專利名稱：鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因zh0-ii及其原核表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因及其高效表達(dá)鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶蛋白ZHO-1I的原核表達(dá)載體pGEX-4T-l-ZM -JJ及其在制備海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，由于能源危機(jī)的加劇，環(huán)境問題日益突出，以海藻生物質(zhì)為原料生產(chǎn)生物能源越來越受到重視。大型海藻含有豐富碳水化合物，如海藻酸，開發(fā)相應(yīng)的技術(shù)可將其轉(zhuǎn)化為生物乙醇，產(chǎn)量高，且容易預(yù)處理。目前，海藻酸降解的方法可分為三大類:一類是化學(xué)降解法，目前廣泛采用的是酸水解法，這種方法操作步驟繁瑣，反應(yīng)條件劇烈。此外，還有過氧化氫氧化降解法；第二類是物理降解法，例如超聲降解海藻酸；第三類是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，環(huán)境友好，作用機(jī)理明確，產(chǎn)物確定，可以根據(jù)具體目的產(chǎn)物要求選擇單一或組合使用不同底物專一性的酶制劑。目前，海藻酸裂解酶的生產(chǎn)大多是依靠海藻酸分解菌。雖然野生型海藻酸分解菌能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產(chǎn)量很低成本較高，難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用要求。因此，利用基因工程手段對海藻酸裂解酶基因進(jìn)行異源表達(dá)是提高海藻酸裂解酶產(chǎn)量的最有效途徑。1993年,Boyd等首次克隆了Psoudomoims alginovora海藻酸裂解酶的編碼基因algL并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，其粗蛋白活性達(dá)到146U/mg。1996年Frederic PsGudomormsalginovora中編碼海藻酸裂解酶的基因aly在大腸桿菌中表達(dá)，并且其催化活性達(dá)到97U/mgo 2009 年，Gaofei Vnxan 等在Pseudoalteromonassp.CY24 中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大腸桿菌中表達(dá)得到一個(gè)58KD的蛋白，催化活性達(dá)到了 121.6U/mg。2012年,Hwan Hee Park等利用sp.MJ-3的基因組構(gòu)建基因文庫,篩選得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，得到了一種對PolyM和polyG都有活性的雙功能酶。
目前，國內(nèi)外所發(fā)現(xiàn)的海藻酸分解菌的種類眾多，主要分布于海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌和真菌等，但被成功克隆及異源表達(dá)的海藻酸裂解酶并不多，傳統(tǒng)方法一般利用海藻酸鈉分解菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)分離、純化得到海藻酸裂解酶，這種方法存在野生菌產(chǎn)酶量低、酶與降解產(chǎn)物難于分離，生產(chǎn)成本高等問題，成為酶解技術(shù)大量制備褐藻膠低聚糖的制約性技術(shù)難題，限制了海藻酸裂解酶的推廣使用，且大多數(shù)海藻酸裂解酶只能單一的利用PloyG或者PloyM，本發(fā)明從鞘氨醇單胞菌ZHO中成功克隆出海藻酸裂解酶基因并進(jìn)行了異源表達(dá)和蛋白純化的研究，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1I具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物,是一種具有廣闊運(yùn)用前景的雙功能酶,本發(fā)明為進(jìn)一步研究海藻酸裂解酶分子機(jī)理，進(jìn)而推廣到工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鞘氨醇單胞菌的海藻酸裂解酶基因ZHO-1I，該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不,該基因編碼如SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一目的是提供一種鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因^% -//的原核表達(dá)載體，該載體含有海藻酸裂解酶基因ZM -/八Ptac啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS、GST標(biāo)簽，ZHO-1I基因的上游為Ptac啟動(dòng)子，Ptac啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠乃 -//基因的起始密碼子上游的是一個(gè)GST標(biāo)簽序列，可生成易溶于水的融合表達(dá)蛋白，之后通過凝血酶可將GST標(biāo)簽切除而不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)活性。本發(fā)明中所述海藻酸裂解酶基來源于鞘氨醇單胞菌sp.ZHO。本發(fā)明的另一目的是將鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZHO-1I的原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-ZM -//應(yīng)用在制備海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白中。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
