專利名稱：基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測豬薩佩羅病毒的方法。
背景技術：
豬薩佩羅病毒(Porcine Sapelovirus)是微RNA病毒科薩佩羅病毒屬的一種豬的病毒。它可以引起豬的神經(jīng)紊亂、繁殖失敗、呼吸衰竭、肺炎以及腹瀉等綜合癥狀。該病毒可以同其他豬的病毒發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來非常巨大的經(jīng)濟威脅。因此，對該種病毒的檢測，是早預防、早防治以及解除豬群間相互感染的重要措施。本實驗針對的是中國第一株薩佩羅病毒(PSV-Csh)(基因編號:HQ875059)，該病毒的基因組全長是7502個堿基對，只有一個開放閱讀框架，編碼一個多聚蛋白前體，在基因組的5’端和3’端是基因組的非翻譯區(qū) 5’ UTR 和 3’ UTR0目前，對于該病毒的檢測手段有很多，如病毒的分離、酶聯(lián)免疫吸附法、各種PCR手段。病毒分離和酶聯(lián)免疫吸附法都是最基礎的檢測方法，但是卻也是最耗時的檢測手段，對于突發(fā)性的疫病的提前診斷，不能做到盡早的檢測，這樣可能會耽誤了疫病的控制。分子生物學的檢測方法已經(jīng)越來越受到重視，如RT-PCR已經(jīng)成為一種常規(guī)的檢測手段，但是這些方法需要高精密的儀器和熟練的技術。對于那些偏遠地區(qū)的檢測機構和動物診所來說，這些方法并不能發(fā)揮它們的作用。本發(fā)明報道的用于檢測豬薩佩羅病毒的環(huán)介導等溫擴增技術，是一種簡單、快速、高靈敏、高特異的檢測方法，最值得關注的是該檢測方法不需要昂貴的儀器，只需要一個水浴鍋，即可完成整個檢測。環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)，是由日本學者Notoni等人研發(fā)的一種在恒溫條件下完成的具有高特異和高效率的核酸擴增技術。該方法針對目的基因的6個特異區(qū)域設計4個引物，在鏈置換DNA聚合酶-Bst DNA聚合酶的作用下，恒溫保持幾十分鐘，即可完成擴增。其原理是內引物FIP的F2序列起始反應，外引物F3進行鏈置換反應，置換出新鏈，然后內引物BIP與新鏈結合打開莖環(huán)，B3在BIP外側形成互補鏈，最終形成一個類似啞鈴形狀的DNA結構，該結構作為擴增反應的起始結構，開始了循環(huán)和延伸，保證了反應的不斷進行。逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)是在反應管內加入DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶，一步法完成RNA的擴增。這不僅節(jié)省了 RNA逆轉錄為DNA的時間和實驗耗材、試劑，也提高了 RNA的擴增效率。RT-LAMP在病毒檢測方面有著傳統(tǒng)檢測方法所無法比擬的優(yōu)勢:①快速:整個實驗的完成只需2h，對于熟練地工作人員來說只需1.5h，同時它不要特殊的儀器，只要在一個恒溫的設備中即可完成該實驗，無需復雜的溫控設備；②擴增效率高:幾個拷貝反應結束后，產(chǎn)物可以達到IO9拷貝檢測方便快速:由于反應產(chǎn)物很多，在反應管內會形成白色渾濁物，可以據(jù)此判斷反應是否發(fā)生，也可以利用熒光染料鈣黃綠素進行閉管檢測，這樣既避免了核酸造成的環(huán)境污染又節(jié)省了電泳所需時間RT-LAMP節(jié)省了將RNA逆轉錄為DNA的過程，避免了核酸的二次污染以及RNA酶的污染；⑤特異性高:4條引物需要模板結合，才會出現(xiàn)啞鈴形狀，才能出現(xiàn)循環(huán)和大量的擴增。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、快速、簡單地檢測豬薩佩羅病毒的方法，可應用于各級動物預防控制中心、各級動物診所以及企業(yè)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法。本發(fā)明所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，包含如下步驟:(I)設計4條引物所述引物包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP和內引物BIP，所述引物序列如SEQID NO: 1-4 所示； (2)制備待測樣品采用商品化的RNA\DNA病毒核酸的提取試劑盒提取樣品的RNA ；(3)配制反應液采用商品化的RT-LAMP試劑盒，根據(jù)說明書在反應管中加入反應緩沖液、酶混液、4條引物、熒光染料鈣黃綠素、所述RNA和水，總體積為25 μ L ;(4)進行反應將配制好的所述反應管置于反應設備中，60 65°C恒溫反應lh，83°C 5min結束反應；(5)結果檢測。具體操作如下:(I)設計4條引物通過在線搜索引擎BLAST和序列分析軟件DNAstar篩選出薩佩羅病毒的相對保守序列區(qū)5’ UTR0根據(jù)這段序列，利用Primer Explorer VE4.0設計出4條引物,其中包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP和內引物BIP，引物序列如SEQ ID N0:l_4所示。 (2)制備待測樣品采用商品化的RNA\DNA病毒核酸的提取試劑盒提取樣品的RNA。