專利名稱：鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶zh0-i的原核表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種高效表達鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶蛋白(ZHO-1)的原核表達載體PGEX-4T-1-Z挪-J及其在制備海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白中的應用。
背景技術：
近年來，由于能源危機的加劇，環(huán)境問題日益突出，以海藻生物質為原料生產生物能源越來越受到重視。大型海藻含有豐富碳水化合物，如海藻酸，開發(fā)相應的技術可將其轉化為生物乙醇，產量高，且容易預處理。目前，海藻酸降解的方法可分為三大類:一類是化學降解法，目前廣泛采用的是酸水解法，這種方法操作步驟繁瑣，反應條件劇烈。此外，還有過氧化氫氧化降解法；第二類是物理降解法，例如超聲降解海藻酸；第三類是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，環(huán)境友好，作用機理明確，產物確定，可以根據具體目的產物要求選擇單一或組合使用不同底物專一性的酶制劑。目前，海藻酸裂解酶的生產大多是依靠海藻酸分解菌。雖然野生型海藻酸分解菌能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產量很低成本較高，難達到實際應用要求。因此，利用基因工程手段對海藻酸裂解酶基因進行異源表達是提高海藻酸裂解酶產量的最有效途徑。1993年,Boyd等首次克隆了Pseudomoims alginovora海藻酸裂解酶的編碼基因algL并在大腸桿菌中進行了表達，其粗蛋白活性達到146U/mg。1996年Frederic Pseudomormsalginovora中編碼海藻酸裂解酶的基因aly在大腸桿菌中表達，并且其催化活性達到97U/mg ο 2009 年,Gaofei 等尺在 Pseudoalteromonas sp.CY24 中克隆的到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大腸桿菌中表達得到一個58KD的蛋白，催化活性達到了 121.6U/mg。2012年,Hwan Hee Park等利用sp.MJ-3的基因組構建基因文庫,篩選得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并將其在大腸桿菌中表達，得到了一種對PolyM和polyG都有活性的雙功能酶。
目前，國內外所發(fā)現的海藻酸分解菌的種類眾多，主要分布于海洋細菌、土壤細菌和真菌等，但被成功克隆及異源表達的海藻酸裂解酶并不多，傳統(tǒng)方法一般利用海藻酸鈉分解菌，通過發(fā)酵生產分離、純化得到海藻酸裂解酶，然而這種方法存在野生菌產酶量低、酶與降解產物難于分離，生產成本高等問題，成為酶解技術大量制備褐藻膠低聚糖的制約性技術難題，限制了海藻酸裂解酶的推廣使用，且大多數海藻酸裂解酶只能單一的利用PloyG或者PloyM,本發(fā)明從鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.ZHO中成功克隆出海藻酸裂解酶基因并進行了異源表達和蛋白純化的研究，將為進一步研究海藻酸裂解酶分子機理，進而推廣到工業(yè)生產奠定基礎，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，是一種具有廣闊運用前景的雙功能酶
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種鞘氨醇單胞菌的海藻酸裂解酶ZHO-1的原核表達載體，該載體含有海藻酸裂解酶基因啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS、GST標簽，基因的上游為Ptac啟動子，Ptac啟動子的下游為可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠Z/沿-J基因起始密碼子上游的是一個GST標簽序列，可生成易溶于水的融合表達蛋白，之后通過凝血酶可將GST標簽切除而不影響目的蛋白的結構活性。本發(fā)明中所述海藻酸裂解酶ZHO-1基因來源于鞘氨醇單胞菌SphingomonasSp/7.ZH0，其 GenBank 登錄號為 JX944512.1。本發(fā)明另一目的是將鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZHO-1的原核表達載體應用在制備海藻酸裂解酶ZHO-1中。為了實現本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案:
1、鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZHO-1的獲得和原核表達載體的構建
(1)根據鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因(GenBank登錄號JX944512.1)編碼框序列和原核表達載體PGEX-4T-1多克隆酶切位點，設計I對特異引物如下:
ZH0-1-F: 5’ -GGATCCCACCCCTTCGACCAGGCCGTCGTG-3，,
ZH0-1-R:5’ -GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG-3’，在 h下游引物的 5’ 端分別加入BamH I和Not I酶切位點(下劃線為酶切位點)；提取鞘氨醇單胞菌ZHO的基因組，使用上述引物進行擴增；
(2)回收并純化海藻酸裂解酶ZHO-1全長基因片段，并將其連接到Pmdl9-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD19-ZM -J ；
(3)構建原核載體pGEX-4T-l-Z挪-/，用BamHI和Not I雙酶切pMD19-ZH0_I和PGEX-4T-1，并回收純化海藻酸裂解酶ZHO-1基因片段以及載體片段pGEX_4T_l，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切檢測，獲得原核表達載體PGEX-4T-1-ZM -/，進行測序比對分析，將測序結果進行生物信息學分析。2、海藻酸裂解酶ZHO-1的原核表達
使用熱刺激法將PGEX-4T-1-Z挪-J轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中，在終濃度ImM IPTG誘導下篩選最佳表達條件，并在最適條件下進行大量表達；
3、海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白純化
收集菌體，進行超聲破碎，過GST瓊脂糖凝膠柱進行純化，收集純化后的蛋白，純化后的蛋白用于ZHO-1蛋白表達檢測及下一階段實驗。4、重組海藻酸裂解酶ZHO-1的特性研究
對純化后的海藻酸裂解酶ZHO-1進行特性研究，內容包括最適PH，最適溫度，熱穩(wěn)定性等，本發(fā)明獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1，其最適pH為7.0，最適溫度為42 °C，在50 V，IOmin損失50%的酶活性；本發(fā)明中采用的測定方法為常規(guī)的海藻酸裂解酶活性測定方法，測定反應底物在A235nm處吸光值的變化。本發(fā)明對海藻酸裂解酶ZHO-1基因進行了擴增，并進一步原核表達和蛋白純化，獲得的ZHO-1蛋白，現有技術海藻酸裂解酶野生菌株通過發(fā)酵培養(yǎng)到產酶，至少需要3天時間，而本發(fā)明的基因工程菌株只需要6h即可得到最大量的目的蛋白，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，酶活可以達到53.2U/mg，是一種具有廣闊運用前景的雙功能酶，本發(fā)明原核表達載體及整體表達系統(tǒng)容易操作，便于工業(yè)化生產；本發(fā)明解決了現有的產海藻酸裂解酶的菌株的酶產量比較低的問題，也為進一步對海藻酸裂解酶ZHO-1進行機理及機制研究奠定了基礎。


圖1是本發(fā)明鞘氨醇單胞菌ZHO基因組DNA的檢測，圖中:M是DNA marker ；1是基因組DNA ；
圖2是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1基因的TA克隆策略示意 圖3是本發(fā)明重組質粒pMD19-ZM -J的電泳檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ;1_4是 pMD19WU ；
圖4是本發(fā)明重組質粒pMD19-ZM -J的酶切檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ； 1-4是未酶切的pMD19WU質粒；5-8是BamH I單酶切的pMD19WU質粒；9_12是Not I單酶切的pMD19WU質粒；13是BamH I與Not I雙酶切的pMD19WU質粒；
圖5是本發(fā)明重組質粒pMD19-ZM -J的PCR檢驗示意圖，圖中:M是DNA marker ； I的負對照；2_5的以pMD19-ZM -J為模板，用ZH0-1-F，ZHO-1-R為引物擴增的PCR產物；
圖6是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1基因的原核表達載體構建策略示意 圖7是本發(fā)明重組質粒pGEX-4T-l-Z挪-J的電泳檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ；1-2 是 pGEX-4T-l-Z挪-J ；
圖8是本發(fā)明重組質粒pGEX-4T-l-Z挪-J的酶切檢測示意圖，圖中:M是DNA marker ； I是未酶切的PGEX-4T-1-Z挪-J質 粒；2是BamH I單酶切的pGEX-4T_l_Z挪-J質粒；3是NotI單酶切的pGEX-4T-l-Z挪-J質粒；4是BamH I與Not I雙酶切的pGEX_4T-l_Z挪-J質粒。圖9是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1表達的SDS-PAGE檢測示意圖，圖中:M是蛋白marker ；I是pGEX_4T_l質粒在37 °C、未經IPTG誘導后，6h的細菌總蛋白；2是PGEX-4T-1-Z挪-J質粒在37°C、未經IPTG誘導后，6h的細菌總蛋白；3是pGEX-4T-l_Z挪-J質粒在37°C、經終濃度ImM IPTG誘導后，6h的細菌總蛋白；4是pGEX_4T-l_Z挪-J質粒在37°C、經終濃度ImM IPTG誘導后，8h的細菌總蛋白；
