專利名稱：一種醇脫氫酶在催化生成(r)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種醇脫氫酶的應(yīng)用，尤其涉及一種醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)在以4_氯乙酰乙酸乙酯為底物不對(duì)稱還原反應(yīng)生產(chǎn)0 ) -4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(R) -4-氯-3 輕基丁 酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3_hydroxybutanoate,(TP)-CHBE)是一種重要的有機(jī)中間體，可用于很多活性藥物的合成，如(-)_大內(nèi)酰亞胺A ((-)-macro I act in A)、L_ 肉喊(L-carnitine)和 R-Y-氨基-β -輕基丁酸(GABOB)的關(guān)鍵手性中間體[1，2]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作為還原反應(yīng)的潛手性底物，易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)獲取(ZP)-CHBE是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。迄今為止關(guān)于COBE不對(duì)稱還原制備手性CHBE已進(jìn)行了很多的研究報(bào)道。概括起來(lái)主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)催化不對(duì)稱還原法，所用催化劑包括價(jià)格昂貴的銠、釕等金屬，采用化學(xué)法合成手性CHBE的缺點(diǎn)是產(chǎn)物的光學(xué)純度不夠高，且催化還原反應(yīng)需要很高的氫氣壓，耗能聞，污染大[3]。微生物法分為酶催化和全細(xì)胞催化法，全細(xì)胞法則分為采用野生酵母和基因工程菌催化COBE為 (TP)-CHBE兩種。許多微生物都能還原C0BE，但絕大多數(shù)微生物的還原產(chǎn)物是S構(gòu)型的，只有少數(shù)微生物能獲得R型還原產(chǎn)物，如赭色擲孢酵母{Sporobolomyces salmonicolor)、麥芽糖假絲酵母{Candida maltose)、卡斯太拉德巴利酵母 Webaryomyces castellii)及擲抱圓酵母{Torulaspora nagoyaensis)等，但產(chǎn)物的手性選擇性即對(duì)映體過(guò)量(ee)值只有8% 63%[4’5]。采用野生酵母進(jìn)行催化所獲得的產(chǎn)物的光學(xué)活性往往很低，需要篩選到高立體選擇性的優(yōu)良微生物菌株非常困難，所以近來(lái)的研究著重集中于運(yùn)用重組大腸桿菌不對(duì)稱合成具有高立體選擇性的0 )-CHBE。HiroakiYamamoto等[6]將來(lái)自于Candida parapsi1sis醇脫氧酶基因在大腸桿菌i .coli W3110中表達(dá)，重組菌在水相體系中催化COBE不對(duì)稱還原(輔底物為2-propanol)，得到產(chǎn)物0 )-CHBE,光學(xué)純度 99% e.e。Kataoka.M 等醒基還原酶基因{束這 Sporobolomycessalmonicolor)和葡萄糖脫氫酶基因i^^Bacillus megateriuni)在大腸桿菌中共表達(dá)將此轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)胞用于在水/乙酸正丁酯兩相體系中催化COBE的不對(duì)稱還原。在定期添加輔酶NADP、葡萄糖和底物以及控制pH值的條件下，得到在有機(jī)相中的產(chǎn)物0 )-CHBE濃度為268 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學(xué)純度分別為94.1%和91.7% e.e.。綜上所述，現(xiàn)有催化COBE為0 ) -CHBE的技術(shù)存在底物得率低、產(chǎn)物光學(xué)活性低、成本高等問(wèn)題。
本專利中涉及到的還原酶是醇脫氫酶,其包含336個(gè)氨基酸，其在Genbank中的收錄號(hào)為 EEQ43320.1 (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/protein/EEQ43320.1 )，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。編碼該蛋白的基因含有1011 bp堿基，其在Genbank中的收錄號(hào)為 KC236900, (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/KC236900 )其基因序列如 SEQ IDNO:1所示。至今未發(fā)現(xiàn)該醇脫氫酶用于COBE不對(duì)稱還原制備(TP)-CHBE的報(bào)道。參考文獻(xiàn):
