專利名稱：一株耐冷凍面包酵母菌株及其基因無痕敲除方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一株耐冷凍面包酵母菌株及其基因無痕敲除方法。
背景技術(shù)：
面包酵母(Baker’sYeast,學(xué)名 Saccharomyces cerevisiae)是一種重要的工業(yè)微生物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是饅頭、面包、餅干等面食生產(chǎn)過程中最重要的微生物發(fā)酵齊U、生物疏松劑和生物營(yíng)養(yǎng)劑。隨著冷凍面團(tuán)生產(chǎn)技術(shù)的迅速發(fā)展，耐冷凍面包酵母及其耐冷凍機(jī)制得到了廣泛研究，在歐美、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，冷凍面團(tuán)技術(shù)也已廣泛應(yīng)用于焙烤工業(yè)。普通面包酵母的耐冷凍性差是限制冷凍面團(tuán)技術(shù)發(fā)展的主要因素。海藻糖是酵母細(xì)胞內(nèi)一種自身保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程免受凍傷。增加酵母胞內(nèi)海藻糖含量可以提高面包酵母的耐冷凍性能。但是隨著公眾對(duì)食品安全的關(guān)注，通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法構(gòu)建的菌株，由于殘留非自身的外源基因，其生產(chǎn)應(yīng)用受到限制。因此有必要對(duì)酵母進(jìn)行無痕基因敲除，以保證不會(huì)留下任何外源DNA。酵母菌的無痕修飾起初是為了除去篩選標(biāo)記，以便在單個(gè)菌株中進(jìn)行多基因操作。去除篩選標(biāo)記主要有兩種方法，一種是在靶基因敲除后，利用敲除元件中正向重復(fù)序列(hisG)之間的同源重組。另一種則是利用重組酶介導(dǎo)的敲除系統(tǒng),例如Cre/Loxp系統(tǒng)等。利用第一種方法，首先需要構(gòu)建帶有“hisG-URA3-hisG”的質(zhì)粒，然后使用長(zhǎng)引物直接PCR得到敲除元件，通過轉(zhuǎn)化敲除目的基因后，再反向篩選，利用正向重復(fù)序列(hisG)之間的同源重組去除篩選標(biāo)記。此法中長(zhǎng)引物包含兩部分序列，一部分是與質(zhì)粒退火的序列，另一部分是與靶基因兩側(cè)的側(cè)翼序列相同的基因序列。通過這種方法得到的轉(zhuǎn)化子，其基因組的靶位置上，會(huì)殘留一個(gè)重復(fù)序列。利用第二種方法，通過轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記兩側(cè)帶有重組酶位點(diǎn)的敲除元件到酵母中，一步整合實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除，然后轉(zhuǎn)化另一個(gè)編碼重組酶的質(zhì)粒，以實(shí)現(xiàn)抗性標(biāo)記的去除。在工業(yè)酵母的改造中，這個(gè)系統(tǒng)具有很高的效率，但是其仍會(huì)留下外源序列(單一 1xp位點(diǎn))，并且在進(jìn)行多基因敲除時(shí)，留下的這些位點(diǎn)增大了發(fā)生染色體重排的可能性。2006年，日本學(xué)者使用帶有靶基因一側(cè)40bp重復(fù)序列的長(zhǎng)引物，通過融合PCR構(gòu)建的無痕敲除元件，可以方便的實(shí)現(xiàn)重組，并且不會(huì)留下外源基因。但是這種方法中，40bp的重復(fù)序列重組效率較低?？傊?，本領(lǐng)域仍需要一種高效的無痕基因敲除方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一株耐冷凍面包酵母菌株及其基因無痕敲除方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技 術(shù)方案:本發(fā)明提供的面包酵母菌株是具有快速發(fā)酵性能的耐冷凍面包酵母菌株，具體為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY_14aΔU。該菌已于2013年3月28保藏于中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱06110:，地址為:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7379。所述面包酵母菌株在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，發(fā)酵后胞內(nèi)海藻糖含量占細(xì)胞干重11.7%，較親本菌株提高了 134%，細(xì)胞在液體面團(tuán)中冷凍21天后，存活率達(dá)到78%，是親本菌株的2.6倍。所述面包酵母菌株具體可以通過對(duì)出發(fā)菌株面包酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC31616 (中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,公眾可以通過該保藏管理中心獲得出發(fā)菌株CICC31616)的中性海藻糖酶編碼基因NTHl的全部序列進(jìn)行無痕敲除來實(shí)現(xiàn)。上述基因無痕敲除可以用以下方法實(shí)現(xiàn)。各步驟所涉及具體操作方法參考現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版,科學(xué)出版社，1995。用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到面包酵母出發(fā)菌株，通過同源重組以實(shí)現(xiàn)出發(fā)菌株的URA3基因突變。用PCR方法分別擴(kuò)增敲除靶基因NTHl的上游和下游、長(zhǎng)度為0.5 2.0kb的同源序列片段，然后通過融合PCR，將上、下游序列融合成無縫片段。將該片段克隆至酵母整合質(zhì)粒YIplac211上，獲得能夠進(jìn)行整合敲除的質(zhì)粒。在整合敲除質(zhì)粒的上游同源臂或者下游同源臂中，選擇合適的單一酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒酶切線性化。通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將線性化的整合敲除質(zhì)粒導(dǎo)入面包酵母中，用不含尿嘧啶(uracil)的酵母合成培養(yǎng)基篩選發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株。將經(jīng)過鑒定的發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株，經(jīng)含有5-氟乳清酸(5-F0A)合成培養(yǎng)基平板反向篩選獲得發(fā)生第二步整合重組的酵母突變株。用PCR方法獲得出發(fā)菌株正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到發(fā)生了第二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標(biāo)記基因。本發(fā)明所述面包酵母菌株可應(yīng)用于面包生產(chǎn)中。本發(fā)明同時(shí)提供了一種專門用于鑒定所述耐冷凍面包酵母菌株的基因序列，該基因序列是用NTHl-D-F和NTHl-U-R引物對(duì)以所述耐冷凍面包酵母菌株基因組為模板擴(kuò)增的片段，其序列如表I所示。有益效果:本發(fā)明針對(duì)面包酵母?jìng)鹘y(tǒng)基因敲除中篩選標(biāo)記殘留，不便進(jìn)行多基因敲除研究，以及殘留外源基因的問題，提供了一株面包酵母菌株及一種高效的無痕基因敲除方法。本發(fā)明不僅可用于研究酵母基因的功能和代謝機(jī)制，而且由于所獲得的突變株不殘留任何外源基因，可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。


