專利名稱：鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a熒光標(biāo)記單抗的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，主要涉及鼠免疫球蛋白，尤其涉及活化T細胞檢測試劑的開發(fā)，即用異硫氰酸熒光素(FITC)直接標(biāo)記鼠抗人活化T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體(單抗)制備熒光抗體(2B8a-FITC)，在制備人活化T細胞檢測試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
T細胞的活化狀態(tài)對免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定至關(guān)重要，正向和負向調(diào)控失衡都將引起疾病的發(fā)生。如T細胞在再次免疫應(yīng)答過程中反應(yīng)過強可以出現(xiàn)超敏反應(yīng)引起組織損傷；體內(nèi)存在針對自身抗原的自身反應(yīng)性T細胞可以導(dǎo)致多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病；抑制性T細胞的功能過亢、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對腫瘤抗原不能識別或T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；T細胞對同種異型抗原的識別是發(fā)生移植物抗宿主病(GVHD)的基礎(chǔ)[1]。在腫瘤免疫治療過程中，T細胞的活化狀態(tài)與疾病的治療效果密切相關(guān)。在兒童血液系統(tǒng)疾病中，再生障礙性貧血(ΑΑ)、噬血細胞綜合征(HLH)等疾病的發(fā)生均與T細胞的過度活化、功能過亢有關(guān)。在ΑΑ，其主要的發(fā)病機制是Thl細胞和CD8+T細胞過度增殖活化分泌細胞因子損傷造血干/祖細胞和間充質(zhì)干細胞(MSC)，同時MSC、調(diào)節(jié)性T細胞、NK細胞、NKT細胞及早期造血生長因子水平的下降是機體免疫調(diào)節(jié)和支持造血的能力下降所致[2]。因此，抑制和/或殺傷活化T細胞的免疫抑制療法是治療AA的策略。而HLH則是由于自身的免疫缺陷病原體難以清除，導(dǎo)致T細胞過度活化和細胞因子風(fēng)暴而損傷臟器，該病進展迅速、死亡率非常高，基本的治療手段也是通過激素、環(huán)孢素及依托泊苷等藥物抑制或殺滅活化T細胞而使疾病緩解[3]。因此，活化T細胞的檢測對于疾病的診斷、鑒別診斷及療效評估均有重要意義，同時也是醫(yī)學(xué)科學(xué)研究過程中常用的手段。T細胞活化分子的表達是T細胞活化的重要標(biāo)志。T細胞活化分子是在靜息T細胞表面弱表達或不表達，而在T細胞受絲裂原或抗原刺激后表達于該細胞表面的分子，包括細胞因子、細胞因子受體、粘附分子、協(xié)同刺激分子、MHC分子和細胞毒物質(zhì)等[1]。由于各分子功能的差異，其在細胞表面的表達時間也有明顯差異。如臨床上常有的檢測指標(biāo)CD69是一個早期活化的標(biāo)志，在T細胞活化后12 24h內(nèi)達到高峰，24h后開始逐漸下降，且其表達并不強；而HLA-DR則是個晚期活化的標(biāo)志，一般在T細胞活化后72h開始出現(xiàn)[4]。因此，一個早期穩(wěn)定的T細胞活化分子對于及時了解T細胞狀態(tài)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鼠抗人T細胞抗原ZCH_2B8a熒光標(biāo)記單抗在制備人活化T細胞檢測試劑中的應(yīng)用。 所述抗體是一種用異硫氰酸熒光素(FITC)直接標(biāo)記的鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體的熒光抗體(2B8a_FITC)，所述的鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。本發(fā)明提供的鼠抗人活化T細胞抗原ZCH_2B8a單克隆抗體是以分化早期的CD34+白血病細胞系KGla作為免疫原，采用經(jīng)典鼠-鼠雜交瘤技術(shù)制備而成。