1、鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZHO-1I基因的獲得及原核表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)根據(jù)鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶N端和C端的保守序列和原核表達(dá)載體pGEX-4T-l多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)如下I對特異引物:
ZH0-2-F:5，-GGATCCGCACCGGCC GCAGCGCACTCGGCC-3，,
ZH0-2-R:5’ -GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG-3’，在 h下游引物的 5’ 端分別加A BamH I和Not I酶切位點(diǎn)(下劃線為酶切位點(diǎn))；提取鞘氨醇單胞菌sp.ZHO的基因組，使用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到海藻酸裂解酶ZHO-1I的全長DNA序列；
(2)回收并純化海藻酸裂解酶ZHO-1I全長基因片段，并將其連接到Pmdl9-T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD19-ZM -JJ ；
(3)構(gòu)建原核載體pGEX-4T-l-Z挪-JJ，用BamHI和Not I雙酶切_19-ZH0_II和PGEX-4T-1，并回收純化ZHO-1I基因片段以及載體片段PGEX-4T-1，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切檢測，獲得原核表達(dá)載體pGEX-4T-l-ZM -JJ，進(jìn)行測序比對分析，將測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。2、海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的原核表達(dá)
使用熱刺激法將PGEX-4T-1-Z挪-JJ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，在終濃度ImM IPTG誘導(dǎo)下篩選最佳表達(dá)條件，并在最適條件下進(jìn)行大量表達(dá)；
3、海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白純化
收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，過GST瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化，收集純化后的蛋白，純化后的蛋白用于ZHO-1I蛋白表達(dá)SDS-PAGE檢測及下一階段實(shí)驗(yàn)。4、海藻酸裂解酶ZHO-1I的特性研究
對純化后的海藻酸裂解酶ZHO-1I進(jìn)行特性研究，內(nèi)容包括最適PH，最適溫度，熱穩(wěn)定性等，本發(fā)明獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白，其最適pH為6.5，最適溫度為47°C，在50°C, IOmin損失50%的酶活性；本發(fā)明中使用的測定方法為常規(guī)的海藻酸裂解酶活性測定方法，測定反應(yīng)底物在A235nm處吸光值的變化。本發(fā)明對海藻酸裂解酶基因進(jìn)行了擴(kuò)增，并進(jìn)一步原核表達(dá)和蛋白純化，獲得的ZHO-1I蛋白，現(xiàn)有技術(shù)海藻酸裂解酶野生菌株通過發(fā)酵培養(yǎng)到產(chǎn)酶，至少需要3天時(shí)間，而本發(fā)明的基因工程菌株只需要6h即可得到最大量的目的蛋白，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1I具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，是一種具有廣闊運(yùn)用前景的雙功能酶，本發(fā)明解決了現(xiàn)有的產(chǎn)海藻酸裂解酶的菌株的酶產(chǎn)量比較低的問題，也為進(jìn)一步對裂解酶ZHO-1I進(jìn)行機(jī)理及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明鞘氨醇單胞菌ZHO基因組DNA的檢測示意圖；其中M是DNA marker ；
I是基因組DNA ；
圖2為本發(fā)明海藻酸裂解酶基因ZHO-1I的TA克隆策略示意圖3為本發(fā)明TA克隆重組質(zhì)粒mm-ZHO-1I的電泳檢測及酶切檢測示意圖，其中:A圖為質(zhì)粒的電泳檢測示意圖，圖中:MSDNA marker ; 1-2為pMD19-ZM -JJ;B圖為重組質(zhì)粒的酶切檢測示意圖，圖中:M為DNA marker ；1為BamH I單酶切的pMD19WUJ質(zhì)粒；2為Not I單酶切的pMD19WU質(zhì)粒；3-4為BamH I與Not I雙酶切的pMD19WU質(zhì)粒；圖4為本發(fā)明海藻酸裂解酶基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建策略示意 圖5為本發(fā)明重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-Z挪-JJ的電泳檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ；1-8 是 pGEX-4T-l-Z挪-JJ ；