圖1為帶有突變ura3基因面包酵母菌株BY-HaA U的表型驗(yàn)證圖。圖2為整合敲除質(zhì)粒YIplac211_UD的構(gòu)建流程示意圖。圖3為整合敲除質(zhì)粒YIplac211_UD的電泳驗(yàn)證圖。圖4為整合敲除質(zhì)粒YIplac211_UD與酵母基因組的兩步整合重組流程示意圖。圖5為發(fā)生第一步整合重組的菌株BY-14aA U-U的電泳驗(yàn)證圖。圖6為發(fā)生第二步整合重組的菌株BY-HaAU-Λ N的電泳驗(yàn)證圖。

圖7為回復(fù)ura3突變的整合重組菌株BY_14a Λ N靶基因位置的部分測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:無痕敲除中性海藻糖酶基因NTHl面包酵母的構(gòu)建本實(shí)例所用的出發(fā)菌株CICC31616，本實(shí)例中改造后的面包酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)于2013年3月28日保藏于中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.7379。所述質(zhì)粒Hplac211的來源見R.D.Gietz,and A.Sugino，New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with invitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites.Gene74(1988)527-34。所述大腸桿菌DH5a購(gòu)自Takara公司。所述YI3D培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基，所述酵母合成培養(yǎng)基(SD)成分為2%葡萄糖、0.67% ΥΝΒ、不含尿嘧啶的氨基酸混合物溶液，固體培養(yǎng)基含2%進(jìn)口瓊脂粉。根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)了下述實(shí)施例中各引物。表1.本實(shí)施例中所用到的引物
權(quán)利要求
1.一株耐冷凍面包酵母菌株，具體為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14AAU，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.7379。
2.如權(quán)利要求1所述的一株耐冷凍面包酵母菌株，其特征在于，所述面包酵母菌株發(fā)酵后胞內(nèi)海藻糖含量占細(xì)胞干重11.7% ;細(xì)胞在液體面團(tuán)中冷凍21天后，存活率達(dá)到78%，是親本菌株的2.6倍。
3.如權(quán)利要求1所述的一株耐冷凍面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法是通過融合PCR技術(shù)和整合型載體質(zhì)粒YIplac211介導(dǎo)的兩步基因整合法，將編碼中性海藻糖酶的基因NTHl無痕敲除來實(shí)現(xiàn)的。
4.如權(quán)利要求3所述的一株耐冷凍面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟包括:用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到面包酵母出發(fā)菌株，通過同源重組實(shí)現(xiàn)出發(fā)菌株的URA3基因突變；用PCR方法分別擴(kuò)增敲除靶基因NTHl上游和下游、長(zhǎng)度為0.5 2.0kb的同源序列片段，然后通過融合PCR，將上、下游序列融合成無縫片段；將該片段克隆至酵母整合質(zhì)粒YIplac211上，獲得能夠進(jìn)行整合敲除的質(zhì)粒；在整合敲除質(zhì)粒的上游同源臂或者下游同源臂中，選擇合適的單一酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒酶切線性化；通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將線性化的整合敲除質(zhì)粒導(dǎo)入面包酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基篩選發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株；將經(jīng)過鑒定的發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株，經(jīng)含有5-氟乳清酸合成培養(yǎng)基平板反向篩選獲得發(fā)生第二步整合重組的酵母突變株；用PCR方法獲得出發(fā)菌株正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到發(fā)生了二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標(biāo)記基因。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一株耐冷凍面包酵母菌株在面包生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公布了一株耐冷凍面包酵母菌株及其構(gòu)建方法，具體是通過無痕敲除基因NTH1構(gòu)建的耐冷凍面包酵母BY-14AΔU，保藏編號(hào)CGMCC No.7379。無痕基因敲除方法構(gòu)建耐冷凍面包酵母，是通過融合PCR和酵母整合質(zhì)粒YIplac211，敲除編碼中性海藻糖酶基因NTH1來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了將面包酵母NTH1基因快速、高效地?zé)o痕敲除，菌株BY-14AΔU在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，胞內(nèi)海藻糖含量較親本菌株提高了134％；細(xì)胞在液體面團(tuán)中冷凍21天后，存活率達(dá)到78％，是親本菌株的2.6倍。本發(fā)明構(gòu)建的酵母菌中基因組上不殘留任何外源基因，因此可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/18GK103232947SQ201310127538
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者肖冬光, 王光路, 董建, 張翠英 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)