專(zhuān)利名稱(chēng)：一種液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程和酶制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中提取制備液態(tài)型凝乳酶制劑的方法。
背景技術(shù)：
凝乳酶是乳酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，它使原奶凝固的過(guò)程分為兩個(gè)階段:酪蛋白微膠粒中α-酪蛋白和β-酪蛋白在K-酪蛋白作用下不會(huì)自發(fā)凝結(jié)，首先，凝乳酶專(zhuān)一性地將K-酪蛋白分解成p-κ-酪蛋白和一種巨肽，使酪蛋白的微膠粒失去穩(wěn)定性；然后，在Ca2+作用下，P-κ-酪蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白之間形成化學(xué)鍵從而產(chǎn)生沉淀。傳統(tǒng)的凝乳酶制備方法是利用牛犢第四胃(皺胃)提取制作，但隨著乳酪產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，單純依靠宰殺幼畜來(lái)生產(chǎn)凝乳酶已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的需求。上世紀(jì)五十年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者一 直努力尋求新的凝乳酶來(lái)源，目前除動(dòng)物凝乳酶外，還發(fā)現(xiàn)了植物凝乳酶(無(wú)花果樹(shù)液、菠蘿果實(shí)等)和微生物凝乳酶(主要來(lái)源于真菌、細(xì)菌)，其中，微生物的生長(zhǎng)特性使得微生物凝乳酶具有廣闊的發(fā)展前景，得到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。本申請(qǐng)人在前期研究中獲得兩株凝乳酶高產(chǎn)菌株(參見(jiàn)《一株枯草芽孢桿菌及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法》，申請(qǐng)?zhí)?CN 201010504167.3 ;《一株解淀粉芽孢桿菌及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法》，申請(qǐng)?zhí)?CN 201110091892.7)，并且對(duì)產(chǎn)酶工藝進(jìn)行了優(yōu)化(參見(jiàn)《一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法》，申請(qǐng)?zhí)?CN 201110420007.5)，獲得較高的產(chǎn)酶水平。在微生物發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶過(guò)程中，凝乳酶直接由生產(chǎn)菌株分泌至發(fā)酵液。現(xiàn)有工藝大多是通過(guò)真空或冷凍干燥將凝乳酶制成固態(tài)劑型，雖穩(wěn)定性較好，但上述干燥方法耗能耗時(shí)，還易造成凝乳酶失活，此外，固態(tài)型酶制劑在保存過(guò)程中不易控制雜菌污染，使用時(shí)還需進(jìn)行復(fù)溶。液態(tài)型酶制劑不僅可避免上述不利因素，且使用更為方便。但是，現(xiàn)有液態(tài)型凝乳酶提取與制備工藝尚存在以下不足之處:凝乳酶活力回收率不高，所制酶制劑活力偏低；發(fā)酵同時(shí)常常產(chǎn)生其他活力較高的蛋白酶雜質(zhì)，在產(chǎn)品保存過(guò)程中，這些蛋白酶的存在不僅會(huì)導(dǎo)致凝乳酶降解，使其液態(tài)劑型難以在室溫條件下長(zhǎng)久保持高凝乳酶活力，酶活半衰期短，穩(wěn)定性較差，而且在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中還會(huì)造成凝乳酶專(zhuān)一性不強(qiáng)，水解凝固過(guò)快，蛋白質(zhì)過(guò)度水解，可溶性小分子物質(zhì)增多，苦味物質(zhì)產(chǎn)生等缺陷，從而降低奶酪的出品率，嚴(yán)重影響奶酪口感和品質(zhì)，在一定程度上限制了液態(tài)型凝乳酶的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、高收率的凝乳酶制備工藝以獲得高品質(zhì)液態(tài)型凝乳酶制劑具有十分重要的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有凝乳酶制備工藝存在的上述缺陷，本申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)研究改進(jìn)，提供一種液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法。