圖6為本發(fā)明重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-Z挪-JJ的單酶切檢測示意圖，圖中:M是DNAmarker ；1~2是BamH I單酶切的pGEX-4T_l_Z挪-JJ質(zhì)粒；3_4是Not I單酶切的PGEX-4T-1-ZW-1I 質(zhì)粒；
圖7為本發(fā)明重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-Z挪-JJ的雙酶切檢測示意圖，圖中:M是DNAmarker ;1是未酶切的pGEX-4T_l_Z挪-JJ質(zhì)粒；2_5 是Not I與BamH I雙酶切的PGEX-4T-1-ZW-1I 質(zhì)粒；
圖8為本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I表達(dá)的SDS-PAGE檢測示意圖，圖中:M是蛋白marker ；1是pGEX_4T_l質(zhì)粒在37 °C、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，6h的細(xì)菌總蛋白；
2是pGEX-4T-l-Z挪-JJ質(zhì)粒在37 °C、未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，6h的細(xì)菌總蛋白；3_9是PGEX-4T-1-ZHO-1I質(zhì)粒在37 °C、經(jīng)終濃度ImM IPTG誘導(dǎo)后，0、2、4、6、8、10、12h的細(xì)菌總蛋白；
圖9為本發(fā)明海藻酸裂解酶的純化電泳示意圖，圖中:M是蛋白marker ；1是純化前的細(xì)菌上清蛋白；2是純化后的流川液；3是純化后的洗滌液:4是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液一 ；5是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液二 ；
圖10為本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I的最適pH示意圖，圖中:黑色方塊曲線為ZHO-1I蛋白在pH5.0-8.0磷酸鈉緩沖液中的活性示意圖；另一黑色倒三角曲線為ZHO-1I蛋白在pH8.0-9.0 Tris-HCl緩沖液中的活性示意 圖11為本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I的最適溫度示意 圖12為本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I的熱穩(wěn)定性示意 圖13為本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I的金屬離子影響示意 圖14為本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I的底物特異性示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無特殊說明的采用常規(guī)方法，使用的實(shí)際如無特殊說明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。本實(shí)施例中試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，各種限制性內(nèi)切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)及北京莊盟國際生物基因科技有限公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器；所有引物序列均在上海生工合成。實(shí)施例1:鞘氨醇單胞菌sp.ZHO基因組DNA的制備與檢測 本發(fā)明所用的鞘氨醇單胞菌sp.ZHO (ZHO)為本實(shí)驗(yàn)室篩選菌株,鞘氨
醇單胞菌ZHO基因組DNA的制備采用普通細(xì)菌基因組提取方法，具體內(nèi)容如下:取2mL過夜培養(yǎng)菌液于4°C, 4000rpm離心2min,棄盡上清液，收集菌體；加入IOOul Solution I懸菌，然后加入30ul 10%SDS ；lul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C孵育I小時(shí)；加入IOOul 15mol/L NaCl，混勻;加入 20ul CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%,NaCl 0.7mol/L)，混勻，65°C，10 分鐘;加入等體積酚/氯仿/異戊醇25:24:1)混勻，12000rpm離心5分鐘；取上清，加入2倍體積無水乙醇，0.1倍體積3mol/LNa0AC，_20°C放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘；沉淀加A 70%乙醇洗滌；沉淀干燥后，溶于20ul TE，_20°C保存；取2ul基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果(見圖1)說明提取到的基因組DNA質(zhì)量符合要求。實(shí)施例2:海藻酸裂解酶基因ZHO-1I的擴(kuò)增與TA克隆:
海藻酸裂解酶基因乃 -//的擴(kuò)增及TA克隆的策略如圖2所示，根據(jù)鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶N端和C端的保守序列，并設(shè)計(jì)一對特異引物，序列如下:
ZH0-2- F:GG ATCCGCACCGGCCGCAGCGCACTCGGCCZH0-2- R:GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG
5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位點(diǎn)；3’端加GCGGCC特征序列，形成Not I酶切位點(diǎn)；
在PCR反應(yīng)混合液中加入IOng的鞘氨醇單胞菌ZHO基因組DNA作為模板，同時(shí)加入50ng 的特異性引物 ZH0-2-R 和 ZH0-2_F、1.8uldNTP (IOmM), 2.5ul 的 Pfu 反應(yīng)緩沖液和
0.15ul的pfu (5U/ul)聚合酶(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，加入雙蒸水使終體積為20ul ;在PCR儀上于94°C加熱5分鐘，然后按照94°C、45秒，69°C、30秒，72°C、2.5分鐘的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72°C延長反應(yīng)10分鐘的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到ZHO-1I基因，反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收并純化ZHO-1I全長基因DNA (0.7Kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到pMD19-T (大連寶生物公司)載體上，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒的說明書進(jìn)行，反應(yīng)過夜后用反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)JM109 (購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小(圖3A)，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測。分別用BamH I和Not I單酶切重組質(zhì)粒，連接成功的重組質(zhì)粒pMD19-ZH0_II有一條大小為3.3kb左右的ZHO-1I基因DNA片段，進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切，連接成功的重組質(zhì)粒PMD19-ZH0-1I有兩條片段，一條大小為2.6kb左右，另一條為0.7kb左右(圖3B)。測序分析證明重組質(zhì)粒載體中插入的全長基因序列正確，再次確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒_\9-ZH0-1I。實(shí)施例3:原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-Z挪-JJ的構(gòu)建PGEX-4T-1-Z挪-JJ 的構(gòu)建策略如圖 4 所示，用 BamH I (TaKaRa)和 Not I (TaKaRa)切開純化的原核表達(dá)載體PGEX-4T-1 (購自GE Healthcare公司)和pMD19-ZM -JJ，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收PGEX-4T-1被切割后產(chǎn)生的載體片段 pGEX-4T-l (4.9kb)及 pMD19-ZM -JJ 被切割產(chǎn)生的 ZH0-1I 基因的 DNA 片段(0.7kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pGEX_4T_l載體片段和ZH0-1I基因的DNA片段產(chǎn)生原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-ZM -//，用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(JM109，北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，把轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂于加油氨節(jié)霉素(Amp, 100ug/ml)的平板上,于37°C,過夜培養(yǎng),篩選Amp抗性重組子菌落,從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖5)，用BamH 1.Not I (TaKaRa)進(jìn)行雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生4.9kb和0.7kb左右大小的兩條帶(因?yàn)锽amH I,Not I在載體處都只有單一識(shí)別位點(diǎn)，故雙酶切質(zhì)粒應(yīng)有兩個(gè)片段)(圖6-7)。將連接成功的質(zhì)粒載體pGEX-4T-l-ZM -JJ重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒 PGEX-4T-1-Z挪-JJ。實(shí)施例4:海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的表達(dá)與表達(dá)條件的優(yōu)化