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種醇脫氫酶在COBE不對(duì)稱還原制備(7 ) -CHBE中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脫氫酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不對(duì)稱還原制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯((TP)-CHBE)中的應(yīng)用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脫氫酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，不對(duì)稱還原制備0 )-4-氯-3羥基丁酸乙酯。具體反應(yīng)是將表達(dá)基因序列如SEQ ID NO:1所示的重組菌,25 50g/L的4_氯乙酰乙酸乙酯，在pH6.0 7.5、20-30°C、18(T280rpm條件下，與200mmol/L 2mol/L異丙醇，反應(yīng)16 20h，得到0 )-4-氯-3羥基丁酸乙酯。其中，加入異丙醇可生成NADH，且使反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，降低了加入量以減少了生產(chǎn)成本。發(fā)明人運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)工具，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，采用基因工程的手段從白色念珠菌Candida克隆醇脫氫酶的基因,在大腸桿菌中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其在水相中能夠高效的催化COBE為0 ) -CHBE, e.e值為100%。同時(shí)，通過(guò)在水相和水/有機(jī)相中反應(yīng)、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞和酶的抑制作用，顯著的提高了轉(zhuǎn)化效果。通過(guò)對(duì)醇脫氫酶的基因進(jìn)行重組表達(dá)，獲得了具有新型催化功能的酶蛋白，開發(fā)了該條基因的新功能——催化非天然底物COBE為高立體選擇性的0 )-CHBE。有益效果:本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脫氫酶應(yīng)用于COBE不對(duì)稱還原制備0 ) -CHBE中，取得很好的效果，其酶活高達(dá)5.6U/mg。氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的醇脫氫酶對(duì)底物COBE的得率高(大于90%)、產(chǎn)物CHBE的光學(xué)活性高(e.e%為100%)，且產(chǎn)量高，大大降低了生產(chǎn)成本。


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圖1為醇脫氫酶基因的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施方式
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根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:重組大腸桿菌萬(wàn).Rosetta (pET_22b_CA)
1、醇脫氫酶基因的獲取
白色念珠菌 Candida albicansiMi^ Centraalbureauvoor Schimmelcultures (CBS)Fungal Biodiversiry Centre),培養(yǎng)基 YPD (g.L4):酵母提取物 IOg,蛋白胨 20g,葡萄糖20g，補(bǔ)蒸餾水至1L。將白色念珠菌Candida albicans接種于5mL YPD液體培養(yǎng)基中30 V培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試劑盒，⑶2415 Yeast gDNA Kit)提取基因組。構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
上游引物(CA-sense 含 NdeI)為:5’- GGAATTC CATATGTCAATTCCATCTACTCAGTACG -3’ 下游引物(CA-anti 含 BamHI)為:5’- CGC GGATCCTTATGGATTAAACACGACTCTTCCT -3’ 所有引物均由美吉生物公司合成。基因的PCR條件:
94 °C變性7 min，按如下參數(shù)循環(huán)30次:94 °C變性I min，60 °C退火50 s，72 °〇延伸 1.5 min。最后 72 °C延伸 10 min。2、表達(dá)載體的構(gòu)建
用Nde I及BamH I分別酶切pET_22b (pET_22b購(gòu)于Novagen (默克中國(guó)))及所擴(kuò)增含有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達(dá)載體，將已雙酶切的表達(dá)載體pET-22b與目的基因用T4連接酶進(jìn)行連接過(guò)夜，將10 uL的連接產(chǎn)物pET-22b-CA加入IOOuL的Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30 min, 42 °C熱激90sec。冰上放置2min。加入預(yù)熱的0.45mL LB。220 rpm 37°C Ih0將200 uL菌液加入分另IJ含有100 μ g/mL的氨芐青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)12-16，得到重組菌疋co7i Rosseta (含pET_22b_CADH)。構(gòu)建圖譜見圖1。3、酶活的測(cè)定