本發(fā)明方法凝乳酶活力回收率高，同時(shí)能有效去除酶液中的蛋白酶等雜質(zhì)和殘留菌體，所制酶制劑具有良好的品質(zhì)和穩(wěn)定性，酶專(zhuān)一性強(qiáng)，保存期長(zhǎng)，安全無(wú)毒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法，包括以下步驟:
(I)制備發(fā)酵液:以解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2011045或枯草芽孢桿菌CCTCC NO:M 2010259為發(fā)酵菌株，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵制得發(fā)酵液。(2)固液分離:將步驟(I)所得發(fā)酵液用625 1250目濾布的板框壓濾，取濾液，所述壓濾速率為3飛噸/小時(shí)，此步的目的是除去發(fā)酵液中的菌體及固形物。(3)蒙脫石吸附:向步驟(2)所得濾液中添加終濃度0.5^5% (w/v)的蒙脫石，充分混勻，室溫靜置l(T30min，離心除去蒙脫石及部分懸浮物，收集上清液；優(yōu)選的，所述蒙脫石的添加終濃度為2% (w/v);此步的目的是進(jìn)一步除去粗酶液中的殘余菌體、部分大分子雜質(zhì)及蛋白酶，降低粘度。(4)微濾:將步驟(3)所得上清液經(jīng)孔徑0.5 μ m或1.0 μ m微孔濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，操作壓力0.2^0.3MPa，收集濾液，此步的目的是截留濾除酶液殘留懸浮物、菌體及大分子量膠體。(5)超濾濃縮:將步驟(4)所得濾液經(jīng)孔徑0.002 μ m (截留分子量約為30KDa)超濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，操作壓力0.3^0.5 MPa，收集濾液即為濃縮酶液，此步的目的是截留濾除酶液部分蛋白酶。(6)穩(wěn)定劑穩(wěn)定:向步驟(5)所得濃縮酶液中添加終濃度2(T40% (w/v)的蔗糖或海藻糖，終濃度1(T30% (w/v)的甘油或山梨醇以及終濃度0.0Γ0.05% (w/v)的氯化鈣，混勻，即得液態(tài)型凝乳酶制 成品；優(yōu)選的，所述各穩(wěn)定劑的添加終濃度(《/V)為:蔗糖35%、山梨醇30%、氯化鈣0.05%。具體地，步驟(3)所述離心轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分，離心溫度4°C，離心時(shí)間15min。本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
本發(fā)明在制備得到凝乳酶高產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2011045 (或枯草芽孢桿菌CCTCC NO:M 2010259)發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，首先采用625 1250目板框壓濾進(jìn)行固液分離，初步除去發(fā)酵液中的菌體和固形物，得到粗酶液；再選用終濃度0.5^5% (w/v)的蒙脫石作為吸附劑，進(jìn)一步除去粗酶液中的殘余菌體、部分大分子雜質(zhì)以及蛋白酶，從而有效降低粗酶液粘度，檢測(cè)表明，相對(duì)于凝乳酶而言，蒙脫石對(duì)蛋白酶的吸附作用更為特異，經(jīng)處理的凝乳酶活力損失極低，此外，蒙脫石作為食品安全級(jí)物質(zhì)完全滿足生產(chǎn)食品用酶的特殊要求；進(jìn)一步采用微濾技術(shù)(孔徑0.5 μ m或1.0 μ m的微孔濾膜)濾除懸浮物、菌體及大分子量膠體，再結(jié)合超濾濃縮技術(shù)(孔徑0.002 μ m的超濾膜，截留分子量約為30KDa)截留分離部分蛋白酶雜質(zhì)，從而有效降低酶液蛋白酶活力；最后添加經(jīng)有效比例復(fù)配而成的穩(wěn)定劑，制成可在常溫下長(zhǎng)期保存的適于奶酪加工生產(chǎn)的液態(tài)型凝乳酶制劑。