專利名稱：微球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。特別是一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術：
氮元素是生物體需求量最大的礦物質元素，用于合成生物體所需的氨基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮的利用在農作物生產中占非常重要的地位，植物氮代謝及其調控一直備受全世界關注。然而，目前氮肥利用率低且過量施用造成水環(huán)境污染的問題已成為世界性難題。因此，如今需要降低氮肥的使用量，并尋找氮利用率更高的植物品系， 以保證在產量不下降的前提下，減少氮肥的使用量。
生物體對氮素的同化是十分重要的生理過程，無機氮必須同化為谷氨酰胺形式的有機氮才能被生物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是氮同化路徑的關鍵酶，它和谷氨酸合成酶聯(lián)合作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，將其酰胺轉移到α-酮戊二酸上，從而生成兩分子的谷氨酸。谷氨酰胺在生物體內含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界的無機氮元素也通過這個途徑進入生物體內的整個氮素循環(huán)。因此GS在生物體氮同化過程中起到了十分重要的作用。
通過異源基因的導入和重組，有可能獲得高水平表達GS的轉基因植株。轉基因植株對氮的利用率將大大提高，在氮貧瘩的土壤中能正?；虺ＩL，這無論在理論和農業(yè)生產上均具有重要意義。細菌的谷氨酰胺合成酶涵蓋了目前所發(fā)現(xiàn)的三大類谷氨酰胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有種類多和容易克隆的優(yōu)越性。微球菌sp.)是一類常見的土壤細菌,其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鑒定對于構建轉基因植株并應用于改善逆境下農作物的生理性狀有重要的意義。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供了一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因。
本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。
本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。
為達到以上目的，本發(fā)明通過下述方案實現(xiàn):一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的堿基序列。
一種上述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
一種重組表達載體，該重組載體含有上述的基因。
一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述的重組載體。
一種克隆上述的微球菌 谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的微球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設計了引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增得到谷氨酰胺合成酶基因；所述的引物為=MicoclF: 5’ -ATGTTCACCTCCCCCGCGGA-3’ 和 MicoclR: 5’ -TCAGACCGAGTAGTAGAGCT - 3’。
上述的PCR擴增的條件為:94°C 5分鐘；94°C 50秒，55°C 50秒，72°C I分30秒， 25個循環(huán)；72°C 8分鐘。
本發(fā)明的互補實驗驗證了谷氨酰胺合成酶基因所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，能恢復大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。


圖1和2為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白亞細胞定位預測圖，表明該編碼蛋白定位在細胞質的可能性很大；圖3為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白的進化分析圖，表明該編碼蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族；圖4為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl 50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，轉入IicoJ和未轉的菌株均可以正常生長；圖5為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl 50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養(yǎng)基中未添加谷氨酰胺，只有轉入的菌株可以正常生長。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例一 'Mico3基因全長編碼區(qū)的克隆與分析:通過參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的微球菌spp.)屬細菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設計了引物，該引物為:MicoclF: 5’ -ATGTTCACCTCCCCCGCGGA-3’ 和 MicoclR: 5’-TCAGACCGAGTAGTAGAGCT - 3’，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個谷氨酰胺合成酶基因，命名為Mico3。將該基因插入克隆載體pMD18-T，挑選相應的陽性克隆，對該基因進行了全長DNA測序，獲得了含有該基因完整ORF的DNA序列。測序結果表明.Mico3的 ORF全長1425bp。DNAstar軟件的分析結果顯示:該基因編碼一個含474個氨基酸的蛋白， 蛋白分子量大小約為52.6kDa，等電點為4.6。利用Cell-PLoc網站的Gpos-PLoc 2.0以及 Softberry網站的ProtComp Version 9.0軟件基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測，預測數(shù)據(jù)顯示該蛋白定位在細胞質的可能性很大，參見圖1和2 ，這與其它物種中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。進化分析表明，基因編碼的蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族，參見圖3。
實施例二 'MiCo3在大腸桿菌突變體中的功能分析通過DNA測序分析，挑選Mico3基因ORF轉錄方向與載體pMD18-T上乳糖啟動子轉錄方向一致的克隆,抽提該克隆的質粒,并轉入大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169,flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL 150 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。請參見文獻:Merida, A., Flores E., Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetase activity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing the Anabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriolj 1992，174(2): 650-654.。該突變體由于缺失編碼谷氨酰胺合成酶的基因，所以在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中無法正常生長。該菌株購買于E.coli Genetic Stock Center, Yale University。 由圖4和圖5說明Mico3能夠互補大腸桿菌突變體ET6017的谷氨酰胺合成酶缺失表型。 Mico3的表達，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下生長。該互補實驗在大腸桿菌中驗證了基因#^0( 所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作 各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內的變動。
權利要求
1.一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的堿基序列。
2.一種根據(jù)權利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
3.—種重組表達載體，該重組載體含有根據(jù)權利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞,該宿主細胞含有根據(jù)權利要求3所述的重組載體。
5.一種克隆根據(jù)權利要求1所述的微球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的微球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設計了引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增得到谷氨酰胺合成酶基因；所述的引物為: MicoclF: 5’ -ATGTTCACCTCCCCCGCGGA-3’ 和 MicoclR: 5’ -TCAGACCGAGTAGTAGAGCT-3’。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR擴增的條件為:94°C5分鐘； 94°C 50 秒，55 V 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 個循環(huán)；72°C 8 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發(fā)明的基因來源于微球菌屬細菌，為SEQ ID NO.1所示的堿基序列。該基因編碼谷氨酰胺合成酶，能夠顯著提高模式生物大腸桿菌合成谷氨酰胺的能力。這預示了所公開的全長基因及氨基酸序列，在提高生物體的氮利用效率和增加生物體氮元素含量的基因工程方面具有應用價值。
文檔編號C12N15/10GK103205442SQ20131013052
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權日2013年4月16日
發(fā)明者朱晨光, 王佩佩, 王偉, 吳悄, 沈春磊, 唐遠平, 梅冰, 宋任濤 申請人:上海大學