專利名稱：鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH-2B8a單抗可變區(qū)基因及用途的制作方法
鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH-2B8a單抗可變區(qū)基因及用途技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬生物技術(shù)，主要涉及鼠抗人活化T細(xì)胞新抗原ZCH-2B8a (簡稱2B8a)單克隆抗體(單抗)可變區(qū)基因的克隆、測序及其在再生障礙性貧血等免疫相關(guān)疾病診治中的用途。
背景技術(shù)：
機體免疫系統(tǒng)有免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)的功能，T細(xì)胞在上述過程中起著舉足輕重的作用。T細(xì)胞根據(jù)其分化狀態(tài)和功能可分為初始、效應(yīng)和記憶T細(xì)胞。初始T細(xì)胞必須先經(jīng)過活化轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)T細(xì)胞才能在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。T細(xì)胞活化的正向和負(fù)向調(diào)控的平衡對免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定至關(guān)重要，任何一方的絕對優(yōu)勢都將引起疾病的發(fā)生。如T細(xì)胞在再次免疫應(yīng)該過程中反應(yīng)過強可以出現(xiàn)超敏反應(yīng)引起組織損傷；體內(nèi)存在針對自身抗原的自身反應(yīng)性T細(xì)胞可以導(dǎo)致多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾?。灰种菩訲細(xì)胞的功能過亢、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對腫瘤抗原不能識別或T細(xì)胞信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；T細(xì)胞對同種異型抗原的識別是發(fā)生移植物抗宿主病(GVHD)的基礎(chǔ)[1]。因此，T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是維持機體健康的基礎(chǔ)，對于諸多免疫相關(guān)性疾病，糾正T細(xì)胞失衡的狀態(tài)則有望治愈疾病。例如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、GVHD等病灶部位都可以發(fā)現(xiàn)0X40 + T細(xì)胞及0X40L+細(xì)胞的浸潤[2]。因此，靶向0X40可能可以減少自身抗原反應(yīng)性的T細(xì)胞，對上述疾病具有潛在的治療價值。0X40靶向治療主要是采用0X40L抗體或0X40Ig阻滯0X40-0X401 ]，也有采用0X40耦聯(lián)免疫毒素清除0X40 + T細(xì)胞[4]，均在實驗性自身免疫性腦脊髓炎等動物模型中取得了一定的療效。利用單克隆抗體及其免疫毒素靶向殺傷活化T細(xì)胞以治療免疫相關(guān)性疾病的理念已在臨床研究中廣泛開展。目前在進(jìn)行I期和II期臨床試驗的就包括抗⑶3、⑶5、⑶7及IL-2R的單抗及其免疫毒素，針對T細(xì)胞活化分子VLA-4、CD40L、0X40等的單抗在臨床前研究中也顯示了良好的應(yīng)用前景[5]。
在兒童血液系統(tǒng)疾病中，再生障礙性貧血(AA)、噬血細(xì)胞綜合征(HLH)等疾病的發(fā)生均與T細(xì)胞的過度活化、免疫失調(diào)密切相關(guān)。在AA，免疫抑制劑的治療效果已非?？隙?，可以使70%的患兒得到基本治愈[6]。但一般治療過程需要數(shù)年，藥物的毒副作用也非常大，況且仍有30%左右的病人治療反應(yīng)不佳。而HLH則是由于自身的免疫缺陷致病原體難以清除，導(dǎo)致T細(xì)胞過度活化和細(xì)胞因子風(fēng)暴而損傷臟器，該病進(jìn)展迅速、死亡率非常高，基本的治療手段也是通過激素、環(huán)孢素及依托泊苷等藥物抑制或殺滅T細(xì)胞而使疾病緩解[7]。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)，上述病人的外周血T細(xì)胞表面T細(xì)胞活化分子呈高表達(dá)，這也為利用靶向活化分子殺傷活化的T細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ)。
