專利名稱：一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的制備方法，特別涉及一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt CryQC的制備方法。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性菌，在其芽孢的形成過程中，會形成具有殺蟲活性的晶體蛋白(Cry蛋白)。該蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種害蟲具有較高的毒性，是應(yīng)用最為廣泛的毒蛋白。由于此特性，編碼Cry蛋白的基因被生物學者認作是轉(zhuǎn)基因作物的熱門備選基因，并已有多個轉(zhuǎn)基因作物品種轉(zhuǎn)入該基因并商品化，在全球范圍內(nèi)廣泛種植。Bt菌系含有大量不同的殺蟲晶體蛋白編碼基因，至今已有近180個不同的Bt殺蟲晶體蛋白基因被克隆和測序，cry9C就是其中一種。轉(zhuǎn)基因作物的種植滿足了人類對糧食產(chǎn)量、經(jīng)濟效益需求。同時，也存在著環(huán)境安全風險，外源基因?qū)氲碾S機性和不確定性，基因表達對作物的生理生化作用的改變，對生態(tài)環(huán)境構(gòu)成的威脅等等都難以預(yù)測。人們對轉(zhuǎn)基因作物的安全性存在擔憂，而消除這一擔憂的有效途徑就是對轉(zhuǎn)基因作物所表達的外源蛋白進行安全性評價。因此，獲取各種Bt殺蟲晶體蛋白基因所表達的外源蛋白，對進行安全性評價意義重大，為后續(xù)的檢驗方法建立、檢測標準的實施提供基礎(chǔ)，從而可以有效防止安全隱患的發(fā)生，避免轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)環(huán)境的破壞，充分發(fā)揮轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的巨大應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種經(jīng)過密碼子優(yōu)化的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白BtCry9C的基因。 所述經(jīng)過密碼子優(yōu)化的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt CryQC的基因，是在不改變蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C氨基酸序列(GenBank:AX100534.1的第1-480位氨基酸)的前提下，將其野生型編碼基因(GenBank:AX100534.1的第1-1440位)的密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子后所得的基因。將優(yōu)化后的基因命名為N-Cry9C，具體可為如下a) -c)中任一 DNA分子:a)序列表中序列I的第109-1548位核苷酸所示的DNA分子；b)序列表中序列I所示的DNA分子；c)與a)或b)所限定的DNA分子至少具有98%的同一性，且編碼序列2或序列2的第37-516位氨基酸所示蛋白質(zhì)的DNA分子。其中，序列I共由1575個核苷酸組成，其中第109-1548位核苷酸為將GenBank:AX100534.1的第1-1440位的密碼子替換為大腸桿菌偏好密碼子后所得的基因序列。序列I編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)，其中序列I的第109-1548位核苷酸編碼序列2的第37-516位氨基酸。序列2共由524個氨基酸組成。
含有所述DNA分子(N-Cry9C基因)的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。所述重組表達載體可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建。所述表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子。為了便于對轉(zhuǎn)基因細胞進行鑒定及篩選，可對所用表達載體進行加工，如加入可發(fā)光化合物的基因(GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)等。在本發(fā)明中，所述重組表達載體中啟動所述DNA分子(N_Cry9C基因)轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為17啟動子。所述重組表達載體具體為將所述DNA分子(N_Cry9C基因)插入到質(zhì)粒pET28a的多克隆位點處得到的重組質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個實施例中，所述多克隆位點為EcoR I和Xho I。更加具體的，所述重組表達載體的(pET28a-9C)的核苷酸序列如序列表中序列3所
/Jn o其中，序列3共由6781個核苷酸組成，第137-1711位核苷酸為序列I的反向互補序列。由所述DNA分子(N-Cry9C基因)轉(zhuǎn)錄所得的RNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的再一個目的是提供一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，具有蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C活性，具體為如下I)或II):I)序列表中序列2的第37-516位氨基酸組成的蛋白質(zhì)；II)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述DNA分子，或所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌，或所述RNA分子，或所述蛋白質(zhì)在制備具有殺蟲活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。在所述應(yīng)用中，所述蟲可為鱗翅目、雙翅目、鞘翅目或膜翅目等多種害蟲；在本發(fā)明的一個實施例中，所述蟲具體為水稻三化螟(Scirpophaga incertulas (Walker))(如第一齡水稻三化螟)。所述產(chǎn)品可為試劑盒。所述DNA分子在提高大腸桿菌中蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C表達量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C具體為序列表中序列2所蛋白質(zhì)。本發(fā)明的還一個目的是提供一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的制備方法。本發(fā)明所提供的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的制備方法，具體包括如下步驟: I)將表達所述DNA分子的所述重組載體(如重組表達載體pET28a_9C)導入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌；2)培養(yǎng)所述重組大腸桿菌，進行誘導表達，收集并裂解菌體，獲得蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C ；所述蘇z 金芽抱桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C具體為序列表中序列2所不蛋白質(zhì)。