(3)配制反應液采用商品化的RT-LAMP試劑盒，根據(jù)說明書在反應管中加入12.5μ L2X反應緩沖液(RM) ;1.0yL酶混合液(EM);終濃度為0.20 μ M的外引物F3和Β3 ;終濃度為:1.6 μ M的內引物FIP和BIP ;1.0μ L熒光染料鈣黃綠素；5μ L所述RNA ;補足去離子水至總體積25 μ L0(4)進行反應將配置好的反應管置于實時監(jiān)測濁度儀或水浴鍋中，60 65°C恒溫反應lh，83°C 5min結束反應。(5)結果判斷。將反應管置于實時監(jiān)測濁度儀中，根據(jù)實時監(jiān)測濁度儀輸出的擴增曲線判斷反應液中的反應情況。將反應管置于水浴鍋中，由于反應液中加入了熒光染料鈣黃綠素，所以可根據(jù)反應前后反應液顏色的變化判斷反應是否發(fā)生:a)樣品反應管液體呈黃綠色，該樣本檢測結果為陽性；b)樣品反應管液體呈橙紅色，該樣本檢測結果為陰性。此外，也可以采用渾濁度觀察法，如果發(fā)生反應，反應液的顏色會由透明變?yōu)槿榘咨?，但是該方法的精確度不高。根據(jù)本發(fā)明所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，優(yōu)選地，反應溫度為63°C。本發(fā)明的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒檢測的方法，檢測方便快速，僅經(jīng)過一步反應便可達到檢測目的；檢測靈敏度高，擴增模板僅需2.97 X IO2拷貝/微升；鑒定簡便，根據(jù)實時監(jiān)測濁度儀或熒光染料鈣黃綠素的變色情況即可判斷反應是否發(fā)生。以下將結合附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產(chǎn)生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。


圖1是具體實施例1中的實時監(jiān)測濁度儀的監(jiān)測結果。1:63°C ；2:65V ;3:61°C。圖2是具體實施例2中的實時監(jiān)測濁度儀的監(jiān)測結果。1:豬薩佩羅病毒。圖3是具體實施例3中的實時監(jiān)測濁度儀的監(jiān)測結果。左起依次為:2.97X IO8拷貝、2.97X IO9 拷貝、2.97X IO7 拷貝、2.97X IO6 拷貝、2.97X IO5 拷貝、2.97X IO4 拷貝、
2.97 X IO3拷貝、2.97 X IO2拷貝、2.97 X IO1拷貝(水平線)、陰性對照(水平線)。本發(fā)明中，所用 試劑、儀器均可從市售獲得。所用病毒株由本實驗室保存。
具體實施例方式以下結合附圖和附表通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1:RT_LAMP檢測豬薩佩羅病毒最佳反應溫度在GeneBank上獲得中國第一株豬薩佩羅病毒的全基因組(登錄號為HQ875059)，根據(jù)LAMP引物設計原則，篩選出該基因組的保守序列區(qū)5’UTR，針對該序列的六個特異序列區(qū)設計出4條引物并合成。薩佩羅病毒的RNA模板的獲得是利用天根的RNA\DNA提取試劑盒，按照說明書提取病毒純液。按照北京蘭譜生物科技有限公司購買的RT-LAMP反應試劑盒的操作說明書配置反應體系，總體積為25 μ L0外引物F3和Β3的終濃度為0.2 μ Μ，內引物FIP和BIP的終濃度為1.6μΜ。按照如上反應體系配置反應液，設計三個反應溫度:61°C、63°C和65°C。將平行兩組反應管分別放置于實時監(jiān)測濁度儀和水浴鍋中，反應時間為60min。實時監(jiān)測濁度儀的檢測結果如圖1所示，擴增曲線明顯指示63°C為最佳反應溫度。置于水浴鍋中的第二組反應管中顯示置于63°C的反應液的熒光強度比其它反應管強，雖然反應的渾濁度肉眼觀察區(qū)別不明顯，但也可以說明63°C為最佳反應溫度。實施例2 =RT-LAMP檢測豬薩佩羅病毒的特異性選取不含有薩佩羅病毒的豬捷申病毒(？17\哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈)、豬腸道病毒9 (PEV9\實驗室保存)、豬口蹄疫病毒(FMDV\購買于中國中牧實業(yè)股份有限公司)、豬腸道病毒9 (PEV9\實驗室保存)、腦心肌炎病毒(EMCV\蘭州獸醫(yī)研究所惠贈)、豬傳染性胃腸炎(TGEV\實驗室保存)、豬流行性腹瀉(PEDV實驗室保存)、豬藍耳病毒(PRRSV\實驗室保存)核酸，按照如上的反應體系配置反應液，兩組平行的反應管，分別放置在實時監(jiān)測濁度儀和水浴鍋中，溫度設置63°C，保存70min，80°C 5min結束反應。實時監(jiān)測濁度儀的檢測結果如圖2所示，擴增曲線明顯指示只有豬薩佩羅病毒的樣品發(fā)生了擴增。置于水浴鍋中的第二組反應管中顯示只有含有豬薩佩羅病毒的反應液的顏色由橙紅色變成黃綠色。說明本發(fā)明設計的引物的特異性很高。實施例3 =RT-LAMP檢測豬薩佩羅病毒的靈敏度將提取的豬薩佩羅病毒的RNA用無RNase的水以10倍梯度進行稀釋，RNA母液的濃度為:2.97Χ109拷貝/微升。依次稀釋為2.97\108拷貝/微升、2.97父107拷貝/微升、2.97Χ106拷貝/微升、2.97Χ105拷貝/微升、2.97Χ104拷貝/微升、2.97Χ103拷貝、2.97X IO2拷貝/微升和2.97Χ101拷貝/微升。按照如上的反應體系配置反應液，兩組平行的反應管，分別放置于實時監(jiān)測濁度儀和水浴鍋中，溫度設置為63°C，保存60min，80°C 5min結束反應。結果分析方法同上，實驗結果最終顯示豬薩佩羅病毒的RT-LAMP的最低檢出限度為2.97 X IO2拷貝/微升，但是此反應最佳的反應濃度是2.97 X IO8拷貝/微升，并不是模板濃度越高越好。實施例4 =RT-LAMP檢測豬薩佩羅病毒的臨床驗證選取28份健康公豬(湖南)的糞樣，提取RNA。按照如上的反應體系配置反應液，兩組進行平行反應。分別放置于實時監(jiān)測濁度儀和水浴鍋中，溫度設為63°C，保存60min，80°C 5min結束反應。結果分析方法同上，實驗結果顯示只有3份樣品出現(xiàn)擴增，陽性率為