圖10是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1在37°C下表達情況，圖中:M是蛋白marker ;1_6是PGEX-4T-1-Z挪-J質粒在37°C、經終濃度ImM IPTG誘導后，10、8、6、4、2、0h的細菌總蛋白；7-8是pGEX-4T-l質粒在37°C、經終濃度ImM IPTG誘導后，6h和Oh的細菌總蛋白；
圖11是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1在28°C下表達情況，圖中:M是蛋白marker ;1_6是PGEX-4T-1-Z挪-J質粒在28°C、經終濃度ImM IPTG誘導后，0、2、4、6、8、IOh的細菌總蛋白；7是pGEX-4T-l-Z挪-J質粒在37°C下、經終濃度ImM IPTG誘導后，6h的細菌總蛋白；
圖12是本發(fā)明海藻酸裂解酶的純化電泳示意圖，圖中:M是蛋白marker ；1是純化前的細菌上清蛋白；2是純化后的流川液；3是純化后的洗滌液；4是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液一 ；5是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液二 ；6是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液三；7是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液四；8是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液五；
圖13是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1的最適pH示意圖，圖中:黑色方塊曲線為ZHO-1蛋白在pH5.0-8.0磷酸鈉緩沖液中的活性示意圖；另一黑色倒三角曲線為ZHO-1蛋白在pH8.0-9.0 Tris-HCl緩沖液中的活性示意圖；圖14是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1的最適溫度示意 圖15是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1的熱穩(wěn)定性示意 圖16是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1的金屬離子影響示意 圖17是本發(fā)明海藻酸裂解酶ZHO-1的底物特異性示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內容，實施例中方法如無特殊說明的采用常規(guī)方法，使用的實際如無特殊說明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。本實施例中試劑主要分為分子生物學實驗試劑，各種限制性內切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)及北京莊盟國際生物基因科技有限公司產品，質粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余試劑均為國產分析純；儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器；所有引物序列均在上海生工合成。實施例1:鞘氨醇單胞菌5/7.ZHO基因組DNA的制備與檢測 本發(fā)明所用的鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.ZHO (ZHO)為本實驗室篩選菌株,鞘氨
醇單胞菌ZHO基因組DNA的制 備采用普通細菌基因組提取方法，具體內容如下:取2mL過夜培養(yǎng)菌液于4 4000rpm離心2min,棄盡上清液,收集菌體；然后加入IOOul Solution I懸菌、30ul 10%SDS、lul 20mg/ml 蛋白酶 K 混勻，37°C孵育 I 小時；加入 IOOul 15mol/L NaCl,混勻；加入 20ul CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%, NaCl 0.7mol/L)，混勻，65°C，10 分鐘；加入等體積酚/氯仿/異戊醇25:24:1)混勻；離心12000rpm，5分鐘；取上清，加入2倍體積無水乙醇，0.1倍體積3mol/L Na0AC，-20°C放置30分鐘；離心12000rpm，10分鐘；沉淀加入70%乙醇洗滌；沉淀干燥后，溶于20ul TE，-20°C保存。取2ul基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果(見圖1)說明提取到的基因組DNA質量符合要求。實施例2:海藻酸裂解酶ZHO-1基因的擴增與TA克隆
