專利名稱：一株高產(chǎn)菊粉酶真菌的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明所屬微生物種類開發(fā)技術(shù)領域。本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)菊粉酶真菌的制備方法研究，適合工業(yè)化應用。
背景技術(shù)：
菊粉(Inulin)又名菊糖，源自于菊芋塊根，是一種天然果糖聚合物，由D-呋喃果糖分子以β_(2，1)糖苷鍵連接而成的果聚糖。每個菊粉分子末端以α-(1，2)糖苷鍵連接一個葡萄糖殘基，聚合度通常為2-60，平均聚合度為10，其中聚合度較低時(DP = 2-9)則可稱為低聚果糖。作為一種天然可溶性膳食纖維，菊粉幾乎不被胃酸水解和消化，而在結(jié)腸中被大量有益微生物發(fā)酵，因而具備多種保健功能，如控制血脂、降低血糖、改善腸道功能、促進礦物質(zhì)吸收等。菊粉不僅可以作為脂肪替代品應用于低能量食品生產(chǎn)，而且具有膳食纖維以及益生素的生理功能，是一種優(yōu)秀的功能性食品基料。目前，菊粉廣泛應用于醫(yī)藥保健業(yè)、食品工業(yè)等領域。。菊粉酶(Inulinase)是能夠水解β _2，1_D_果糖苷鍵的一類酶，學名為β _2，1-D-果聚糖酶。它主要來源于菊科植物的組織和部分微生物。來源于植物的菊粉酶，其底物專一性較強，僅作用于菊粉；而由微生物產(chǎn)生的菊粉酶大部分都能水解含有β _2，I呋喃果糖苷健的糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，小部分僅能水解菊糖。菊粉酶按其水解果糖苷鍵的方式不同，可分為內(nèi)切和外切兩類。外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)作用于菊粉鏈果糖末端的糖苷鍵，逐一水解釋放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要產(chǎn)物為果糖；內(nèi)切菊粉酶(EC3.2.1.7)僅作用于菊粉，隨機斷開菊粉鏈內(nèi)部的糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖。因此可通過菊粉酶的催化作用，以菊粉為原料，生產(chǎn)高果糖漿、低聚果糖、乙醇、丙酮-丁醇或琥珀酸等產(chǎn)品。這些產(chǎn)品由于具有廣闊的應用前景，促使國外很多學者從20世紀80年代就開始深入開展菊粉酶的研究。毫無疑問，微生物合成是生產(chǎn)大量的工業(yè)用酶的唯一方法，30年來許多學者致力于尋找生產(chǎn)菊粉酶的最好微生物，尤其是日本、韓國和歐洲在這方面積累了豐富資料。我國關于菊粉酶的研究始于20世紀90年代，主要研究集中于菌株篩選和酶學性質(zhì)方面，并且正日益受到人們的重視。但目前能在工業(yè)中應用的產(chǎn)菊粉酶的菌株篩選和發(fā)酵研究進展比較緩慢，因此選育優(yōu)良的產(chǎn)菊粉酶菌株和發(fā)酵條件是菊芋生產(chǎn)乙醇工程的核心環(huán)節(jié)。我們從從自然界中選育得到了一株高產(chǎn)菊粉酶菌株，目前還沒對該菌株進行相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明涉及一株產(chǎn)菊粉酶真菌的制備，其特征在產(chǎn)菊粉酶真菌的制備方法，包括以下過程:步驟(一):在濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌15-20天；步驟(二):取 步驟(一)土壤IOg于內(nèi)置90毫升無菌蒸餾水與適量玻璃珠的250ml錐形瓶中，30°C，180r/min搖床20分鐘；步驟(三):取步驟(二 )稀釋液0.2-0.4毫升涂布于篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4_6天;步驟(四):將步驟(三)分離、初篩后所得的菌株利用平板劃線方法分離純化；步驟(五):重復步驟(四)3-4次，得到純種Al ；步驟(六):挑取步驟(五)中的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，30°C搖振培養(yǎng)4-6d，提取菌株的總DNA作為模板，利用通用引物進行PCR反應，純化；步驟(七):將步驟(六)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。將測得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，獲取與試驗菌18S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進行多序列比對；步驟(八):鑒定后的菌種保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)本發(fā)明所述1，Al菌株的18S rDNA序列長度為1300bp，命名為囊狀青霉Eladia saccula SA1201。


圖1是“透明圈”法圖；圖2是Al菌株18S rDNA分子生物鑒定結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述的涉及一株產(chǎn)菊粉酶真菌的篩選和鑒定，包括以下實施例，下面的實施例可進一步說明本發(fā)明，但 不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1:產(chǎn)高活力菊粉酶真菌的篩選I材料和方法1.1 材料1.1.1分離試樣山東威海濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌15-20d。1.1.2主要試劑及儀器菊粉，化學純，廣州澤鈺生物科技有限公司；3，5- 二硝基水楊酸，化學純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙萊特儀器廠；恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療器械儀器廠；721分光光度計，北京市六一儀器廠。1.2培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基(g/L):菊粉10.0, MgSO4.7Η200.5，NaNO3L 5，ΝΗ4Η2Ρ042.0, KCl 0.5，F(xiàn)eSO4.7Η2040.1，K2HPO4L 0，瓊脂 20.0，初始 ρΗ6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):菊粉20.0、酵母膏 5.0,NaCl 5.(KK2HPO4.3Η203.0，初始ρΗ6.0。