在上述方法中，步驟I)中的所述表達載體可為能夠表達序列表中序列I所示DNA分子的其他重組原核表達載體。在上述方法中，步驟2)中，所述誘導表達具體為:向培養(yǎng)有所述重組大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入IPTG至其終濃度為lmM，25°C震搖培養(yǎng)9小時。所述培養(yǎng)有所述重組大腸桿菌的培養(yǎng)液的0D600值在0.6-0.8之間。所述震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為120rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為1.5cm。在上述方法中，步驟2 )中，在所述“收集并裂解菌體”之后，還包括離心后收集并溶解包涵體的步驟。在ImM IPTG，25°C誘導9小時的條件下，所述蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C主要表達于包涵體中。本發(fā)明應(yīng)用基因工程方法在國內(nèi)首次合成蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白BtCry9C基因(N-Cry9C基因)。實驗證明，在大腸桿菌中，本發(fā)明所提供的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C基因(N_Cry9C基因)表達所得蛋白并未因密碼子優(yōu)化而影響其蛋白活性。本發(fā)明為進一步探討蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C的檢測方法、生理功能及其作用機制、降解機制打下了基礎(chǔ)。


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圖1為重組質(zhì)粒用EcoR I和Xho I進行雙酶切后DNA分子電泳圖。其中，泳道M為DNA分子量標準IOKbp到IOOObp條帶(天根生物科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號MDlOO-1Kb Ladder)。泳道I為重組表達載體pET28a_9C用EcoR I和Xho I進行雙酶切后條帶。圖2為蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C原核表達結(jié)果(SDS-PAGE)。其中，泳道M為蛋白分子量標準IOKD到170KD條帶(北京拓英坊科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號TF413-01)。泳道I為裂解轉(zhuǎn)入pET28a空載體的對照組菌體制得的上清；泳道2和3為裂解轉(zhuǎn)入重組表達載體pET28a-9C的實驗組菌體制得的包涵體。泳道4為裂解轉(zhuǎn)入重組表達載體pET28a-9C的實驗組菌體制得的上清。箭頭所指為目的蛋白。圖3為蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C原核表達與純化結(jié)果(SDS-PAGE)。其中，泳道M為蛋白分子量標準IOKD到170KD條帶(北京拓英坊科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號TF413-01);泳道I為純化后蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C蛋白。泳道2為裂解轉(zhuǎn)入重組表達載體pET28a-9C的實驗組菌體制得的上清。泳道3為粗提的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C。泳道4為裂解轉(zhuǎn)入pET28a空載體的對照組菌體制得的上清。箭頭所指為目的蛋白。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
pG0V4克隆載體:由基因合成公司Gene Oracle Inc.提供。記載在“Kalle Kantola,Mohammadreza Sadeghi, Anne Lahtinen et al.Merkel cellpolyomavirus DNA in tumor-free tonsillar tissues and upper respiratory tractsamples:1mplications for respiratory transmission and latency.Journal ofClinical Virology, 45 (2009) 292-295.”一文，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。該載體的優(yōu)點之一在于其序列中去除大部分的常規(guī)酶切位點，有利于在合成基因時添加所需要位點，而不會與序列內(nèi)已有位點沖突。在載體與目的片段的連接上，也并非采用酶切連接的方法，而是以平齊末端直接連接。pET28a載體:購置于MERKE N0VAGEN公司，產(chǎn)品目錄號為69864_3。水稻三化螟(Scirpophagaincertulas (Walker)):第一齡，中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所。記載在 “Edwin P.Alcantara, Remedios M.Aguda, AprilCurtiss,et al.Bacillus thuringiensis 6 -Endotoxin Binging to Brush BorderMembrane Vesicles of Rice Stem Borers.Archiver of Insect Biochemistry andPhysiology, 55:169-177(2004).”一文，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。實施例1、蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt CryQC基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成目前,蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)中的野生型蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因有如下兩種:一是GenBank:AY346129.1的第194-1354位核苷酸所示的短序列；另一是GenBank:AX100534.1的第1-1878位核苷酸所示的長序列。其中，GenBank:AX100534.1 的第 1-1161 位核苷酸與 GenBank:AY346129.1 的第 194-1354 位核苷酸一致。