該抗體經(jīng)遞交國際人類白細胞分化抗原協(xié)作組會議(8th International Workshop and Conference on HumanLeukocyte Differentiation Antigens, HLDA-8)鑒定后認為該抗體識別的抗原性質(zhì)不明，屬國際上尚未認識的造血細胞膜新的分化抗原或新的CD分子。該單克隆抗體重、輕鏈分別具有SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。研究表明，2B8a抗原在T細胞活化早期(12小時內(nèi))即出現(xiàn)表達，并逐漸增強，在72h 96h達高峰，是一個早期穩(wěn)定的活化標(biāo)志。當(dāng)純化2B8a單抗直接用于流式檢測時是采用間接免疫熒光標(biāo)記法，即需要熒光素標(biāo)記的羊抗鼠Fe段抗體作為二抗與其結(jié)合才能被流式細胞儀檢測到，操作步驟比較繁瑣，非特異性結(jié)合較高。因此，本實驗室采用改良Marshall法，用FITC標(biāo)記純化的2B8a單抗，制備FITC直接標(biāo)記的2B8a熒光抗體2B8a_FITC[5]。2B8a_FITC使流式檢測步驟簡化并且大大減少了非特異性結(jié)合，并可以與其他不同熒光素偶合的抗體聯(lián)合進行多色熒光分析，使不同活化T細胞亞群的分析檢測結(jié)果更為準確、可靠。本發(fā)明所述的用FITC直接標(biāo)記的熒光單抗(2B8a_FITC)的制備方法為:將純化的2B8a單抗，通過改良Marshall法，用FITC進行標(biāo)記，多余FITC經(jīng)PBS充分透析除去。通過檢測植物血凝素(PHA)活化的T細胞及再生障礙性貧血(AA)及噬血性淋巴組織細胞增生癥(HLH)等免疫學(xué)紊亂性疾病患者的外周血T細胞表明，2B8a-FITC與活化T細胞具有良好的識別活性，對T細胞免疫功能的基礎(chǔ)研究以及免疫性紊亂性疾病的臨床診斷具有重要的應(yīng)用價值。目前臨床上用于檢測T細胞活化狀態(tài)的常用指標(biāo)是⑶69、⑶25和HLA-DR。⑶69雖然在T細胞活化早期即可出現(xiàn)，但表達時間短，臨床檢測陽性率低，敏感性差。CD25和HLA-DR雖然持續(xù)時間長，但表達較晚，在T細胞活化早期呈陰性。而2B8a的表達規(guī)律不同于上述3個抗原(圖7)，它表達早且持續(xù)穩(wěn)定，表達強度高，在用于T細胞活化狀態(tài)的檢測上具有更大的優(yōu)勢。因此，我們認為，2B8a-FITC熒光抗體用于活化T細胞的檢測較⑶69、⑶25和HLA-DR具有更高的準確性。ZCH-2B8a (簡稱2B8a)是鼠抗人造血細胞分化抗原的單克隆雜交瘤細胞系，以分化早期的CD34+白血病細胞KGla作為免疫原，采用經(jīng)典鼠鼠雜交瘤技術(shù)制備而成。經(jīng)三次亞克隆培養(yǎng)，建立了能穩(wěn)定分泌2B8a抗體的雜交瘤細胞系。該抗體經(jīng)遞交第8屆國際人類白細胞分化抗原協(xié)作組會議(8th International Workshop and Conference on HumanLeukocyte Differentiation Antigen, HLDA-8)鑒定后認為該抗體識別的抗原性質(zhì)不明，屬國際上尚未認識的造血細胞膜新的分化抗原或新的CD分子。研究表明，該抗體與正常外周血靜止期T細胞不反應(yīng)，但與活化的T細胞反應(yīng)較強，可能識別新的活化分子，可應(yīng)用于人活化T細胞活化狀態(tài)的檢測，可制備成檢測試劑。


圖1是鼠抗人活化T細胞新抗原ZCH_2B8a單克隆抗體的可變區(qū)重鏈基因(VH2B8a)序列(兩個黑色箭頭之間的序列)。序列位置:76_435，共360bp。圖2是鼠抗人活化T細胞新抗原ZCH_2B8a單克隆抗體的可變區(qū)輕鏈基因(VL2B8a)序列(兩個黑色箭頭之間的序列)。序列位置:622_960，共339 bp。圖3是SPA Sepharose親和層析法純化2B8a抗體腹水色譜圖。圖4是SDS-PAGE鑒定2B8a抗體蛋白亞基的電泳圖。左側(cè)泳道為蛋白分子量標(biāo)準，右側(cè)泳道為經(jīng)DTT還原后的2B8a抗體的重鏈和輕鏈，分子量分別約為52 kDa和29 kDa。圖5是流式細胞術(shù)評價2B8a_FITC直標(biāo)抗體。圖6是2B8a_FITC直標(biāo)抗體活性滴定分析。圖7是2B8a抗原在PHA刺激的活化T細胞上的表達隨時間變化。圖8是⑶69在PHA刺激的活化T細胞上的表達隨時間變化。圖9是⑶25在PHA刺激的活化T細胞上的表達隨時間變化。圖10是HLA-DR在PHA刺激的活化T細胞上的表達隨時間變化。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。實施例 一 2B8a單克隆抗體重、輕鏈基因的克隆 本發(fā)明2個基因的核苷酸序列及氨基酸序列如下:
(l)2B8a單抗重鏈可變區(qū)基因(VH2B8a)具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列，編碼SEQ IDN0.3的氨基酸序列。(2)2B8a單抗輕鏈可變區(qū)基因(VL2B8a)具有SEQ ID N0.2的核苷酸序列，編碼SEQID N0.4所示的氨基酸序列。2B8a重鏈和輕鏈基因的核苷酸序列及氨基酸序列的獲取步驟如下:
1、ZCH-6-2B8a單抗的研制:基本按Koller&Milstein報告的鼠-鼠雜交瘤經(jīng)典方法進行[6]，以急性粒細胞白血病(未分化型)細胞系KGla細胞作為免疫原，將IO7白血病細胞給8周齡雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脫臼殺死小鼠，無菌取脾細胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞系NS-1細胞(美國ATCC產(chǎn)品)按6:1混合，以50%聚乙二醇(PEG，美國Sigma公司，分子量3350道爾頓)溶液作為融合媒介進行細胞融合，于96孔板(美國Falcon公司)中進行選擇性培養(yǎng)。于融合后第9 20天，隔日用免疫原細胞對培養(yǎng)上清進行間接免疫熒光法(I I F)篩選。陽性孔細胞經(jīng)3次克隆化并連續(xù)2次100%孔達到陽性，即建立了能持續(xù)分泌2B8a單抗的雜交瘤細胞系。經(jīng)8個多月的連續(xù)傳代培養(yǎng)和反復(fù)凍融，其分泌2B8a單抗的能力穩(wěn)定。以其腹水(熒光法效價1:3200)或培養(yǎng)上清(熒光法效價1:16)作為2B8a單抗的來源進行下一步的實驗。2、2B8a重、輕鏈基因(VH2B8a、VL2B8a)的擴增和克隆
2.1總RNA的抽提和處理:
收集2B8a雜交瘤細胞8 X 106，以核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(TRIZOL液)按說明書步驟抽提總RNA。最后溶于25 μ I DEPC (diethyl-pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)水中，并加Λ RNasine (核糖核苷酸酶抑制劑)至終濃度為I U/ml (單位/微升)。紫外分光光度計測定A260、A280及其比值，I %瓊脂糖電泳觀察總RNA。進行逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)前，取2 μ I 2B8a總RNA，按照RQl (無RNA酶的DNA酶試劑盒)說明的方法，消化總RNA中可能污染的基因組DNA。2.2 總 RNA 的抽提:
(1)計數(shù)細胞，共8X IO6個活細胞；
(2)常溫下1000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心15分鐘,棄上清；
(3)沉淀中加入無菌生理鹽水后在IOOOrpm條件下離心15分鐘，重復(fù)洗滌2次；
(4)向沉淀中加入8mlTRIZOL (lml/106細胞)，立即用5ml無菌針筒反復(fù)抽打剪切數(shù)分鐘；
(5)將上述TRIZOL溶液按Iml/管轉(zhuǎn)入1.5ml帶蓋小塑料(印pendorf)管中，室溫下靜置5分鐘；
(6)每管加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫下靜置10分鐘；
(7)4° C下12000g離心15分鐘,將水相轉(zhuǎn)入新的L 5ml的eppendorf管中，每管加入0.5ml異丙醇，立即搖勻，室溫下靜置10分鐘；
(8)4。C下，12000g 離心 10 分鐘;
(9)棄上清，每管加入1.5ml75%乙醇，混勻，4° C下，7500g離心5分鐘，棄上清；