ZCH(Zhejiang Children’s Hospital)_2B8a (簡稱 2B8a)是鼠抗人造血細(xì)胞分化抗原的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，以分化早期的CD34+白血病細(xì)胞KGla作為免疫原，采用經(jīng)典雜交瘤技術(shù)制備而成。經(jīng)三次亞克隆培養(yǎng)，建立了能穩(wěn)定分泌2B8a抗體的雜交瘤細(xì)胞系。該抗體經(jīng)遞交第8屆國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會議(8th International Workshopand Conference on Human Differentiation Antigens, HLDA8)鑒定后認(rèn)為該抗體識別的抗原性質(zhì)不明，屬國際上尚未認(rèn)識的造血細(xì)胞膜新的分化抗原或新的CD分子。研究表明，該抗體與正常外周血靜止期T細(xì)胞不反應(yīng)，但與活化的T細(xì)胞反應(yīng)強烈，可能識別新的活化T細(xì)胞分子。因此，2B8a抗體具有開發(fā)成為靶向殺傷活化T細(xì)胞的大分子藥物的臨床應(yīng)用前景。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鼠抗人活化T細(xì)胞抗原(ZCH-6_2B8a單抗，簡稱2B8a單抗)單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，該單抗的重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示；該單抗的輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種鼠抗人活化T細(xì)胞抗原(ZCH-6_2B8a單抗，簡稱2B8a單抗)單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因在制備靶向治療活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)性疾病藥物中的應(yīng)用，所述的免疫相關(guān)性疾病包括再生障礙性貧血、噬血細(xì)胞綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。用于制備藥物的是如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)及如SEQ ID N04所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的免疫球蛋白。
研究表明，2B8a單抗能夠有效識別人體內(nèi)的活化T細(xì)胞，對于再生障礙性貧血、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、噬血細(xì)胞綜合征等由T細(xì)胞過度活化介導(dǎo)發(fā)病的免疫性疾病具有靶向治療的應(yīng)用前景。
采用單克隆抗體及其免疫制劑(如免疫毒素)靶向殺傷活化T細(xì)胞以期達(dá)到治療免疫相關(guān)疾病的基本條件包括以下幾方面:1.該抗體的反應(yīng)譜窄，在人體的其他組織器官表面不表達(dá)或極低表達(dá)，以免在治療過程中造成“脫靶效應(yīng)”，對正常的組織器官產(chǎn)生毒副作用。2.該抗體識別的抗原在活化T細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)。3.該抗體可以介導(dǎo)補體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)或抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC);或者當(dāng)抗體偶聯(lián)化學(xué)制劑如免疫毒素或放射性物質(zhì)時，該抗體可有效介導(dǎo)內(nèi)化。
本研究組采用免疫組化技術(shù)觀察了 2B8a單抗與人體組織芯片的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，2B8a抗原僅在扁桃體、淋巴結(jié)、胸腺、脾臟和骨髓等含淋巴系統(tǒng)的組織中表達(dá)，而在大腦、小腦、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、唾液腺、咽部、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肺、心臟、肝臟、胰腺、腎臟、膀胱、前列腺、子宮內(nèi)膜、宮頸、乳腺、卵巢、睪丸、皮膚、骨骼肌等20余種臟器中均不表達(dá)。
2B8a抗體在T細(xì)胞受PHA (植物凝集素)刺激后12h內(nèi)即可表達(dá)于胞膜上，后表達(dá)強度逐漸增強，并于72 96h達(dá)高峰，之后仍呈持續(xù)高表達(dá)，提示它是一個早期穩(wěn)定的T細(xì)胞活化分子。在再生障礙性貧血(AA)等免疫相關(guān)性疾病病人的血液標(biāo)本的T細(xì)胞表面，2B8a抗原的表達(dá)明顯上調(diào)，提示該抗體可能可用于AA等活化T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的治療。