斜面培養(yǎng)基:查氏培養(yǎng)基[2]。以上培養(yǎng)基在配置完成后，均需121°C高壓滅菌20min。1.3菊粉酶活力測定3,5- 二硝基水楊酸法(DNS比色法):取0.5ml粗酶液，加人4ml用0.lmol/L,pH5.0的醋酸緩沖液配制的2%的菊粉溶液，50°C水浴中反應20min。沸水浴中5分鐘終止反應。取反應液0.5ml加人1.5mlDNS混勻，沸水浴中反應5min，迅速冷卻并稀釋至20ml，在540nm處，用分光光度計測定其吸光度A，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算生成的還原糖含量[3]。菊粉酶活力單位定義為:在上述條件下,每分鐘生成Iumol還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。1.4產(chǎn)菊粉酶真菌的篩選1.4.1分離、初篩分組取土壤IOg于內(nèi)置90ml無菌蒸餾水與適量玻璃珠的250ml錐形瓶中，30°C，180r/min搖床20min。取上述稀釋液梯度稀釋3次，編號1、2、3組，濃度分別為10—1，10_2，10'分別取三組稀釋液各0.2ml涂布于篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4_6d。產(chǎn)菊粉酶的菌種的篩選，一般采用“透明圈”法。篩選菌種的土壤稀釋樣液在菊粉為唯一碳源的瓊脂平板上，利用菊粉不溶于冷水易溶于熱水的特性，當培養(yǎng)基冷卻后平板不透明，若樣品中有產(chǎn)菊粉酶的微生物時，就可以利用菌落附近的菊粉，這樣在其菌落周圍即可形成“透明圈”。經(jīng)過透明圈法初篩出菊粉酶活力較高的菌株[4]。1.4.2 純化將分離、初篩后所得的菌株利用平板劃線方法分離純化，并重復進行多次分離，肯定為純種菌后作為鑒定實驗用的菌源。1.4.3 復篩

(I)菌懸液制備:挑取一接種環(huán)菌體于50ml無菌生理鹽水，充分均勻備用。(2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為50ml的250ml錐形瓶中加入以上菌懸液1ml，30°C發(fā)酵培養(yǎng)72h。(3)粗酶液制備:取發(fā)酵液于5000r/min離心lOmin，上清液即為粗酶液。進而進行酶活測定，篩選出酶活較高的菌株。1.5菊粉酶性質(zhì)的測定通常用Ι/S的大小來區(qū)分內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I是以菊粉作底物時的酶活，即菊粉酶酶活力；S是以蔗糖作底物時的酶活，即轉(zhuǎn)化酶酶活力。測定篩得酶對2%的菊粉溶液的活性和2%蔗糖溶液的活性，計算出Ι/S值。一般認為當I/S > 10時，酶表現(xiàn)為內(nèi)切活性；I/S < 10時，表現(xiàn)為外切酶活性。2結(jié)果與討論2.1菌株篩選2.1.1初篩與純化通過“透明圈”(如圖1)法篩選產(chǎn)菊粉酶活力較高的菌株，經(jīng)平板劃線純化培養(yǎng)得到產(chǎn)酶活力較高的25株菌。2.1.2 復篩將初篩得到的25株菌經(jīng)進一步進行搖瓶發(fā)酵，得到產(chǎn)酶活力相對較高的菌5株，經(jīng)初步鑒定均為青霉菌。得到產(chǎn)菊粉酶活力見表I。表I產(chǎn)菊粉酶活力
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一株產(chǎn)菊粉酶真菌的制備，其特征在產(chǎn)菊粉酶真菌的制備方法，包括以下過程: 步驟(一):在濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌15-20天； 步驟(二):取步驟(一)土壤IOg于內(nèi)置90毫升無菌蒸餾水與適量玻璃珠的250ml錐形瓶中，30°C，180r/min搖床20分鐘； 步驟(三):取步驟(二 )稀釋液0.2-0.4毫升涂布于篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4-6天； 步驟(四):將步驟(三)分離、初篩后所得的菌株利用平板劃線方法分離純化； 步驟(五):重復步驟(四)3-4次，得到純種Al ； 步驟(六):挑取步驟(五)中的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，30°C搖振培養(yǎng)4-6d，提取菌株的總DNA作為模板，利用通用引物進行PCR反應，純化； 步驟(七):將步驟(六)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。將測得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，獲取與試驗菌18S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進行多序列比對； 步驟(八):鑒定后的菌種保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)本發(fā)明所述1，A1菌株的18SrDNA序列長度為1300bp，命名為囊狀青霉Eladiasaccula SA1201。
全文摘要
本發(fā)明所屬微生物種類開發(fā)技術(shù)領域。本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)菊粉酶真菌的制備方法。在濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌15-20天；取土壤10g于內(nèi)置90毫升無菌蒸餾水與適量玻璃珠的250ml錐形瓶中，30℃，180r/min搖床20分鐘；取稀釋液適量涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4-6天；初篩后所得的菌株經(jīng)多次純化得純種A1；A1進行發(fā)酵培養(yǎng)，提取菌株的總DNA送上海生工生物技術(shù)公司測序；將測得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，獲取與試驗菌18S rDNA基因序列相似度高的菌種，采用ClustalW進行多序列比對；結(jié)合形態(tài)鑒定和18S rDNA序列分析比對，得A1菌株為囊狀青霉Eladia saccula SA1201。該菌株菊粉酶活力較高，為11.8395u/mL，適合于進一步優(yōu)化培養(yǎng)和制備基因工程菌。
文檔編號C12N1/14GK103232941SQ20131012848
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月4日
發(fā)明者朱啟忠, 趙潔 申請人:山東大學(威海)