(10)真空干燥機中晾干，每管加入25μ I無RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80° C冰箱保存。2.3總RNA濃度的測定:
取出2μ I新抽提的總RNAJpA 98μ I DEPC水混勻，紫外分光光度計(GeneQuant II)測定260吸光值(Α260)及280吸光值(Α280)，RNA實際濃度用如下公式計算:
MN 濃Jg (μ g/ μ I) = Α260/24 χ 釋_倍聽 2.4總RNA凝膠電泳:
取新抽提的總RNA 3μ I加入電泳上樣緩沖液5μ 1，1%瓊脂糖凝膠內(nèi)含溴乙啶(EB)濃度0.5mg/ml，經(jīng)100V直流電壓下電泳5分鐘，凝膠成像系統(tǒng)觀測結(jié)果并攝像保存。2.5 總 RNA 的處理:取總 RNA I ml + 無 RNA 酶的 DNA 酶(RNase-free Dnase)(I U/ml) IOml + RNasin (40 U/ml )1 ml，總量達 12ml，經(jīng) 37° CXl 小時，90。C X 5 分鐘孵浴后立即置冰上待用。2.6 RT-PCR:
按照說明書，將RQl無RNA酶的DNA酶處理過的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄(25ml體系)，并用DNA純化試劑盒(QIAquick)純化mRNA/cDNA雜交雙鏈。取純化的cDNA 2.5ml進行PCR。2.6.1 RT反應(yīng)體系:取RQl處理過的總RNA 13ml +寡聚脫氧胸苷[Oligo(dT)]1.5 ml，總量達14.5mL，經(jīng)65° C預(yù)變性5分鐘，立即置冰上，加入以下試劑:DEPC水2.5ml + 5倍緩沖液5 ml + 25mM dNTP (脫氧核苷混合物)0.5 ml + RNA酶抑制劑1.5ml+逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/mL) I ml至總體積25 ml，經(jīng)37° C，30分鐘孵浴以合成互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)，置95° C 5分鐘，然后移至4° C冰浴備用。
2.6.2 PCR 體系
(I)50 ml的PCR反應(yīng)體系:2.5ml純化的2B8a IOpmol的輕鏈或重鏈可變區(qū)上下游引物各lml，0.5ml 25mM的dNTP，5ml 10 X高保真PCR緩沖液，0.2ml高保真Taq聚合酶(Platinum Taq High Fidelity);引物序列如下:
重鏈可變區(qū) 5’ 引物序列(SEQ ID N0.5): GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT重鏈可變區(qū) 3’ 引物序列(SEQ ID N0.6): CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTGGGT GTC GTT TT
輕鏈可變區(qū) 5’ 引物序列(SEQ ID N0.7): GAC ATT CTG ATG ACC CAG TCT 輕鏈可變區(qū) 3’ 引物序列(SEQ ID N0.8): GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
(2)反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性2分鐘，94° C變性30秒，57° C退火30秒，72° C延伸30秒，共38個循環(huán)；
(3)最后一個循環(huán)完成后，加入ImlTaq DNA Polymerase (Taq DNA聚合酶)72。C延伸7分鐘；