海藻酸裂解酶ZHO-1基因的擴增及TA克隆的策略如圖2所示，首先從GenBank中查找ZHO-1的全長基因序列(ΖΗ0-Ι基因的GenBank登陸號為JX944512.1)，并設計一對特異引物，序列如下:
ZH0-1-F:GGATCCCACCCCTTCGACCAGGCCGTCGTGZH0-1-R:GCGGCCGCTCAGCTCGAGTGCTTTACGTGGAG
5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位點；3’端加GCGGCC特征序列，形成Not I酶切位點。在PCR反應混合液中加入IOng的鞘氨醇單胞菌ZHO基因組DNA作為模板，同時加入 50ng 的特異性引物 ZHO-1-F 和 ZHO-1-R、1.8uldNTP( IOmM), 2.5ul 的 Pfu 反應 Buffer 和
0.15ul的pfu (5U/ul)聚合酶(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，加入雙蒸水使終體積為20ul ;在PCR儀上于94°C加熱5分鐘，然后按照94°C >45秒，67。。、30秒，72°C、2.5分鐘的程序進行30個循環(huán)的反應，最后在72°C延長反應10分鐘的程序進行PCR反應擴增得到ZHO-1基因，反應完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物?；厥詹⒓兓痁HO-1全長基因DNA (1.7Kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到pMD19_T (大連寶生物公司)載體上，實驗操作按試劑盒的說明書進行，反應過夜后用反應混合液轉化大腸桿菌感受態(tài)JM109 (購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，采用堿裂解法提取質粒DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小(圖3)，選取大小和理論值相符的重組質粒進行酶切檢測。分別用BamH I和Not I單酶切重組質粒，連接成功的重組質粒pMD19_ZM -J有一條大小為
4.4kb左右的ZM -/基因DNA片段。進一步進行雙酶切，連接成功的重組質粒pMD19-ZM -J有兩條片段，一條大小為2.6kb左右，另一條為1.7kb左右(圖4-5)。測序分析證明重組質粒載體中插入的ZHO-1全長基因序列正確。再次確認是連接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌JM109，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質粒pMD19-ZM -J。實施例3:原核表達載體PGEX-4T-1-Z挪-J的構建
PGEX-4T-1-ZM -/ 的構建策略如圖 6 所示，用 BamH I (TaKaRa)和 Not I (TaKaRa)切開純化的原核表達載體PGEX-4T-1 (購自GE Healthcare公司)和pMD19_ZM -J，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收PGEX-4T-1被切割后產生的載體片段pGEX-4T-1 (4.9kb )及pMD HZHO-1被切割產生的ΖΗ0-Ι基因的DNA片段(1.7kb )，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pGEX_4T_l載體片段和ΖΗ0-Ι基因的DNA片段產生原核表達載體PGEX-4T-1-ZM -/，用連接反應混合物轉化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(JM109，北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，把轉化后的大腸桿菌涂于加油氨芐霉素(Amp, 100ug/ml)的平板上,于37°C,過夜培養(yǎng),篩選Amp抗性重組子菌落,從Amp抗性重組子菌落中提取質粒(圖7)，用BamH 1.Not I (TaKaRa)進行雙酶切檢測，連接成功的質粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產生4.9kb和1.7kb左右大小的兩條帶(因為BamH I，Not I在載體處都只有單一識別位點，故雙酶切質粒應有兩個片段K圖8)。將連接成功的質粒載體PGEX-4T-1-ZM -/重新轉化大腸桿菌JM109，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質粒PGEX-4T-1-Z挪-J。實施例4:海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白的表達與表達條件的優(yōu)化