此外，2B8a抗體可以快速內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在4°C和37°C均可以快速“內(nèi)化”。2B8a抗體能激活補體，介導(dǎo)補體依賴的 細(xì)胞毒作用殺傷Raji細(xì)胞，而對2B8a抗原陰性的細(xì)胞基本無殺傷作用。
以上研究表明，2B8a抗體與血液淋巴組織之外的組織器官不存在交叉反應(yīng)、與PHA刺激的活化T細(xì)胞及再障等免疫相關(guān)疾病的外周血T細(xì)胞具有良好的反應(yīng)性，并且可以介導(dǎo)快速內(nèi)化和免疫殺傷，具有治療再障、噬血細(xì)胞綜合癥等活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)性疾病的潛在應(yīng)用價值。
目前，鼠源性單克隆抗體、人鼠嵌合抗體和完全的人源化抗體在臨床上具有應(yīng)用價值。2012年的銷售額最高的10大生物藥品中單克隆抗體制劑占據(jù)了 6席，其中前三位都是治療自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的，年銷售額均在80億美元以上[8]。但是該類藥物價格昂貴，而國內(nèi)尚未見治療活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)疾病的生物制劑的開發(fā)的報道。因此，針對免疫相關(guān)性疾病的單克隆靶向藥物的開發(fā)具有開闊的臨床應(yīng)用前景和良好的社會和經(jīng)濟效益，將極大地降低有關(guān)疾病的治療成本。


圖1 是；pGEM -T Easy/VH2B8a 和pGEM -T Easy/VL2B8a 酶切鑒定電泳圖。
圖2是鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH_2B8a單克隆抗體的可變區(qū)重鏈基因(VH2B8a)序列(兩個黑色箭頭之間的序列)。序列位置:76-435，共360bp。
圖3是鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH_2B8a單克隆抗體的的可變區(qū)輕鏈基因(VL2B8a)序列(兩個黑色箭頭之間的序列)。序列位置:622-960，共339bp。
圖4是2B8a單克隆抗體與人組織芯片的反應(yīng)性。
圖5是2B8a抗原在PHA活化的T細(xì)胞上的表達(dá)隨時間變化情況。
圖6是2B8a熒光抗體在木瓜酶酶切后陽性率的變化。
圖7是2B8a抗體介導(dǎo)補體依賴的細(xì)胞毒(⑶C)作用。
具體實施方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例，作進(jìn)一步的說明。
實施例一
本發(fā)明2個基因的核苷酸序列及氨基酸序列:
(l)2B8a單抗重鏈可變區(qū)基因(VH2B8a)具有SEQ ID NO I的核苷酸序列，編碼SEQID NO 3的氨基酸序列。
(2)2B8a單抗輕鏈可變區(qū)基因(VL2B8a)具有SEQ ID NO 2的核苷酸序列，編碼SEQID NO 4的氨基酸序列。
2個基因的核苷酸序列及氨基酸序列的獲取步驟如下:
l、ZCH-6_2B8a單抗的研制:基本按Koller&Milstein報告的鼠-鼠雜交瘤經(jīng)典方法進(jìn)行[6]，以急性粒細(xì)胞白血病(未分化型)細(xì)胞株KGla細(xì)胞作為免疫原，將IO7白血病細(xì)胞給8周齡雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脫臼殺死小鼠，無菌取脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS-1細(xì)胞(美國ATCC產(chǎn)品)按6:1混合，以50%聚乙二醇(PEG，美國Sigma公司，分子量3350道爾頓)溶液作為融合媒介進(jìn)行細(xì)胞融合，于96孔板(美國Falcon公司)中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。于融合后第9 20天，隔日用免疫原細(xì)胞對培養(yǎng)上清進(jìn)行間接免疫熒光法(IIF)篩選。陽性孔細(xì)胞經(jīng)3次克隆化并連續(xù)2次100%孔達(dá)到陽性，即建立了能持續(xù)分泌2B8a單抗的雜交瘤細(xì)胞系。經(jīng)8個多月的連續(xù)傳代培養(yǎng)和反復(fù)凍融，其分泌2B8a單抗的能力穩(wěn)定。以其腹水(熒光法效價1:3200)或培養(yǎng)上清(熒光法效價1:16)作為2B8a單抗的來源。
2、2B8a重、輕鏈基因(VH2B8a、VL2B8a)的擴增和克隆
2.1總RNA的抽提和處理:
收集2B8a雜交瘤細(xì)胞8X106，以核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(TRIZOL液)按說明書步驟抽提總RNA。最后溶于25 μ I DEPC (diethyl-pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)水中，并加入RNasin"(核糖核苷酸酶抑制劑)至終濃度為IU/ μ I (單位/微升)。紫外分光光度計測定Α260、Α280及其比值，I %瓊脂糖電泳觀察總RNA。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)前，取2 μ I 2B8a總RNA，按照RQl (無RNA酶的DNA酶試劑盒)說明的方法，消化總RNA中污染的基因組DNA。
2.2 總 RNA 的抽提:
(I)計數(shù)細(xì)胞，共8X IO6個活細(xì)胞；
(2)常溫下1000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心15分鐘，棄上清；
(3)沉淀中加入無菌生理鹽水后在IOOOrpm條件下離心15分鐘，重復(fù)洗滌2次；
(4)向沉淀中加入8ml TRIZOL (lml/106細(xì)胞)，立即用5ml無菌針筒反復(fù)抽打剪切數(shù)分鐘；
(5)將上述TRIZOL溶液按Iml/管轉(zhuǎn)入1.5ml帶蓋小塑料(印pendorf )管中，室溫下靜置5分鐘；
(6)每管加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫下靜置10分鐘；
(7)4° C下12000g離心15分鐘,將水相轉(zhuǎn)入新的1.5ml的eppendorf管中，每管加入0.5ml異丙醇，立即搖勻，室溫下靜置10分鐘；
(8)4。C 下，12000g 離心 10 分鐘;
(9)棄上清，每管加入L 5ml 75%乙醇，混勻，4° C下，7500g離心5分鐘，棄上清；
(10)真空干燥機中晾干，每管加入25 μ I無RNA酶的DEPC水溶解沉淀，_80° C冰箱保存。
2.3總RNA濃度的測定:
取出2 μ I新抽提的總RNA，加入98 μ I DEPC水混勻，紫外分光光度計(GeneQuantII)測定260吸光值(Α260)及280吸光值(Α280)，RNA實際濃度用如下公式計算:
LAN 濃度(μ g/ μ I) = A260/24 X 稀釋倍數(shù)
2.4總RNA凝膠電泳:
取新抽提的總RN A 3μ I加入電泳上樣緩沖液5 μ 1，I %瓊脂糖凝膠內(nèi)含溴乙啶(EB)濃度0.5 μ g/ml，經(jīng)100V直流電壓下電泳5分鐘，凝膠成像系統(tǒng)觀測結(jié)果并攝像保存。
2.5 總 RNA 的處理:取總 RNAl μ I +無 RNA 酶的 DNA 酶(RNase-free Dnase) (IU/μ 1)10μ I + RNasin (40υ/μ 1)1 μ 1，總量達(dá) 12μ 1，經(jīng) 37° CXl 小時，90° CX5 分鐘孵浴后立即置冰上待用。
2.6 RT-PCR:
按照說明書，將RQl無RNA酶的DNA酶處理過的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(25 μ I體系)，并用DNA純化試劑盒(QIAquick)純化mRNA/cDNA雜交雙鏈。取純化的cDNA 2.5 μ I進(jìn)行PCR。
2.6.1 RT反應(yīng)體系:取RQl處理過的總RNA 13μ I +寡聚脫氧胸苷[Oligo(dT)]1.5y 1，總量達(dá)14 .5yL，經(jīng)65° C預(yù)變性5分鐘，立即置冰上，加入以下試劑:DEPC水2.5 μ I + 5倍緩沖液5 μ I + 25mM dNTP (脫氧核苷混合物)0.5 μ I + RNA酶抑制劑1.5μ I +逆轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μυ μ I至總體積25μ 1，經(jīng)37° C，30分鐘孵浴以合成互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)，置95° C 5分鐘，然后移至4° C冰浴備用。
2.6.2 PCR 體系
(I) 50 μ I的PCR反應(yīng)體系:2.5 μ I純化的2B8a IOpmol的輕鏈或重鏈可變區(qū)上下游引物各1μ 1，0.5μ I 25mM的dNTP，5y I 10 X高保真PCR緩沖液，0.2 μ I高保真Taq聚合酶(PlaiirmnrK Taq High Fidelity);引物序列如下:
重鏈可變區(qū)5’ 引物序列(SEQ ID NO 5):GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT
重鏈可變區(qū)3’引物序列(SEQ ID NO 6):CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTGGGT GTC GTT TT
輕鏈可變區(qū)5’ 引物序列(SEQ ID NO 7):GAC ATT CTG ATG ACC CAG TCT