用原核表達(dá)載體pGEX-4T-l-ZM -JJ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技)，挑取單菌落加入2mL LB (含有Am p 100mg/L)中，37°C過夜培養(yǎng)(0D6。。約為1.5)，加入終濃度為1.0mM的IPTG分別于37°C誘導(dǎo)0_12小時(shí)后，離心收集菌體，去掉上清液，加入5XSDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer),于100°C加熱10分鐘煮沸菌體，冰浴冷卻后于4°C離心(12000rpm) 10分鐘，取上清作SDS-PAGE，根據(jù)文獻(xiàn)資料和軟件分析預(yù)測目的融合蛋白大小為52kDa左右(GST融合標(biāo)簽為26kDa)，采用12%分離膠，SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，SDS-PAGE電泳結(jié)果表示在37°C誘導(dǎo)6小時(shí)后ZHO-1I蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值，故選取6h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間(見圖8)。實(shí)施例5:海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的純化，具體步驟如下:
a、菌體破碎:將在37°C、ImMIPTG下大量誘導(dǎo)表達(dá)6h的IL菌體，經(jīng)超聲破碎菌體(工作 5s,休息 5s) 20min ；
b、收集上清和沉淀:將菌體破碎液4°C、12000rpm離心20min，分別保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用0.22uM濾器進(jìn)行過濾，除去雜質(zhì)；
d、GST Sefinose Resin柱的預(yù)處理:將柱子中保存用的20%乙醇放出；10倍柱體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4,137mM NaCl，2.7mM KCl)平衡柱子，流速為
0.5-lml/min ；
e、蛋白樣品上柱:流速為0.5ml/min,收集流出液；
f、洗柱:使用5-10 倍體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HPO4,1.4mM KH2PO4,137mM NaCl,
2.7mM KCl，PH7.4)洗脫；
g、洗脫:使用2倍柱體積洗脫緩沖液(IOmMGlutathione (還原型),50mM Tris-HCl,Ph8.0)洗脫，重復(fù)2-3次，收集洗脫液；
h、GSTSefinose Resin 柱的后處理:5 倍柱體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HPO4,1.4mMKH2PO4,137mM NaCl，2.7mM KC1，PH7.4);5倍柱體積去離子水洗柱；于4°C，3倍柱體積的20%乙醇中保存；1、 SDS-PAGE檢測:分別取20ul各洗脫梯度流出液，流川液，洗滌液，粗酶液加入5ul的5X SDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于100°C加熱10分鐘煮沸，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如圖9，最終獲得ZHO-1I純化蛋白。通過上述的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明達(dá)到了如下的結(jié)果:利用本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1I的原核表達(dá)載體(PGEX-4T-1-ZM -//)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，可實(shí)現(xiàn)ZHO-1I蛋白的高水平表達(dá)，表達(dá)的ZHO-1I基本在上清中，ZHO-1I重組蛋白表達(dá)量很高，根據(jù)純化前后的蛋白總量計(jì)算，活力產(chǎn)量可達(dá)63.1%，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，純化ZHO-1I蛋白的操作相當(dāng)簡單，成本也很低，極易重復(fù)使用。實(shí)施例6:海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的特性分析，具體內(nèi)容如下:
1、酶活測定
由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸鈉產(chǎn)生的不飽和糖醛酸在235nm處具有吸收值，通過測量反應(yīng)液在該波長下的變化而計(jì)算相應(yīng)的酶活。在反應(yīng)體系(20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.3%海藻酸鈉)中加入IOug的海藻酸裂解酶蛋白啟動(dòng)反應(yīng)，IOmin后測量溶液235nm處吸光值的變化。酶活定義:在波長235nm下吸光值，以每分鐘吸光值增加I定義為一個(gè)酶活單位(U)。通過測定，純化后 的重組海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的酶活可以達(dá)到61.7U/mg,而現(xiàn)有海藻酸裂解酶酶活基本在20-40U/mg的范圍內(nèi)，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白的酶活要高于現(xiàn)有海藻酸裂解酶酶活的平均值。2、酶學(xué)性質(zhì)的研究
(I)海藻酸裂解酶蛋白最適催化PH值測定
在PH緩沖體系(pH5.0-8.0磷酸鈉緩沖液或pH8.0-9.0 Tris-HCl緩沖液)中用海藻酸鈉為底物測定海藻酸裂解酶的最適反應(yīng)PH，在37°C下反應(yīng)時(shí)間為lOmin，將處于最適pH下的酶活力定義為100%，海藻酸裂解酶ZHO-1I酶的活性和穩(wěn)定性與pH值的關(guān)系曲線如圖10所示，在pH5.0-8.0磷酸鈉緩沖液中，海藻酸裂解酶ZHO-1I最適酶反應(yīng)pH條件為6.5，而在pH8.0-9.0 Tris-HCl緩沖液中，海藻酸裂解酶ZHO-1I的最適酶反應(yīng)pH條件為8.5。(2)海藻酸裂解酶蛋白最適催化溫度和溫度穩(wěn)定性測定怎么