10.7%。對相同的樣品用普通RT-PCR進行驗證，RT-PCR結果顯示有2份樣品出現(xiàn)擴增，陽性率為7.1%。說明RT-LAMP比RT-PCR方法靈敏度更加敏銳，可以檢測到樣品中低含量的病毒。以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本 發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
權利要求
1.一種基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，包含如下步驟: (1)設計4條引物 所述弓I物包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP和內引物BIP，所述弓I物序列如SEQ IDNO: 1-4 所示； (2)制備待測樣品 采用商品化的RNA\DNA病毒核酸的提取試劑盒提取樣品的RNA ； (3)配制反應液 采用商品化的RT-LAMP試劑盒，根據(jù)說明書在反應管中加入反應緩沖液、酶的混合I液、所述4條引物、熒光染料鈣黃綠素、所述RNA和水，總體積為25 μ L ; (4)進行反應 將配制好的所述反應管置于反應設備中，60 65°C恒溫反應lh，83°C 5min結束反應； (5)結果檢測。
2.如權利要求1中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，所述4條引物是通過在線搜索引擎BLAST和序列分析軟件DNAstar篩選出薩佩羅病毒的相對保守序列區(qū)5’UTR并根據(jù)這段序列利用PrimerExplorer VE4.0設計出來的。
3.如權利要求1中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述外引物在所述反應液的終濃度為0.20 μ M0
4.如權利要求3中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述內引物在所述反應液的終濃度為1.6μΜ。
5.如權利要求1中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述反應設備為實時監(jiān)測濁度儀。
6.如權利要求5中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(5)中，所述結果檢測的方法為根據(jù)所述實時監(jiān)測濁度儀輸出的擴增曲線判斷所述反應液中的反應情況。
7.如權利要求1中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述反應設備為水浴鍋。
8.如權利要求7中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(5)中，所述結果檢測的方法為根據(jù)反應前后的所述反應液顏色的變化判斷反應是否發(fā)生:a)所述樣品反應管液體呈黃綠色，則所述樣品檢測結果為陽性；b)所述樣品反應管液體呈橙紅色，則所述樣品檢測結果為陰性。
9.如權利要求1中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:反應溫度為63°C。
10.如權利要求1中所述的基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述RNA在所述反應液中的終濃度為2.97X IO8拷貝/微升。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術應用領域，提供了一種基于逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術檢測豬薩佩羅病毒的方法。本發(fā)明的方法為篩選出豬薩佩羅病毒的保守序列區(qū)5'UTR并根據(jù)所述保守序列區(qū)設計4條引物；準備待測樣品；配制反應液進行逆轉錄環(huán)介導等溫擴增反應(RT-LAMP)；通過實時監(jiān)測濁度儀輸出的擴增曲線、熒光染料鈣黃綠素的變色情況或者直接觀察反應液的濁度變化鑒定反應結果。對于相關的檢測部門或公司來說，本發(fā)明提供了一種廉價、快速、高效、高特異的檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK103173577SQ201310127728
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權日2013年4月12日
發(fā)明者崔立, 王春艷, 郁達義, 華修國, 劉雨瀟, 湯賽冬 申請人:上海交通大學