上述“板框壓濾-蒙脫石吸附-微濾-超濾-穩(wěn)定劑穩(wěn)定”各工序之間層層遞進(jìn)、協(xié)同增效。與現(xiàn)有凝乳酶制備工藝相比，本發(fā)明凝乳酶活力回收率高(可達(dá)91.4%)，同時(shí)能有效去除蛋白酶雜質(zhì)，明顯降低酶液蛋白酶活力，從而大大提升酶制劑的品質(zhì)和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存期，酶專(zhuān)一性強(qiáng)；本發(fā)明可有效而徹底地除去酶液殘留菌體，故無(wú)需添加防腐劑，只需添加安全無(wú)毒的穩(wěn)定劑即可獲得長(zhǎng)久的保質(zhì)期。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步的說(shuō)明。以下實(shí)施例所使用實(shí)驗(yàn)器材如下:微孔濾膜購(gòu)自三達(dá)膜科技(廈門(mén))有限公司( L徑0.5 μ m和1.0 μ m)，超濾膜購(gòu)自三達(dá)膜科技(廈門(mén))有限公司(孔徑0.002 μ m);所述各原料試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純成產(chǎn)品；所使用各儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域常規(guī)設(shè)備；所述試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常用方法。實(shí)施例1
(I)制備發(fā)酵液
以解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2011045為發(fā)酵菌株，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵獲得含凝乳酶的發(fā)酵液(具體發(fā)酵方法參見(jiàn)《一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法》，專(zhuān)利號(hào):CN201110420007.5);測(cè)得發(fā)酵液中凝乳酶活力為6549 SU/ml，蛋白酶活力為812U/ml。(2)固液分離
將步驟(I)所得發(fā)酵液用800目濾布的板框壓濾，濾除發(fā)酵液中的菌體和固形物，壓濾速率為4噸/小時(shí)，收集濾液。(3)蒙脫石吸附
向步驟(2)所得濾液中添加終濃度0.5% (w/v)的蒙脫石，充分混勻，室溫靜置15min，于4°C以10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心 15min，除去蒙脫石及部分懸浮雜質(zhì)，收集上清液。(4)微濾
將步驟(3)所得上清液經(jīng)孔徑1.0ym的微孔濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，截留濾除懸浮物、細(xì)菌及大分子量膠體物質(zhì)，操作壓力0.2 MPa，收集濾液。(5)超濾濃縮
將步驟(4)所得濾液經(jīng)孔徑0.002 μ m (截留分子量約30KDa)的超濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，截留濾除分子量大于30KDa的雜質(zhì)(包括一種胞外主要的蛋白酶)，操作壓力0.5 MPa，收集濾液即得濃縮4倍的酶液；測(cè)得濃縮酶液凝乳酶活力為22840SU/ml，總凝乳酶活力回收率為87.2%，濃縮酶液蛋白酶活力1598 U/ml，總蛋白酶活力回收率49.2%。實(shí)施例2
(I)制備發(fā)酵液
以解淀粉芽孢桿菌CCTCC NO:M 2011045為發(fā)酵菌株，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵獲得含凝乳酶的發(fā)酵液(具體發(fā)酵方法參見(jiàn)《《一種基于兩階段溶氧控制策略生產(chǎn)凝乳酶的方法》，申請(qǐng)?zhí)?CN 201110420007.5);測(cè)得發(fā)酵液中凝乳酶活力為6549 SU/ml，蛋白酶活力為812U/ml。(2)固液分離