(4)取5mlPCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，同時加標(biāo)準分子量標(biāo)志物，鑒定PCR產(chǎn)物片斷大小，分別命名為VH2B8a和VL2B8a基因。結(jié)果可觀察到360堿基對(bp)左右的VH2B8a條帶和340bp左右的VL2B8a條帶。將前述陽性條帶切膠回收純化得到VH2b8JP VL2B8a基因。3.VH2B8a, VL2b83基因擴增產(chǎn)物的克隆和鑒定將純化的VH2B8a和VL2B8a基因片段通過連接酶分別與克隆載體pGEM -T Easy連接，獲得的連接產(chǎn)物pGEM -T Easy/VH和pGEM -T Easy/VL,通過轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，得到數(shù)十個白色菌落和數(shù)個藍色菌落，分別挑取3個白色菌落進行質(zhì)粒擴增，抽提后進行核酸限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳結(jié)果均可見360bp左右的目的片段。
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4.VH2B8a、VL2B8a基因序列測定和分析
對陽性重組質(zhì)粒純化后進行測序，VH2B8a(圖1)和VL2B8a (圖2)基因均符合小鼠Ig可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)。VH2B8a基因全長360bp (見序列SEQ ID NO 1)，編碼120個氨基酸(見序列 SEQ ID NO 3),在 IMGT (the international ImMunoGeneTics information system http://www.1mgt.0rg)上進行檢索比對,發(fā)現(xiàn)此重鏈可變區(qū)基因與小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因IGHV1-67*01 F的同源性達94.10%，提示該基因歸屬于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，重鏈可變區(qū)含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補區(qū)(CDR)，在第22位和第96位為特征性Cys (半胱氨酸)。VH2B8a氨基酸序列結(jié)構(gòu)框架如下:Γ25 FR1、26 33 CDR1、34 50 FR2、51 58 CDR2、59 96 FR3、97 108 CDR3、109 120 FR4。VL2B8a基因全長339bp(見序列SEQ ID NO 2)，編碼113個氨基酸(見序列SEQ IDNO 4)，在NCBI上進行檢索，發(fā)現(xiàn)此輕鏈可變區(qū)基因與小鼠IgK鏈基因IGKV7-3*01 P的同源性81.44%，提示該基因歸屬于小鼠Ig的Vk基因。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，輕鏈可變區(qū)含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補區(qū)(CDR)，在第23位和第94位為特征性半胱氨酸(Cys)。VL2B8a氨基酸序列框架如下:1 26 FR1、27 36 CDR1、37 53 FR2、54 56 CDR2、57 92 FR3、93 101 CDR3、102 113 FR4。實施例二 2B8a直標(biāo)抗體2B8a_FITC的制備
在清潔級BALB/c小鼠腹腔注射2B8a細胞，制備大量腹水。硫酸銨初步純化后采用Econo-Pac蛋白A柱進行親和層析(圖3)，SDS-PAGE檢測純化蛋白的純度(圖4)。將獲得的純化2B8a單抗，通過改良Marshall法[5]，用FITC進行標(biāo)記，多余FITC經(jīng)PBS充分透析除去，具體步驟如下:1.抗體的準備:取適量的2B8a Ab溶液置于三角燒杯中，加入生理鹽水或碳酸鹽緩沖液，使蛋白終濃度為20 mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5 lOmin。2.異硫氰酸熒光素的準備:根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按蛋白與熒光素100:1的質(zhì)量比稱取異硫氰酸熒光素粉末。3.結(jié)合:邊攪拌邊將稱取的異硫氰酸熒光素漸漸加入2B8a Ab溶液中，加畢后，在4°C冰箱內(nèi)繼續(xù)攪拌12 18h。