用原核表達載體pGEX-4T-l-ZM -J轉化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細胞(天根生化科技)。挑取單菌落加入2mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C過夜培養(yǎng)(0D600約為1.5)。加入終濃度為1.0mM的IPTG分別于37°C、28°C誘導0_10小時后，離心收集菌體，去掉上清液，加入5XSDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于100°C加熱10分鐘煮沸菌體。冰浴冷卻后于4°C離心(12000rpm)10分鐘，取上清作SDS-PAGE。根據文獻資料和軟件分析預測目的融合蛋白大小為91kDa左右(GST融合標簽為26kDa)，采用12%分離膠。SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實驗指南(第三版)》。SDS-PAGE電泳結果(圖9)表示在37°C誘導6小時或者28°C誘導8小時后ZHO-1蛋白表達量最高(圖10-11 )，出于減少包涵體的考慮，選取28 V誘導8小時為最佳誘導條件。實施例5:海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白的純化，具體步驟如下:
(1)菌體破碎:將在28°C、lmMIPTG下大量誘導表達6h的IL菌體，經超聲破碎菌體(工作 5s,休息 5s) 20min ；
(2)收集上清和沉淀:將菌體破碎液4°C、12000rpm離心20min，分別保留上清和沉淀；
(3)蛋白破碎上清液使用0.22uM濾器進行過濾，除去雜質；
(4)GST Sefinose Resin柱的預處理:將柱子中保存用的20%乙醇放出；10倍柱體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HP04,1. 4mM KH2P04,137mM NaCl,2.7mM KCl)平衡柱子，流速為0.5-lml/min ；(5)蛋白樣品上柱:流速為0.5ml/min，收集流出液；
(6)洗柱:使用5-10 倍體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HP04,1.4mM KH2P04,137mM NaCl,
2.7mM KCl，PH7.4)洗脫；
(7)洗脫:使用2倍柱體積洗脫緩沖液(IOmMGlutathione (還原型),50mM Tris-HCl,Ph8.0)洗脫，重復2-3次，收集洗脫液；
(8)GST Sefinose Resin 柱的后處理:5 倍柱體積 PBS 緩沖液(4.3mM Na2HP04,1.4mMKH2P04,137mM NaCl，2.7mM KCl, PH7.4) ；5倍柱體積去離子水洗柱；于4°C，3倍柱體積的20%乙醇中保存；
(9)SDS-PAGE檢測:分別取20ul各洗脫梯度流出液，流川液，洗滌液，粗酶液加入5ul的5X SDS-PAGE上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于100°C加熱10分鐘煮沸，上樣，進行SDS-PAGE分析，純化結果見圖12，最終獲得ZHO-1純化蛋白。通過上述的實驗，本發(fā)明達到了如下的結果:利用本發(fā)明的ZHO-1的原核表達載體(PGEX-4T-1-ZH0-1)轉化大腸桿菌(BL21 )，可實現ZHO-1蛋白的高水平表達，載體表達的海藻酸裂解酶ZHO-1基本在上清中，ZHO-1重組蛋白表達量很高，根據純化前后的蛋白總量計算，活力產量可達65.7%，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細菌，純化ZHO-1蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。實施例6:海藻酸裂解酶ZHO-1蛋 白的特性分析，具體內容如下:
1、酶活測定
由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸鈉產生的不飽和糖醛酸在235nm處具有吸收值，通過測量反應液在該波長下的變化而計算相應的酶活。在反應體系(20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.3%海藻酸鈉)中加入IOug的海藻酸裂解酶蛋白啟動反應，IOmin后測量235nm處吸光值的變化。酶活定義:在波長235nm下吸光值，以每分鐘吸光值增加I定義為一個酶活單位(U)。通過測定，純化后的重組海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白的酶活可以達到53.2U/mg，而現有海藻酸裂解酶酶活基本在20-40U/mg的范圍內，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白的酶活要高于現有海藻酸裂解酶酶活的平均值。2、酶學性質的研究
(I)海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白最適催化pH值測定
在PH緩沖體系(pH5.0-8.0磷酸鈉緩沖液或pH8.0-9.0 Tris-HCl緩沖液)中用海藻酸鈉為底物測定海藻酸裂解酶的最適反應pH，在37°C反應時間為lOmin，將處于最適pH下的酶活力定義為100%，海藻酸裂解酶ZHO-1的活性和穩(wěn)定性與pH值的關系曲線如圖13所示，在酸性或堿性條件下酶的活力和穩(wěn)定性都不高，海藻酸裂解酶ZHO-1最適酶反應pH條件為