輕鏈可變區(qū)3’ 引物序列(SEQ ID NO 8):GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
(2)反應(yīng)條件:94° C預(yù)變性2分鐘，94° C變性30秒，57° C退火30秒，72° C延伸30秒，共38個循環(huán)；
(3)最后一個循環(huán)完成后，加入 I μ I Taq DNA PolymeraseCTaq DNA聚合酶)72。C延伸7分鐘；
(4)取5μ I PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，同時加標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)志物，鑒定PCR產(chǎn)物片斷大小，分別命名為VH2B8a和VL2B8a基因。結(jié)果可觀察到350堿基對(bp)左右的VH2B8a條帶和325bp左右的VL2B8a條帶。將前述陽性條帶切膠回收純化得到VH2B8a和VL2B8a基因。
3.VH2B8a、VL2B8a基因擴增產(chǎn)物的克隆和鑒定將純化的VH2B8a和VL2B8a基因片段通過連接酶分別與克隆載體pGEM -T Easy連接，獲得的連接產(chǎn)物pGEM -T Easy/VH和pGEM -T Easy/VL，通過轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，得到數(shù)十個白色菌落和數(shù)個藍(lán)色菌落，分別挑取3個白色菌落進(jìn)行質(zhì)粒擴增，抽提后進(jìn)行核酸限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳結(jié)果均可見360bp左右的目的片段`(圖1)。圖1中M:核酸標(biāo)志物，I 4為重組質(zhì)粒pGEM -T Easy/VL2B8a酶切電泳圖:1與3為未酶切質(zhì)粒，2，4為酶切后條帶。在340bp左右可見一片段。5 8為重組質(zhì)粒pGEM -T Easy/VH2B8a酶切電泳圖:5與7為未酶切質(zhì)粒，6，8為酶切后條帶。在360bp左右可見一片斷。
4.VH2B8a、VL2B8a基因序列測定和分析
對陽性重組質(zhì)粒純化后進(jìn)行測序，VH2B8a(參見圖2)和VL2B8a(參見圖3)基因均符合小鼠Ig可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)。VH2B8a基因全長360bp(見序列SEQ ID NO 1)，編碼120個氨基酸(見序列 SEQ ID NO 3),在 IMGT(the international ImMunoGeneTics informationsystem http://www.1mgt.0rg)上進(jìn)行檢索比對,發(fā)現(xiàn)此重鏈可變區(qū)基因與小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因IGHV1-67*01F的同源性達(dá)94.10%，提示該基因歸屬于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，重鏈可變區(qū)含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補區(qū)(CDR)，在第22位和第96位為特征性Cys (半胱氨酸)。VH2B8a氨基酸序列結(jié)構(gòu)框架如下:1 25FR1、26 33CDR1、34 50FR2、51 58CDR2、59 96FR3、97 108CDR3、109 120FR4。
VL2B8a基因全長339bp(見序列SEQ ID NO 2)，編碼113個氨基酸(見序列SEQ IDNO 4)，在NCBI上進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)此輕鏈可變區(qū)基因與小鼠IgK鏈基因IGKV7-3*01P的同源性81.44%，提示該基因歸屬于小鼠Ig的Vk基因。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，輕鏈可變區(qū)含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補區(qū)(CDR)，在第23位和第94位為特征性半胱氨酸(Cys)。VL2B8a氨基酸序列框架如下:1 26FR1、27 36CDR1、37 53FR2、54 56CDR2、57 92FR3、93 101CDR3、102 113FR4。
實施例二 2B8a單抗與人組織器官的反應(yīng)性鑒定
利用免疫組織化學(xué)法觀察2B8a單抗與人組織芯片的反應(yīng)性。具體步驟如下:
1.取組織芯片:FDA999a和BN242，烤片2h
2.脫蠟、水化組織切片。
3.抗原修復(fù):將組織切片浸于PH6.0枸櫞酸鈉緩沖液中，加熱高壓鍋至噴氣時，計時lmin40sec后關(guān)閉高壓鍋閥門，自來水下沖洗鍋蓋至冷卻。