4.透析:結(jié)合完畢后，將溶液離心于2500rpm離心20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用PH 8.0緩沖鹽水透析(O 4°C)過夜。5.過柱:取透析過夜的標(biāo)記物，過S^hadex G_50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進行鑒定。6.F/P比值的測定:用酶標(biāo)儀測定該標(biāo)記物的A495和A280的吸光值。根據(jù)以下公式 F/P= (2.87XA495) / (A280-0.35 X A495)計算 F/P 值，合適的 F/P 值為 2 4。7.保存:將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%，分裝。于4°C可以保存半年，_20°C保存可達2年以上。本實驗采用改良Marshal I法制備了 2B8a FITC直標(biāo)抗體，該抗體經(jīng)酶標(biāo)儀檢測其A495和A280的吸光值分別為0.532和0.475，經(jīng)計算F/P值為2.64，介于2 4之間，符合熒光抗體的特異性染色質(zhì)量的要求。本實驗采用流式 細胞術(shù)(FCM)法，通過對比2B8a_FITC和2B8a + GAM-FITC與Raji細胞及Molt-3細胞的反應(yīng)性，來鑒定2B8a-FITC直標(biāo)抗體用于實驗檢測的敏感性和特異性。結(jié)果顯示(圖5)。圖5中a-c為Raji細胞(表達2B8a抗原)，d-f為Molt-3 (不表達2B8a抗原)細胞，從左至右依次為陰性對照，2B8a + GAM (羊抗鼠免疫球蛋白)-FITC，2B8a-FITC。2B8a_FITC和2B8a + GAM-FITC與Raji細胞均呈明顯的陽性反應(yīng)，峰型相似，陽性率(98.48% vs.98.35%)和平均熒光強度(53.61 vs.54.01)接近。而在Mlot_3細胞上，2B8a-FITC 和 2B8a + GAM-FITC 基本呈陰性反應(yīng)(9.35% vs.10.80%),且 2B8a_FITC 的非特異性結(jié)合弱于2B8a + GAM-FITC0表明該直標(biāo)抗體具有良好的敏感性和特異性。實施例三2B8a_FITC活性鑒定:
1.收獲Raji細胞，離心后調(diào)節(jié)細胞濃度至IXlO6Ail ;每只流式管取細胞懸液50 μ I。2.陰性對照管加入鼠IgGl 5μ I ;其余每只流式管分別加入2B8a_FITC Oyg,
0.0l μ g,0.025 μ g, 0.05 μ g, 0.1 μ g, 0.25 μ g 和 0.5 μ g, 4°C 孵育 30 min。3孵育結(jié)束后以PBS洗滌、離心(IOOOrpmX 5min)兩次，流式細胞儀檢測。本實驗取Raji細胞株為反應(yīng)細胞，固定細胞量，逐漸增加2B8a_FITC量，流式細胞儀檢測不同2B8a-FITC濃度時陽性率變化，結(jié)果表明陽性率隨2B8a_FITC增多而增加，但是
0.1 μ g的2B8a-FITC即可飽和5 X IO4個Raji細胞，繼續(xù)增加2B8a_FITC陽性率增加不明顯(圖6)。圖6中，所滴定的細胞量為5X IO4個Raji細胞。結(jié)果表明在一定的抗體范圍內(nèi)，陽性率隨2B8a-FITC量的增加而增加，但是0.1 μ g的2B8a_FITC即可飽和5X IO4個Raji細胞，繼續(xù)增加2B8a-FITC陽性率增加不明顯。表明該直標(biāo)抗體識別能力強，活性佳。實施例四2B8a單抗與PHA活化的外周血T淋巴細胞的反應(yīng)性I外周血單個核細胞(PBMNC)的分離:
1.1取靜脈抗凝血3 ml，用pH 7.4的PBS溶液將抗凝血作1:1稀釋。1.2取分層液3ml置入15ml滅菌離心管內(nèi)。1.3用毛細吸管吸取稀釋血液，在離分層液上Icm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液上。稀釋血液與分層液的體積比例為2:1。1.4用水平離心機離心(2000rpm，20min)。絕大部分單個核細胞懸浮于血漿與分層液的界面上，呈白膜狀。用毛細吸管輕插至白膜層，沿試管壁周緣吸出界面層細胞，移入
