專利名稱：一種海洋細菌新型酯酶及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種海洋細菌新型酯酶及其制備方法與應用。具體的說，涉及海洋細菌Pelagibacterium halotolerans B2T中酯酶基因pe8及利用該酯酶手型催化3_ (4_氟苯基)戊二酸二甲酯生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。
背景技術：
光學純的(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯是一系列重要醫(yī)藥中間體的前體。其中最具代表性的是左旋帕羅西汀鹽酸鹽。它可以使突觸間隙中的5-羥色胺(5-HT)濃度增高，發(fā)揮抗抑郁作用，對其它遞質(zhì)作用較弱，對植物神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的影響較小，作為選擇性中樞神經(jīng)5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(SSRI)。臨床上被廣泛應用于治療抑郁癥，強迫癥，驚恐障礙或社交焦慮障礙等疾病。近年來，抗抑郁藥物帕羅西汀在國內(nèi)外的市場需求與日俱增，其合成方法也在全球備受關注。因此，探索其簡便，高效經(jīng)濟的制備方法成為科學界十分活躍的課題。合成的方法有化學法和酶法，而酶法由于它的高效、綠色和環(huán)保等優(yōu)點成為研究的首選。Yu 等(TetRahedRon Lett.41 (2000)，5647-5651.)用豬肝臟酯酶選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，得到(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯，雖然ee值與產(chǎn)率高達95%和86%，但是S構型的產(chǎn)物并不是合成左旋帕羅西汀正確構型前體。Lopez-GaRcia 等(TetRahedRon AsymmetRy.14 (2003), 603-609.)在有機溶劑中對3- (4-氟苯基)戊二酸二甲酯進行氨解反應，雖然取得了較高的ee值但產(chǎn)率卻不盡如人意。最近，Liu等(PRocess Biochem.47 (2012)，1037-1041.)利用來自于 CandidaantaRctica的固定化脂肪酶(Novozym435)催化該反應,得到(R) _3_(4_氟苯基)戍二酸單甲酯，雖然產(chǎn)率和ee值都很高，但是由于商品化酶昂貴的價格，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。由于海洋微生物酯酶通常具有與其生存環(huán)境相關的特性，譬如良好的耐鹽性、耐熱性和良好的手性選擇性等，為此我們克隆了海洋細菌PelagibacteRium halotoleRansB2T中酯酶基因pe8并將其在大腸桿菌Rosetta中高度可溶性表達。本發(fā)明利用該酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯進而生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯。通過對其反應條件的優(yōu)化，使其轉(zhuǎn)化率和手性選擇性大大提高。由于該酶能在表達菌株中高度可溶性表達，并且表現(xiàn)出良好的耐鹽、耐堿性及手性選擇性，因此可以作為工業(yè)化生產(chǎn)抗抑郁藥物中間體的潛在用酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海洋細菌新型酯酶、其編碼基因及其制備方法，以及利用該酯酶生產(chǎn)(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。本發(fā)明通過PCR方法，從新型海洋細菌Pelagibacterium halotolerans B21'中意外克隆到一種新型酯酶PE8。海洋細菌Pelagibacterium halotolerans B2T系發(fā)明人之一許學偉等從東海海水樣品中分離得到(相關論文發(fā)表于International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology ;2011 ;61:1817 - 1822),該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心并可提供給公眾使用，保藏編號為CGMCC1.7692τ，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所(100101)，保藏日期為2008年6月。本發(fā)明將目前發(fā)表的所有酯酶按照不同的家族進行氨基酸多序列比對，找到核心保守序列，然后利用相關軟件(例如C0DEH0P)尋找可能的兼并引物。依據(jù)引物的基本原則和要求:簡并度盡可能小、Tm值盡可能高、上下游引物之距離盡可能大、上下游引物的TM值盡可能相近等，選擇適宜的兼并引物。經(jīng)過比對，本發(fā)明設計了一對擴增酯酶全基因的引物。上游引物為pe8F(5’ -AGGACATATGACCGAACCCGTAAAG-3’，Nde I)，下游引物為 pe8R (5，-CGATAAGCTTCTAGAGGATCTCGCG-3’，HindIII) ο 以論文(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology ；2011 ；61:1817 - 1822)中報道的菌株 Pelagibacterium halotolerans B2T(CGMCC1.7692T)為模板進行PCR擴增，意外獲得一種全新的酯酶pe8基因的全長序列，其特征在于全長660bp (核苷酸序列如Seq ID.NO:1所述)。該基因編碼的酯酶PE8含219個氨基酸(氨基酸序列如Seq ID.NO:2所述)，與已公布的來自于菌株Parvibaculumlavamentivorans DS-1 的酯酶(YP_001412908)的同源性低至 46%。酯酶ΡΕ8的系統(tǒng)進化樹分析如附圖
