:0.001%羽扇豆；CH7:0.0005%羽扇豆；CH8:陰性對照。
圖6、食品過敏原羽扇豆成分LAMP靈敏度檢測的顯色法檢測結(jié)果。
其中，1-3:0%羽扇豆；4-6:0.0005%羽扇豆，7_9:0.001%羽扇豆，10-12:0.1%羽扇豆；13:陽性對照；14:陰性對照。
圖7、0.1%羽扇豆LAMP檢測的實時濁度穩(wěn)定性檢測圖。
其中，A:CHl:陽性對照，CH2:陰性對照(超純水)，CH3-8:0.1%羽扇豆模擬樣品；B:CHl-8為0.1%羽扇豆模擬樣品；C:CHl-6為0.1%羽扇豆模擬樣品。
圖8、0.1%羽扇豆LAMP檢測的顯色法穩(wěn)定性檢測圖。
其中，1:陽性對照，2:陰性對照，3-22:0.1%模擬樣品。
圖9、0.001%羽扇豆LAMP檢測的實時濁度穩(wěn)定性檢測圖。
其中，A =CHl:陽性對照，CH2:陰性對照，CH3-6:0.001%羽扇豆樣品；B:CH1_8為0.001%羽扇豆樣品；C:CHl-8為0.001%羽扇豆樣品。
圖10、0.001%羽扇豆LAMP檢測的顯色法穩(wěn)定性檢測圖。
其中，1:陽性對照，2:陰性對照,3-22:0.001%模擬樣品。
具體實施方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種羽扇豆過敏原成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)檢測方法。經(jīng)過比較篩選，發(fā)現(xiàn)以羽扇豆ITSl基 因作為鑒定的靶基因，特異性良好；并基于此設(shè)計了 LAMP擴增引物，所述引物針對含有羽扇豆成分的DNA可發(fā)生特異性擴增(獲得陽性結(jié)果)，而對沒有羽扇豆成分的DNA不發(fā)生特異性擴增(獲得陰性結(jié)果)。本發(fā)明的方法可良好地應(yīng)用于鑒定食品過敏原羽扇豆成分，并且具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度。
目前市場上的食品大多是混合成分制成的，各種成分在細(xì)加工后很難辨認(rèn)。并且豆科植物中羽扇豆以外的其它豆類與羽扇豆性狀接近，更是增加了區(qū)分難度，即使采用一些基因或蛋白水平上的技術(shù)，也由于一些豆類品種在親緣關(guān)系上較近，難以找到符合標(biāo)準(zhǔn)的、檢測準(zhǔn)確性高、實用性強的羽扇豆檢測靶標(biāo)。為此，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和大量的篩選，找到了合適的檢測靶標(biāo)，基于此開發(fā)了 LAMP檢測食品過敏原羽扇豆成分的方法。
如本文所用，所述的“羽扇豆成分”是指特異性來自于羽扇豆的成分，例如羽扇豆粉等。
如本文所用，所述的“食品”包含了飲料。本發(fā)明人通過對引物的篩選，獲得一類可特異性鑒定食品過敏原羽扇豆成分的引物，其對于羽扇豆的DNA發(fā)生特異性擴增，而對沒有羽扇豆成分的DNA不發(fā)生特異性擴增。因此，本發(fā)明提供一種引物，所述的引物是LAMP擴增引物，包括:上游外引物SEQID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游內(nèi)引物EQ ID NO:3，下游內(nèi)引物SEQ ID N0:4。本發(fā)明的這些弓I物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。利用本發(fā)明的引物，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并通過濁度儀檢測或顯色觀察，就可以準(zhǔn)確、快速地判斷待測樣品是否含有羽扇豆成分，而且所需的樣品量很少。本發(fā)明還提供了一種鑒定食品過敏原羽扇豆成分的方法，所述方法包括:以待測樣品的DNA為模板，以特異性擴增羽扇豆ITSl基因的引物進(jìn)行擴增；若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中包含食品過敏原羽扇豆成分。更優(yōu)選地，基于本發(fā)明所提供的適用于鑒定食品過敏原羽扇豆成分的特異性引物，所述方法包括:以待測樣品的DNA為模板，以SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物進(jìn)行擴增；若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中包含羽扇豆成分。LAMP是近年來發(fā)展的一種新穎和較成熟的等溫核酸擴增技術(shù)。LAMP是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下，即可完成的核酸擴增反應(yīng)。與PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)儀(PCR儀)，且由于LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產(chǎn)物通過肉眼觀察或濁度計即可判定結(jié)果；因此LAMP適合于現(xiàn)場或條件較差的實驗室進(jìn)行快速檢測。LAMP技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確和操作簡便等優(yōu)點。獲取待測樣品的DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，例如可采取傳統(tǒng)的酚/氯仿/異戊醇法，或者可 采用一些商購的DNA提取試劑盒，這類試劑盒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明還涉及一種用于鑒定食品過敏原羽扇豆成分的試劑盒，所述試劑盒中含有針對羽扇豆ITSl基因的LAMP擴增引物。此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定羽扇豆成分的試劑，如(但不限于):含有羽扇豆成分的檢測標(biāo)準(zhǔn)品；DNA提取試劑；pH緩沖試劑(如Tris-HCl (PH8.8));鉀離子溶液；鎂離子溶液；銨離子溶液；Tween20 ;甜菜堿；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；熒光染料(如SYBR Green I熒光染料)。此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定食品過敏原羽扇豆成分的使用說明書和/或標(biāo)準(zhǔn)操作程序。本發(fā)明所述的試劑盒可實現(xiàn)快速檢測、批量檢測食品過敏原羽扇豆成分的目的。