另一試管中。1.5用5倍以上體積的PBS液離心洗漆2次(1500rpm, 5min)。1.6將細胞重懸于淋巴細胞培養(yǎng)基中。2淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗:· 2.1用RPMI1640培養(yǎng)基將分離的PBMNC濃度調(diào)整至5X 105/ml，按Iml/孔將細胞懸液接種于24孔板中。2.2對照孔加無菌PBS 10 μ I，實驗孔加除菌的lmg/ml PHA溶液10μ I,混勻。2.3置37°C培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)Oh、12h、24h、48h、72h和96h取細胞
進行流式檢測。3 2B8a抗原及其他活化標(biāo)志的檢測:
3.1收獲細胞，分別置于離心管中，IOOOrpm離心5min后去上清，加入200μ I PBS懸浮細胞。3.2每個樣本設(shè)3只流式反應(yīng)管，3管分別加入以下抗體進行4°C孵育15min(FITC、PE、PerCP標(biāo)記的熒光抗體加5 μ I/管，APC標(biāo)記的熒光抗體2.5 μΙ/管)。第I管(陰性對照管):鼠抗人IgGl-FITC、鼠抗人IgGl-PE、鼠抗人IgGl-PerCP、鼠抗人IgGl-APC ；第 2 管(測試管):2B8a-FITC、CD69-PE、CD8-PerCP 和 CD3-APC;第 3 管(測試管):CD3_FITC、CD25-PE、HLA-DR-PerCP 和 CD4-APC。3.3孵育結(jié)束后，每管加入Iml溶血劑，振蕩混勻后室溫孵育lOmin。然后加PBS，IOOOrpm離心5min洗漆2次。3.4上機，在流式細胞儀上進行檢測。結(jié)果表明，2B8a抗原在活化早期(12小時內(nèi))即出現(xiàn)表達，并逐漸增強，在72h 96h達高峰[96h后陽性率和平均熒光強度指數(shù)(MFI)開始緩慢下降，數(shù)據(jù)未顯示]，是一個早期穩(wěn)定的活化標(biāo)志。⑶69在PHA刺激后即刻出現(xiàn)活化，12 24h內(nèi)達到高峰，24h后開始逐漸下降，是一個早期活化的標(biāo)志，且其表達并不強，峰值陽性率在69%左右。⑶25在T細胞活化后24 48h開始表達，以較快的速度上升，是一個中期活化的標(biāo)志。而HLA-DR則在PHA孵育后72h開始表達，是個晚期活化的標(biāo)志。可見，2B8a抗原在活化T細胞上的表達規(guī)律完全不同于⑶69、⑶25和HLA-DR (圖7-圖10)。圖7-圖10中，共檢測6例標(biāo)本，橫坐標(biāo)為PHA孵育時間，縱坐標(biāo)為陽性率。2B8a抗原(Ag)在活化早期(12小時內(nèi))即出現(xiàn)表達，并逐漸增強，在72h 96h達高峰，是一個早期穩(wěn)定的活化標(biāo)志。2B8a Ag在活化T細胞上的表達規(guī)律完全不同于⑶69、⑶25和HLA-DR。
權(quán)利要求
1.一種用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體在制備人活化T細胞檢測試劑中的應(yīng)用，所述的鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，輕鏈可變區(qū)基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0 .4所示。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a熒光標(biāo)記單抗在制備人活化T細胞檢測試劑中的應(yīng)用。所述抗體是一種用異硫氰酸熒光素直接標(biāo)記的鼠抗人T細胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體的熒光抗體(2B8a-FITC)。以該抗體為基礎(chǔ)制備的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的熒光抗體對于抗原的結(jié)合具有高度的敏感性和特異性，同時活性良好，能識別經(jīng)植物血凝素刺激的活化T細胞和再生障礙性貧血等免疫相關(guān)性疾病病人外周血中的活化T細胞?？蓱?yīng)用于人活化T細胞活化狀態(tài)的檢測，可制備成檢測試劑。
文檔編號C12N15/13GK103193886SQ20131013052
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月14日
發(fā)明者湯永民, 徐曉軍 申請人:浙江大學(xué)