6所示，表明ΡΕ8和其相似的酯酶屬于familyVI脂類水解酶。在不影響酯酶PE8蛋白活性前提下，可對SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有酯酶PE8活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領域技術的公知常識，蛋白質(zhì)的生物學活性是和其功能結(jié)構域密切相關的。一般來說，只有發(fā)生在功能結(jié)構域的位點突變可能對蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構產(chǎn)生影響，從而影響其生物學活性。而對于發(fā)生在遠離功能結(jié)構域的氨基酸位點，由于這一區(qū)域不參與蛋白功能構象，因而氨基酸的個別點突變不會對蛋白質(zhì)的生物學活性產(chǎn)生實質(zhì)性影響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學功能。優(yōu)選的酯酶PE8突變體具有至少與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%以上的同源性，最優(yōu)選具有至少99%以上的同源性。同理，本發(fā)明還保護對SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列進行的替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶PE8蛋白生物學活性的DNA分子。優(yōu)選的酯酶PE8突變體基因具有至少與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90%以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95%以上的同源性，最優(yōu)選具有至少99%以上的同源性。利用基因克隆技術，可將克隆到的酯酶pe8基因連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物宿主表達制備重組酯酶PE8。合適的原核生物宿主包括各種細菌如E.coli等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞)等，優(yōu)選采用原核表達系統(tǒng)E.coli。 合適的載體為本領域技術人員所熟知的各種可商業(yè)化購買的原核或真核表達載體。一個優(yōu)選的例子是將本發(fā)明克隆到的酯酶基因連接到大腸桿菌表達載體pET28b(+)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)誘導表達出高活性的重組酯酶PE8。所述的酯酶基因pe8的表達質(zhì)粒和重組菌株的構建，表達質(zhì)粒為pET28b (+)，轉(zhuǎn)化方法為CaCl2轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化菌株為大腸桿菌DH5 α。所述的利用大腸桿菌Rosetta可溶性表達ΡΕ8，表達菌株為大腸桿菌Rosetta (DE3),以20 μ g/ml卡那霉素和34 μ g/ml氯霉素為選擇壓力。所述的利用大腸桿菌Rosetta可溶性表達PE8，表達條件為37°C振蕩培養(yǎng)至0D_達到0.6時加入終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導表達并轉(zhuǎn)入25°C以振蕩培養(yǎng)過夜培養(yǎng)。對上述得到的酯酶PE8的底物特異性的研究，研究方法為:600 μ I的反應體系中包括ImM各種碳鏈長度的對硝基苯酯，IOOmM Tris鹽酸緩沖液(ρΗ7.5)和2.7 μ g純酶蛋白，反應體系于30°C水浴中反 應3-15min，加等體積的乙醇終止反應，后迅速冷卻，進行吸光值A4tl5的測定并將失活的酶液作為對照用于調(diào)零。研究表明，PE8對短鏈的底物具有很強的催化活性，催化對硝基苯酚乙酸酯(C2)的活性最高，對對硝基苯酚十二酸酯(C12)的活性極其微弱，且不能催化對硝基苯酚十四酸酯(C14)和對硝基苯酚十六酸酯(C16)，因此PE8屬于脂類水解酶中的酯酶，對于短鏈酯類物質(zhì)具有催化活性。此外，還研究了二價陽離子對酯酶活性的影響，研究方法為:反應體系分別加入IOmM Co2+，Cu2+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Sr2+，Mn2+，Ni2+，Ba2+ 和乙二胺四乙酸，然后測定酶的活性；測活體系為:在600 μ I的反應體系中包括IOOmM TRis-鹽酸緩沖液(pH7.5)，ImM對硝基苯酚乙酸酯，2.7μ g酶液，于30°C水浴中反應3min，加等體積的乙醇終止反應，后迅速冷卻，進行吸光值A4tl5的測定并將失活的酶液作為對照用于調(diào)零。