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:(I)首次揭示一種可特異性鑒定食品過敏原羽扇豆成分的引物，所述的引物特異性良好，對于羽扇豆來源的成分能夠?qū)崿F(xiàn)特異性擴增，而對于羽扇豆以外的其它成分不能特異性擴增。并且，所述引物具有良好的再現(xiàn)性、結(jié)果穩(wěn)定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的檢測試劑盒，可快速、大批量地檢測羽扇豆成分，從待測樣品中快速準(zhǔn)確地區(qū)分羽扇豆成分，并且所需樣品量少，操作簡單。(3)本發(fā)明的方法用于食品安全突發(fā)事件現(xiàn)場的檢測和食品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程控制中的樣品檢測，填補食品過敏原現(xiàn)場快速檢測方法的空白。本發(fā)明的方法的推廣應(yīng)用對保障產(chǎn)品的質(zhì)量，保護消費者知情權(quán)和選擇權(quán)，維護正常的經(jīng)濟秩序等提供了技術(shù)支持。為食品的市場監(jiān)督部門和檢驗檢疫部門提供了技術(shù)支持。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。1、材料與方法1.1 材料黃花羽扇豆、白花羽扇豆、大豆、鷹嘴豆、扁豆、四季豆、豌豆、白云豆、綠豆、豇豆、蠶豆、大米、玉米、燕麥、小麥、蕎麥、花生、大杏仁、核桃、芹菜、胡蘿卜、土豆、番茄、梨、桔子、西柚、牛奶、羊奶、雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鴿子蛋、豬肉、草蝦、三文魚、螃蟹等36種材料購自上海市農(nóng)貿(mào)市場。用于過敏原羽扇豆成分的特異性檢測。羽扇豆產(chǎn)品(面包、蛋糕)5份，其它不含羽扇豆成分的食品45份，購自上海超市，用于實際樣品檢測。1.2主要試劑和耗材LAMP 反應(yīng)試劑:Bst DNA Polymerase Large Fragment,購自 New EnglandBiolabs 公司。甜菜堿(Betaine)、MgCl2,購自Sigma 公司。dNTPs，購自寶生物工程(大連)有限公司。SYBR Green I 突光染料，購自 Invitrogen 公司。LAMP引物(正向外引物F3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3)委托生工生物工程(上海)有限公司合成。1.3主要儀器設(shè)備冰箱；離心機；LAMP實時濁度儀，LA-320C,日本榮研化學(xué)株式會社；漩渦混合器；微量移液器；分析天平。1.4LAMP弓丨物的設(shè)計經(jīng)過廣泛的試驗和比對，本發(fā)明人最終確定選取ITSl序列為羽扇豆特異序列，基于此設(shè)計特異性引物。外引物擴增片段長度:236bp。上游外引物(F3，SEQ ID NO:1)，下游外引物(B3，SEQ ID N0:2)，上游內(nèi)引物(FIP，SEQ ID N0:3)，下游內(nèi)引物(BIP, SEQ ID NO:4)如下:F3:GAAGCCTCACAAGCAGTG ；
B3:TAGGATAAGCGTGTCGCA ；
權(quán)利要求
1.一種鑒定食品過敏原羽扇豆成分的方法，其特征在于，所述方法包括: 以待測樣品的DNA為模板，以特異性擴增羽扇豆ITSl基因的引物進(jìn)行擴增；若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中包含食品過敏原羽扇豆成分。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的特異性擴增羽扇豆ITSl基因的引物包括:上游外引物SEQ ID N0:1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游內(nèi)引物EQ ID N0:3，下游內(nèi)引物 SEQ ID N0:4。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增包括:63土1°C恒溫反應(yīng)60 土 lOmin，然后在80 ± 2°C滅活5 土 lmin，結(jié)束反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的體系中包括引物、Mg2+、甜菜堿、dNTPs ； 其中，Mg2+ 濃度 6±lmM ;甜菜堿濃度 0.8±0.IM ；dNTPs 濃度 1.6±0.2mM。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測樣品是食品或飼料。
7.一種引物，其特征在于，所述引物是LAMP擴增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO:1,下游外引物SEQ ID NO:2，上游內(nèi)引物EQ ID NO:3，下游內(nèi)引物SEQ ID N0:4。
8.權(quán)利要求7所述的引物的用途，用于從待測樣品中鑒定食品過敏原羽扇豆成分。
9.一種鑒定食品過敏原羽扇豆成分的試劑盒，其特征在于，其中包括權(quán)利要求7所述的引物。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括:含有羽扇豆成分的檢測標(biāo)準(zhǔn)品； DNA提取試劑； PH緩沖試劑； 鉀離子溶液； 鎂離子溶液； 銨離子溶液；Tween20 ； 甜菜堿； dNTP ； Bst大片段DNA 聚合酶； 熒光染料；和/或 說明鑒定食品過敏原羽扇豆成分的方法的使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食品過敏原羽扇豆成分LAMP現(xiàn)場快速檢測方法。首次揭示一種食品過敏原羽扇豆成分的LAMP檢測方法。以羽扇豆ITS1基因作為鑒定的靶基因，并設(shè)計了特異性良好的LAMP擴增引物。本發(fā)明的方法可良好地應(yīng)用于鑒定食品過敏原羽扇豆成分，并且具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度。
文檔編號C12N15/11GK103160608SQ201310124448
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者張舒亞, 歐陽可棟, 申恒, 于卓然 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局