在pH值6.5的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定海藻酸裂解酶的最適反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間為lOmin，將處于最適溫度下的酶活力定義為100%，將酶液分別在不同溫度下保溫lOmin，結(jié)果如圖11所示，酶的最適反應(yīng)溫度47°C，在42 52°C范圍內(nèi)有較高的酶活力；當(dāng)溫度升高到57°C時(shí)，酶活迅速下降，只有峰值的60.6 %。在pH值6.5的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定海藻酸裂解酶的最適反應(yīng)溫度，反應(yīng)IOmin后,在不同溫度環(huán)境下測定酶活性損失,測定反應(yīng)液的剩余酶活力，酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，該酶在37°C保溫IOmin后.剩余酶活力為89.2%;在42°C保溫IOmin后，剩余酶活力為87.8% ;而在52°C時(shí)剩余酶活力僅有19.3%。(3)金屬離子對海藻酸裂解酶蛋白酶活性的影響
在pH6.5的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定不同金屬化合物(反應(yīng)液中金屬離子的濃度為5mM)對海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白活性的影響，以添加相同體積水溶液作為對照組，在最適溫度47°C下測定酶活力，將對照組的酶活力定義為100%，結(jié)果如圖13所示，Hg2+對酶活有完全抑制作用，Mn2+、Cu2+、Zn2+與Fe2+能對酶活有強(qiáng)烈抑制作用，Na2+對酶活有部分抑制作用，K+、Co2+、Ca2+對酶活基本無影響，而Mg2+對酶活有部分促進(jìn)作用。(4)海藻酸裂解酶ZHO-1I的底物特異性實(shí)驗(yàn)
將純化后的海藻酸裂解酶ZHO-1I (Iug)添加到20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，同時(shí)添加質(zhì)量百分比0.3%的不同底物(海藻酸鈉、PloyG, PloyM)，在反應(yīng)溫度為47°C下反應(yīng)lOmin，結(jié)果如圖14所示，ZHO-1I對于PloyG的底物特異性較強(qiáng)，而對于PloyM的底物特異性較差，海藻酸裂解酶對于海藻酸鈉的底物特異性均強(qiáng)于PloyG與PloyM。傳統(tǒng)方法一般利用海藻酸鈉分解菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)分離、純化得到海藻酸裂解酶，然而這種方法存在野生菌產(chǎn)酶量低、酶與降解產(chǎn)物難于分離，生產(chǎn)成本高等問題，成為酶解技術(shù)大量制備褐藻膠低聚糖的制約性技術(shù)難題，限制了海藻酸裂解酶的推廣使用。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含有海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通過誘導(dǎo)發(fā)酵大量生產(chǎn)重組型海藻酸裂解酶將解決這一制約性技術(shù)難題。與傳統(tǒng)方法相比，該方法使得酶的得率大大提高， 且酶的純化過程簡單高效，酶活力高于目前常見的海藻酸裂解酶。
權(quán)利要求
1.鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因其特征在于:海藻酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因的原核表達(dá)載體，其特征在于:該載體含有海藻酸裂解酶基因^% _//、Ptac啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS、GST標(biāo)簽，ZHO-1I基因的上游為Ptac啟動(dòng)子，Ptac啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠ZHO-1I基因的起始密碼子上游的是一個(gè)GST標(biāo)簽序列。
3.權(quán)利要求2所述鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因的原核表達(dá)載體在制備海藻酸裂解酶ZHO-1I蛋白中的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-II及其高效表達(dá)海藻酸裂解酶ZH0-II的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-ZH0-II，該載體用Ptac啟動(dòng)子控制它在大腸桿菌中的表達(dá)，本發(fā)明將海藻酸裂解酶基因采用大腸桿菌表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得表達(dá)產(chǎn)物海藻酸裂解酶ZH0-II，且獲得的重組海藻酸裂解酶ZH0-II具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，酶活可以達(dá)到61.7U/mg，本發(fā)明的原核表達(dá)載體及整體表達(dá)系統(tǒng)容易操作，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103173476SQ201310132790
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者伊日布斯, 過敏, 錢龍, 趙琳, 唐麗薇, 嚴(yán)金平 申請人:昆明理工大學(xué)