測定結(jié)果表明PE8的活性會被Zn2+，Cu2+和Ni2+抑制，但是其他多種二價陽離子的存在下仍能保持較強的活性。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用所述的酯酶PE8生產(chǎn)(R)-3_(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。本發(fā)明所述的利用酯酶PE8生產(chǎn)(R)-3_(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法，包括以下步驟:(I)、利用酯酶PE8選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制備(R)_3_(4_氟苯
基)戊二酸單甲酯，其反應方程式為:
權利要求
1.一種酯酶PE8蛋白，是具有如下(I)或(2)特征的蛋白質(zhì): (1)、其氨基酸序列與SeqID N0.2所示序列一致； (2)、將SeqID N0.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加且具有酯酶PE8酶活性的由(I)衍生的突變體。
2.編碼權利要求1所述的酯酶PE8蛋白的pe8基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示；或為對SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列進行替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶PE8蛋白生物學活性的pe8突變基因。
3.攜帶有權利要求2所述基因的載體。
4.一種宿主，其由權利要求3所述的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核生物或真核生物宿主得到。
5.一種利用權利要求1所述的酯酶PE8生產(chǎn)(R) - 3 - (4 -氟苯基)戊二酸單甲酯的方法，包括以下步驟: (1)、利用酯酶PE8選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制備(R)- 3 - (4 -氟苯基)戊二酸單甲酯，其反應方程式為:
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述的酯酶PE8在反應體系中的濃度范圍為 1- 100mg/ml。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述的反應體系中3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯的濃度為10 - lOOmM。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述的反應體系中所使用的有機溶劑為正己烷，異丙醚，甲苯，甲基叔丁基醚，異丙醇，丙酮，乙腈，甲醇，N, N - 二甲基甲酰胺，1，4 -二氧六環(huán)或二甲基亞砜其中的一種或其混合物。
9.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法步驟(2)中的分離純化方法包括萃取、減壓干燥或其組合以分離出目標產(chǎn)物。
10.一種利用權利要求1所述的酯酶PE8生產(chǎn)(R) - 3 - (4 -氟苯基)戊二酸單甲酯的方法，包括以下步驟: (1)、利用酯酶PE8選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，反應體系中含有10 - 100mM3 - (4 -氟苯基)戊二酸二甲酯，1- 100mg/mlPE8粗酶粉，O - 30%(v/v)的有機溶劑；控制溫度在20 - 40°C，反應時間為10 - 36h ； (2)、終止反應后，經(jīng)萃取，減壓干燥分離出目標產(chǎn)物(R)- 3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋細菌新型酯酶以及利用該酯酶手性催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的方法。將該酯酶基因克隆到表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。由于該酶能在表達菌株中高度可溶性表達，并且表現(xiàn)出良好的耐鹽，耐堿，及手性選擇性，因此可以作為工業(yè)化生產(chǎn)抗抑郁藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯的潛在用酶。通過對其反應條件的優(yōu)化，可以利用該酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯進而生產(chǎn)藥物中間體(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸單甲酯，使其轉(zhuǎn)化率和手性選擇性大大提高。
文檔編號C12N1/19GK103215238SQ20131012932
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權日2013年4月12日
發(fā)明者吳月紅, 江夏薇, 許學偉, 魏笑蓮, 王春生, 吳敏 申請人:國家海洋局第二海洋研究所