專利名稱：枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法，特別是一種枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
氮元素是生物體必須也是需求量最大的礦物質(zhì)元素，用于合成生物體所需的氨基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮的利用在農(nóng)作物生產(chǎn)中占非常重要的地位，植物氮代謝及其調(diào)控一直備受全世界關(guān)注，氮肥利用率低及過量施用氮肥造成水環(huán)境污染的問題也是世界性難題。谷氨酰胺合成酶是植物氮同化過程的關(guān)鍵酶，通過植物基因工程方法研究GS在植物氮素營養(yǎng)代謝中的作用，改變植物氮代謝途徑中GS在氮同化中的表達(dá)水平,或在植物中異位表達(dá)其他物種來源的基因，如細(xì)菌等的氮同化和利用的酶來增加額外的氮同化途徑，可達(dá)到提高植物氮素同化和利用能力，促進(jìn)植物生長目的。土壤中含有種類豐富的細(xì)菌類群。細(xì)菌的谷氨酰胺合成酶涵蓋了目前所發(fā)現(xiàn)的三大類谷氨酰胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有種類多和容易克隆的優(yōu)越性。枯草芽孢桿菌是一種常見的土壤細(xì)菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鑒定對于鑒定氮高效基因并應(yīng)用于逆境下農(nóng)作物的生理性狀改善有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供了一種枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因。

本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的克隆方法。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明通過下述方案實(shí)現(xiàn):
一種枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。一種上述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所示的氨
基酸序列。一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組載體。一種克隆上述的不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了兼并引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增得到不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物為:BsF: 5’ -ATGGCAAAGTACACTAGAGA-3’和BsR:5’ -TTAATAYTGAGACATATACT-3’。
上述的PCR擴(kuò)增的條件為:94°C 5分鐘；94°C 50秒，45°C 50秒，72°C I分30秒，25個(gè)循環(huán)；72°C 8分鐘。
本發(fā)明的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了谷氨酰胺合成酶基因GrassBs所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，能恢復(fù)大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時(shí)也預(yù)示了它在其他生物氮高效利用方面的應(yīng)用價(jià)值。


圖1和2為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測圖，表明該編碼蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性很大； 圖3為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白的進(jìn)化分析圖，表明該編碼蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族； 圖4為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, A (argF-lac)169, flhD5301, A (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), A (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補(bǔ)分析圖。培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，轉(zhuǎn)入GrassBs和未轉(zhuǎn)入GrassBs的菌株均可以正常生長； 圖5為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, A (argF-lac)169, flhD5301, A (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), A (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補(bǔ)分析圖。培養(yǎng)基中未添加谷氨酰胺，只有轉(zhuǎn)入Cra1S1Sife的菌株可以正常生長。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一 -.GrassBs基因全長編碼區(qū)的克隆與分析: 通過參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的枯草芽孢桿菌UaciJJy1S subtil is)的谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了 兼并引物，該引物為:BsF: 5 ’ -ATGGCAAAGTACACTAGAGA-3 ’和BsR:5’ -TTAATAYTGAGACATATACT-3’，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增出了一個(gè)谷氨酰胺合成酶基因，命名為Cral5lSfc。將該基因插入克隆載體pMD18-T，挑選相應(yīng)的陽性克隆，對該基因進(jìn)行了全長DNA測序，獲得了含有該基因完整ORF的DNA序列。測序結(jié)果表明-.GrassBs的ORF全長1335bp。DNAstar軟件的分析結(jié)果顯示:該基因編碼一個(gè)含444個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小約為50.3kDa，等電點(diǎn)為4.99。利用Cell-PLoc網(wǎng)站的Gpos-PLoc 2.0以及Softberry網(wǎng)站的ProtComp Version 9.0軟件對GrassBs基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，預(yù)測數(shù)據(jù)顯示該蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性很大，參見圖1和2，這與其它物種中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。進(jìn)化分析表明，基因編碼的蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族，參見圖3。
實(shí)施例二 -.GrassBs在大腸桿菌突變體中的功能分析 通過DNA測序分析，挑選GrassBs基因ORF轉(zhuǎn)錄方向與載體pMD 18-T上乳糖啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄方向一致的克隆,抽提該克隆的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, A (argF-lac)169,flhD5301, A (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，A (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。請參見文獻(xiàn):Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriol，1992，174(2):650-654.。該突變體由于缺失編碼谷氨酰胺合成酶的基因，所以在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中無法正常生長。該菌株購買于E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由圖4和圖5說明GrassBs能夠互補(bǔ)大腸桿菌突變體ET6017的谷氨酰胺合成酶缺失表型。GrassBs的表達(dá)，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下生長。該互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中驗(yàn)證了基因GrassBs所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復(fù)大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時(shí)也預(yù)示了它在其他生物氮高效利用方面的應(yīng)用價(jià)值。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變 動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
3.—種重組表達(dá)載體，該重組載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種宿主細(xì)胞,該宿主細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.一種克隆根據(jù)權(quán)利要求1所述的不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了兼并引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增得到不枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物為=BsF: 5’-ATGGCAAAGTACACTAGAGA-3’和 BsR: 5’ -TTAATAYTGAGACATATACT-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的條件為:94°C5分鐘；940C 50 秒，45°C 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 個(gè)循環(huán)；72°C 8 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發(fā)明的基因來源于枯草芽孢桿菌，為SEQIDNO1所示的堿基序列。該基因編碼谷氨酰胺合成酶，能夠顯著提高模式生物大腸桿菌合成谷氨酰胺的能力。這預(yù)示了所公開的全長基因及氨基酸序列，在提高生物體的氮利用效率和增加生物體氮元素含量的基因工程方面具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/00GK103194462SQ20131012783
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者朱晨光, 沈春磊, 王偉, 葉先敏, 王珊珊, 唐遠(yuǎn)平, 梅冰, 宋任濤 申請人:上海大學(xué)