將步驟(I)所得發(fā)酵液用800目濾布的板框壓濾，濾除發(fā)酵液中的菌體和固形物，壓濾速率為4噸/小時(shí)，收集濾液。(3)蒙脫石吸附
向步驟(2)所得濾液中添加終濃度2% (w/v)的蒙脫石，充分混勻，室溫靜置15min，于40C以10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15min，除去蒙脫石及部分懸浮雜質(zhì)，收集上清液。(4)微濾
將步驟(3)所得上清液經(jīng)孔徑0.5μπι的微孔濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，截留濾除懸浮物、細(xì)菌及大分子量膠體物質(zhì)，操作壓力0.3 MPa，收集濾液。
(5)超濾濃縮
將步驟(4)所得濾液經(jīng)孔徑0.002 μ m (截留分子量約30KDa)的超濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，截留濾除分子量大于30KDa的雜質(zhì)(包括一種胞外主要的蛋白酶)，操作壓力0.4 MPa，收集濾液即得濃縮2倍的酶液；測(cè)得濃縮酶液凝乳酶活力為11972 SU/ml，總凝乳酶活力回收率為91.4%，濃縮酶液蛋白酶活力709U/ml，總蛋白酶活力回收率43.7%。實(shí)施例3
(I)制備發(fā)酵液
以枯草芽孢桿菌CCTCC NO:M 2010259為發(fā)酵菌株，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵獲得含凝乳酶的發(fā)酵液(具體發(fā)酵方法參見(jiàn)《一株枯草芽孢桿菌及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法》，專(zhuān)利號(hào):CN 201010504167.3);測(cè)得發(fā)酵液中凝乳酶活力為1229 SU/ml，蛋白酶活力為148U/ml。(2)固液分離
將步驟(I)所得發(fā)酵液用625目濾布的板框壓濾，濾除發(fā)酵液中的菌體和固形物，壓濾速率為6噸/小時(shí)，收集濾液。(3)蒙脫石吸附
向步驟(2)所得濾液中添加終濃度5% (w/v)的蒙脫石，充分混勻，室溫靜置30min，于40C以10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15min，除去蒙脫石及部分懸浮雜質(zhì)，收集上清液。(4)微濾
將步驟(3)所得上清液經(jīng)孔 徑0.5μπι的微孔濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，截留濾除懸浮物、細(xì)菌及大分子量膠體物質(zhì)，操作壓力0.3MPa，收集濾液。(5)超濾濃縮
將步驟(4)所得濾液經(jīng)孔徑0.002 μ m (截留分子量約30KDa)的超濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，截留濾除分子量大于30KDa的雜質(zhì)(包括一種胞外主要的蛋白酶)，操作壓力0.4 MPa，收集濾液即得濃縮2倍的酶液；測(cè)得濃縮酶液凝乳酶活力為2067 SU/ml，總凝乳酶活力回收率為84.1%，濃縮酶液蛋白酶活力152 U/ml，總蛋白酶活力回收率51.4%。實(shí)施例4
向?qū)嵤├?所得4倍濃度酶液中添加多種穩(wěn)定劑，各穩(wěn)定劑的添加終濃度(w/v)為:海藻糖20%,甘油10%，氯化鈣0.01%,混合均勻制成液態(tài)型凝乳酶制劑成品。經(jīng)檢測(cè)，該酶制劑在室溫下放置6個(gè)月，凝乳酶活力保存率為76.2%，放置9個(gè)月，凝乳酶活力保存率為61.4%。實(shí)施例5
向?qū)嵤├?所得4倍濃度酶液中添加多種穩(wěn)定劑，各穩(wěn)定劑的添加終濃度(w/v)為 海藻糖30%，山梨醇15%，氯化鈣0.01%,混合均勻制成液態(tài)型凝乳酶制劑成品。經(jīng)檢測(cè)，該酶制劑在室溫下放置6個(gè)月，凝乳酶活力保存率為81.4%，放置9個(gè)月，凝乳酶活力保存率為68.7%。實(shí)施例6
向?qū)嵤├?所得4倍濃度酶液中添加多種穩(wěn)定劑，各穩(wěn)定劑的添加終濃度(w/v)為 海藻糖40%，山梨醇15%，氯化鈣0.02%,混合均勻制成液態(tài)型凝乳酶制劑成品。經(jīng)檢測(cè)，該酶制劑在室溫下放置6個(gè)月，凝乳酶活力保存率為87.2%，放置9個(gè)月，凝乳酶活力保存率為71.8%。
實(shí)施例7