7.0。(2)海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白最適催化溫度和溫度穩(wěn)定性測定
在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定酶的最適反應溫度，反應時間為IOmin,將處于最適溫度下的酶活力定義為100%,將酶液分別在不同溫度下保溫IOmin,結果如圖14所示，酶的最適反應溫度42°C，在37 52°C范圍內有較高的酶活力；當溫度升高到57°C時，酶活迅速下降，只有峰值的41.2%。
在PH7.0的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定酶的最適反應溫度，反應時間為IOmin后，在不同溫度環(huán)境下測定酶活性損失，測定反應液的剩余酶活力，酶的熱穩(wěn)定性實驗結果如圖15，由圖可知該酶在37°C保溫IOmin后.剩余酶活力為88.5%;在42°C保溫IOmin后，剩余酶活力為85.4% ;而在52°C時剩余酶活力僅有40.3%。(3)金屬離子對海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白活性的影響
在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中用海藻酸鈉為底物測定不同金屬化合物(反應液中金屬離子的濃度為5mM)對海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白活性的影響，以添加相同體積水的溶液作為對照組，在最適溫度42°C下測定酶活力，將對照組的酶活力定義為100%，結果如圖16所示，Hg2+對酶活有完全抑制作用，Zn2+與 Co2+能對酶活有強烈抑制作用，Mg2+與Na2+對酶活有部分抑制作用，而K+，Ca2+與Mn2+對酶活有部分促進作用。(4)海藻酸裂解酶ZHO-1蛋白的底物特異性
將純化后的海藻酸裂解酶ZHO-1 (Iug)添加到20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，同時添加質量百分比0.3%的不同底物(海藻酸鈉、PloyG, PloyM)，在反應溫度為42°C下反應IOmin,結果如圖17所示，ZHO-1對PloyG與PloyM均有底物特異性，但對于PloyG的底物特異性相對略強一些。傳統(tǒng)方法一般利用海藻酸鈉分解菌，通過發(fā)酵生產分離、純化得到海藻酸裂解酶，然而這種方法存在野生菌產酶量低、酶與降解產物難于分離，生產成本高等問題，成為酶解技術大量制備褐藻膠低聚糖的制約性技術難題，限制了海藻酸裂解酶的推廣使用。本發(fā)明采用基因工程技術，構建含有海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通過誘導發(fā)酵大量生產重組型海藻酸裂解酶將解決這一制約性技術難題。與傳統(tǒng)方法相比，該方法使得酶的得率大大提高，且酶的純化過程簡單高效，酶活力高于目前常見的海藻酸裂解酶。
權利要求
1.鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZHO-1的原核表達載體，其特征在于:該載體含有海藻酸裂解酶基因ZHO-1啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS、GST標簽，ZHO-1基因的上游為Ptac啟動子，Ptac啟動子的下游為可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠基因起始密碼子上游的是一個GST標簽序列。
2.根據權利要求1所述鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZHO-1的原核表達載體，其特征在于:海藻酸裂解酶2% -/基因來源于鞘氨醇單胞菌，其GenBank登錄號為JX944512.1。
3.權利要求1所述鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZHO-1的原核表達載體在制備海藻酸裂解酶ZHO-1中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp.ZH0海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表達載體pGEX-4T-1-ZH0-I，該載體是含有鞘氨醇單胞菌ZH0海藻酸裂解酶基因ZH0-I的原核表達載體，本發(fā)明原核表達載體能夠在較短時間內獲得表達產物海藻酸裂解酶ZH0-I，且獲得的重組海藻酸裂解酶ZH0-I具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，酶活可以達到53.2U/mg，是一種具有廣闊運用前景的雙功能酶，本發(fā)明原核表達載體及整體表達系統(tǒng)容易操作，便于工業(yè)化生產。
文檔編號C12N15/70GK103215297SQ20131013329
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權日2013年4月17日
發(fā)明者伊日布斯, 過敏, 錢龍, 趙琳, 唐麗薇, 嚴金平 申請人:昆明理工大學