4.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:3% H202去離子水孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。結(jié)束后蒸餾水洗3分鐘X 2次，后PBS5分鐘X 3次。
5.封閉:I %牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉20分鐘
6.一抗孵育:分別滴加一抗2B8a 100-200 μ 1，工作濃度分別為1:100?？瞻讓φ战M加PBS，室溫孵育2-3小時或4°C過夜，結(jié)束后PBS洗5分鐘X 3次。
7.二抗孵育:滴加二抗(兔抗鼠通用型IgG-HRP) 100μ I左右(覆蓋切片即可)，37°C孵育40min，結(jié)束后PBS洗5分鐘X 3次。
8.DAB顯色:滴加DAB顯色劑100 μ I左右孵育3_10min或鏡下控制顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)。
9.Harris蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核:浸于蘇木素液中3_5min,自來水下沖洗。
10.脫水、透明:95% 乙醇(3-5min)-100% 乙醇(5-10min)-100% 苯(3-5min)_ 二甲苯(l_3min)
11.樹膠封片，鏡下觀察。
結(jié)果表明，2B8a抗原僅在扁桃體、淋巴結(jié)、胸腺、脾臟和骨髓等含淋巴系統(tǒng)的組織中表達(dá)(表I及圖4)，而在其他等20余種臟器中均不表達(dá)。圖4從a-c分別為脾臟、淋巴結(jié)和胸腺，d-f分別為扁桃體、小腸(淋巴結(jié)叢呈陽性)和肝臟(少量枯否氏細(xì)胞呈陽性反應(yīng))。脾臟、淋巴結(jié)、胸腺和扁桃體均呈陽性反應(yīng)，小腸和肝臟為陰性，但小腸淋巴結(jié)叢、肝臟少量枯否氏細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。
表I 2B8a抗體與人組織芯片反應(yīng)性
權(quán)利要求
1.一種鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體可變區(qū)基因，其重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 1，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 3，其輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 2，編碼的氨基酸序列為SEQ ID N04。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH-2B8a單克隆抗體可變區(qū)基因在制備靶向治療活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)性疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，用于制備藥物的是如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)及如SEQ ID N04所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的免疫球蛋白，所述的免疫相關(guān)性疾病為再生障礙性貧血、噬血細(xì)胞綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明提供鼠抗人T細(xì)胞抗原ZCH-2B8a單抗可變區(qū)基因，ZCH-2B8a單克隆抗體所識別的抗原是一個早期穩(wěn)定的T細(xì)胞活化分子。以該抗體為基礎(chǔ)制備的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的2B8a-FITC熒光抗體對于抗原的結(jié)合具有高度的敏感性和特異性，同時活性良好，能識別經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激的活化T細(xì)胞和再生障礙性貧血等免疫相關(guān)性疾病病人外周血中的活化T細(xì)胞。因此，該熒光抗體可用于T細(xì)胞功能評估的基礎(chǔ)研究和臨床病例活化T細(xì)胞及其亞群的檢測，可在制備靶向治療活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)性疾病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/13GK103173459SQ201310130568
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月14日
發(fā)明者湯永民, 徐曉軍 申請人:浙江大學(xué)