向?qū)嵤├?所得4倍濃度酶液中添加多種穩(wěn)定劑，各穩(wěn)定劑的添加終濃度(w/v)為:海藻糖35%，山梨醇30%，氯化鈣0.05%,混合均勻制成液態(tài)型凝乳酶制劑成品。經(jīng)檢測(cè)，該酶制劑在室溫下放置6個(gè)月，凝乳酶活力保存率為89.6%，放置9個(gè)月，凝乳酶活力保存率為78.3%。綜上所述，與現(xiàn)有凝乳酶制備工藝相比，本發(fā)明凝乳酶活力回收率高，同時(shí)能有效去除蛋白酶雜質(zhì)，明顯降低酶液蛋白酶活力，從而大大提升酶制劑的品質(zhì)和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存期。以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例?？梢岳斫猓绢I(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，均應(yīng)認(rèn)為包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備發(fā)酵液:以解淀粉芽孢桿菌CCTCCNO:M 2011045或枯草芽孢桿菌CCTCC NO:M 2010259為發(fā)酵菌株，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵制得發(fā)酵液； (2)固液分離:將步驟(I)所得發(fā)酵液用625 1250目濾布的板框壓濾，取濾液，所述壓濾速率為3飛噸/小時(shí)； (3)蒙脫石吸附:向步驟(2)所得濾液中添加終濃度0.5^5% (w/v)的蒙脫石，充分混勻，室溫靜置l(T30min，離心除去蒙脫石，收集上清液； (4)微濾:將步驟(3)所得上清液經(jīng)孔徑0.5 μ m或1.0 μ m微孔濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，操作壓力0.2 0.3MPa，收集濾液； (5)超濾濃縮:將步驟(4)所得濾液經(jīng)孔徑0.002 μ m超濾膜錯(cuò)流過(guò)濾，操作壓力0.3^0.5 MPa，收集濾液即為濃縮酶液； (6)穩(wěn)定劑穩(wěn)定:向步驟(5)所得濃縮酶液中添加終濃度2(T40%(w/v)的蔗糖或海藻糖，終濃度1(T30% (w/v)的甘油或山梨醇以及終濃度0.0Γ0.05% (w/v)的氯化鈣，混勻，即得液態(tài)型凝乳酶制成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述蒙脫石的添加終濃度為2% (w/v)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述離心轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分，離心溫度4°C，離心時(shí)間lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法，其特征在于:步驟(6)所述各穩(wěn)定劑的添加終濃度(w/v)為:蔗糖35%、山梨醇30%、氯化鈣0.05%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種液態(tài)型凝乳酶制劑的制備方法。包括以下步驟(1)以解淀粉芽孢桿菌CCTCC NOM2011045或枯草芽孢桿菌CCTCC NOM2010259為發(fā)酵菌株制備發(fā)酵液；(2)板框壓濾，固液分離；(3)蒙脫石吸附；(4)微濾；(5)超濾濃縮；(6)向濃縮酶液中添加終濃度20～40%(w/v)的蔗糖或海藻糖，終濃度10～30%(w/v)的甘油或山梨醇以及終濃度0.01～0.05%(w/v)的氯化鈣，混勻，制得成品。本發(fā)明方法凝乳酶活力回收率高，同時(shí)能有效去除酶液中的蛋白酶等雜質(zhì)和殘留菌體，所制酶制劑具有良好的品質(zhì)和穩(wěn)定性，酶專(zhuān)一性強(qiáng)，保存期長(zhǎng)，安全無(wú)毒。
文檔編號(hào)A23C19/032GK103211035SQ20131012566
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者丁明亮, 王博達(dá), 王楠, 王清偉, 丁重陽(yáng), 顧正華, 張梁, 石貴陽(yáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)