挑取重組菌疋co7i Rosseta (pET_22b_CA)及出發(fā)大腸桿菌Rosseta (DE3)至含100 μ g/mL氨芐青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后按2 %接種量分別接種到含100 μ g/mL氨芐青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB新鮮培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度0.8 mmol.Γ1，25°C，220rpm，誘導(dǎo)表達(dá)10 h后，離心(4°C，5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸納緩沖(pH7.0)重懸，超聲破碎細(xì)胞(功率300W,超聲5s，間歇5s，共5min)，離心(4°C，12000rpm, 15min)，測(cè)定上清中的酶活。酶反應(yīng)體系包括IOOmM 磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，5mM NADH, 20mM COBE, 30°C，340nm處測(cè)定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘內(nèi)氧化lymol NADH所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U。蛋白采用Brandford法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，出發(fā)大腸桿菌Rosseta (DE3)的比酶活為0.12U/mg protein,而重組菌E.coli Rosseta (pET22b_CA)的比酶活為 5.6U/mg protein。實(shí)施例2:重組大腸桿菌厶coli Rosseta (pET22b_CA)的發(fā)酵
挑取重組菌萬(wàn).co7i Rosseta (pET_22b_CA)至含抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后按2 %接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37 1:培養(yǎng)至00_約為0.6時(shí)，加入1 丁6至終濃度 0.8 mmol.171, 25°C, 220rpm,誘導(dǎo)表達(dá) 10 h 后，8000 rpm, 4 °C離心 10 min,棄上清，沉淀備用。實(shí)施例3:
取實(shí)施例2的沉淀用磷酸鈉緩沖(100 mmol -L-1, pH 6.5)洗滌兩次，稱取2g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于總體系25 mL的反應(yīng)液中(pH 6.5磷酸鉀緩沖與醋酸丁酯體積比為 1:1)。加入異丙醇 150mmol/L，C0BE 25g/L，30°C，180rpm，12h。產(chǎn)物 0 )_CHBE 的產(chǎn)量為20.5 g/L，產(chǎn)物的得率為:82%，光學(xué)純度e.e%為100%。產(chǎn)物的檢測(cè)方法如下(以下實(shí)施例中產(chǎn)物的檢測(cè)方法和實(shí)施例3相同):
對(duì)于水相反應(yīng):反應(yīng)結(jié)束后，8000 rpm尚;L.、10 min分尚有機(jī)層和水層。小;L.、吸取上
層乙酸乙酯過(guò)有機(jī)膜，加入內(nèi)標(biāo)，保存測(cè)樣。對(duì)于水/有機(jī)兩相反應(yīng):反應(yīng)結(jié)束`后8000 rpm離心10 min分離有機(jī)層和水層。小心吸取上層乙酸乙酯過(guò)有機(jī)膜，保存測(cè)樣。檢測(cè)產(chǎn)物旋光性的樣品處理(乙?；?:取5-10 ul樣品，加入乙酸酐0.2 mL，無(wú)水吡啶0.lmL，密閉條件下沸水浴中保持I h，冷卻至室溫，加入I mL乙酸乙酯，用水洗滌兩次(每次I mL)，然后用同樣體積的飽和食鹽水洗滌兩次，分出有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜。
測(cè)定COBE和CHB濃度以及產(chǎn)物的旋光性都使用氣相7820A (Agi Ient)進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定 COBE 和 CHB 濃度，色譜柱為 PEG-20M 毛細(xì)管柱(HP-FFAP ; 30m X 0.32mm X 0.25mm ；Agilent)，檢測(cè)器FID溫度220°C，汽化室溫度220°C，柱溫130°C。對(duì)產(chǎn)物的旋光性進(jìn)行分析，色譜柱CP-Chirasil-Dex CB (25m*25mm*25um ;Aglilent)，檢測(cè)器FID溫度 250°C，汽化室溫度250°C，柱溫120°C，R型和S型CHBE的出峰時(shí)間分別為:16.813min和17.413min。實(shí)施例4:
取實(shí)施例2的沉淀用磷酸鈉緩沖(100 mmol.L-1, pH 6.5)洗滌兩次，稱取5g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于總體系25 mL的反應(yīng)液中(pH 6.5磷酸鉀緩沖)。加入異丙醇150mmol/L, COBE 25g/L，30°C，180rpm，12h。產(chǎn)物 0 )-CHBE 的產(chǎn)量為 23.5 g/L，產(chǎn)物的得率為:94%，光學(xué)純度e.e%為100%。實(shí)施例5:
取實(shí)施例2的沉淀用磷酸鈉緩沖(100 mmol.L_S pH 6.5)洗滌兩次，稱取5g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于總體系25 mL的反應(yīng)液中(pH 6.5磷酸鉀緩沖與醋酸丁酯體積比為 1:1)。加入異丙醇 300mmol/L，C0BE 50g/L，30°C，180rpm，12h。產(chǎn)物 0 )_CHBE 的產(chǎn)量為37.2g/L，產(chǎn)物的得率為:74.3%，光學(xué)純度e.e%為100%。
實(shí)施例6:
取實(shí)施例4的沉淀用磷酸鈉緩沖(100 mmol -L-1, pH 7.0)洗滌兩次，稱取2g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于15 mL的pH 7.0磷酸鈉緩沖中。超聲處理細(xì)胞(功率300W，超聲5s,間歇 5s,共 5min),加入葡萄糖 500mmol/L, COBE 50g/L(0h、2h、4h、6h、IOh 各 10g/L )，GDH 200U，NAD 0.lmmol/L，25°C，220rpm，16h。產(chǎn)物 0 )-CHBE 的產(chǎn)量為 46.5g/L，產(chǎn)物的得率為:93%，光學(xué)純度e.e%為100%。實(shí)施例7:
取實(shí)施例4的沉淀用磷酸鈉緩沖(100 mmol -L-1, pH 7.0)洗滌兩次，稱取2g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于15 mL的pH 7.0磷酸鈉緩沖中。超聲處理細(xì)胞(功率300W，超聲5s，間歇 5s，共 5min)，加入甲酸鈉 500mmol/L, COBE 50g/L (0、2、4、6、IOh 各 10g/L )，F(xiàn)DH200U，NAD 0.lmmol/L, 25°C,220rpm, 16 h。產(chǎn)物(TP)-CHBE 的產(chǎn)量為 43.8g/L，產(chǎn)物的得率為:87.6%,光學(xué)純度e.e%為100%。
權(quán)利要求
1.一種醇脫氫酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原制備0 )-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醇脫氫酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADH為輔因子，不對(duì)稱還原制備0 )-4_氯-3羥基丁酸乙酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于以氨基酸序列如SEQID NO:2所示的醇脫氫酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADH為輔因子，醇脫氫酶的酶活為5.6U/mgprotein。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于表達(dá)基因序列如SEQID NO:1所示的重組菌，與200mmol/L 300mmol/L異丙醇、1.5 50g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯，在pH6.0 7.5、2(T30°C、18( T280rpm條件下反應(yīng)16 20h，得到0 )_4_氯-3羥基丁酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氨基酸序列如SEQIDNO2所示的醇脫氫酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。即以氨基酸序列如SEQIDNO2所示的醇脫氫酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADH為輔因子，不對(duì)稱還原制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQIDNO2所示的醇脫氫酶應(yīng)用于4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高達(dá)5.6U/mg，其對(duì)底物的得率高達(dá)94%、產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值為100％，且產(chǎn)量高，大大降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103160547SQ201310132479
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者嚴(yán)明, 許琳, 顧金海, 郝寧, 李艷, 魏淼 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)