由于由以上兩種基因編碼所得的蛋白質(zhì)均具有蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt CryQC活性，本發(fā)明選擇GenBank:AX100534.1的第1-1440位核苷酸作為進行密碼子優(yōu)化的野生型基因序列，旨在兼顧選擇蛋白活性部位的同時，將目的蛋白大小控制在一個易于進行原核表達的范圍。具體如下:根據(jù)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)中的野生型蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因序列(GenBank:AX100534.1的第1-1440位核苷酸)，經(jīng)過設(shè)計和反復(fù)驗證得到適合于在大腸桿菌中表達的優(yōu)化型蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因序列，即將野生型蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因序列在不改變氨基酸序列(GenBank:AX100534.1的第1-480位氨基酸)的前提下轉(zhuǎn)變成大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子優(yōu)化序列，從而提聞蘇z 金芽抱桿菌晶體蛋白Bt Cry9C在大腸桿菌培養(yǎng)環(huán)境中的表達水平。根據(jù)上述方法，最終獲得按大腸桿菌偏好設(shè)計的優(yōu)化型蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因，命名為N-Cry9C基因，其基因序列為序列表中序列I的第109-1548位，共由1440個核苷酸組成。所述N-Cry9C基因編碼的蛋白為序列表中序列2的第37-516位氨基酸組成的蛋白，與GenBank:AX100534.1的第1-1440位核苷酸所示的野生型蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因編碼的蛋白相同。實施例2、蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的原核表達一、原核重組表達載體pET28a_9C的構(gòu)建為了構(gòu)建表達載體的需要，在實施例1所得優(yōu)化后蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白BtCry9C基因(N_Cry9C基因)的兩端分別添加酶切位點EcoR I和Xho I的識別序列，得到序列“序列I的第103-1554”。人工合成該序列，并將該序列所示DNA片段與pG0V4克隆載體相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明在PG0V4克隆載體中插入“序列I的第103-1554”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pG0V4-9C。將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pG0V4-9C用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I進行雙酶切，回收目的基因片段；將所得目的基因片段與經(jīng)過同樣酶切的pET28a載體的骨架大片段相連，連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞(天根生化科技(北京)有限公司)中，涂板篩選。挑取陽性單克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I進行雙酶切酶切圖譜如圖1所示。將經(jīng)過酶切鑒定得到大小約為5341bp和1440bp兩個目的條帶的重組質(zhì)粒送樣測序。將經(jīng)測序表明在pET28a載體的多克隆位點EcoR I和Xho I之間插入序列表中序列I的第109-1548位核苷酸序列的重組質(zhì)粒命名為pET28a-9C。重組表達載體pET28a_9C的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中第137-1711位核苷酸為序列I的反向互補序列。在重組表達載體pET28a-9C中，在所述N_Cry9C基因(序列I的第109-1548位)的上游和下游均連接有pET28a載體上自帶的His標簽，以便進行原核表達時進行目的蛋白的純化；具體而言，在重組表達載體pET28a-9C中，所述N_Cry9C基因(序列I的第109-1548位)存在于整個序列I所示的ORF中，其中序列I的第1-108位以及序列I的第1549-1575位為pET28a載體上的自帶序列。整個序列I所表達的蛋白為序列表中序列2所示的蛋白(記為“蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C”)。在重組表達載體pET28a_9C中，啟動所述N_Cry9C基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為17啟動子。

二、蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的原核表達、純化及鑒定1、蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的原核表達a)將步驟一得到的重組表達載體pET28a_9C轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(天根生化科技(北京)有限公司)中作為實驗組，同時設(shè)置轉(zhuǎn)入空載體pET28a的大腸桿菌BL21 (DE3)作為對照組。將實驗組和對照組分別于含有50 u g/mL Kan的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)16h，得到培養(yǎng)物。b)將步驟a)所得培養(yǎng)物按1%的體積接入到含50 U g/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2-3小時至菌液0D600值在0.6-0.8之間，得到培養(yǎng)液。c)向步驟b)所得培養(yǎng)液中加入IPTG至其終濃度為lmM，25°C震搖培養(yǎng)9小時，其轉(zhuǎn)速為120rpm,搖床旋轉(zhuǎn)半徑為1.5cm。d)將步驟c)所得產(chǎn)物4°C，IOOOOg離心20min，收集菌體。e)向菌體中加入BugBuster Master Mix(MERCK公司，產(chǎn)品目錄號為71456-3),用量為Img菌體:5ml BugBuster Master Mix。室溫下用吸打或溫和潤旋使BugBuster MasterMix與菌體混勻，50-100rpm振蕩培養(yǎng)20min，得到裂解液。f)將步驟e)所得裂解液以4°C,16000g離心20min。一方面,收集上清；另一方面，收集沉淀(包涵體)，向沉淀中加入BugBuster Master Mix后充分潤旋(Img沉淀對應(yīng)5ml裂解液)，4°C、12000g離心20min后傾去上清，向沉淀中加入之前所加BugBuster Master Mix體積6倍的用去離子水稀釋10倍的BugBuster Master Mix稀釋液,充分潤旋后4°C、5000g離心15min后傾去上清；再向沉淀中加入之前所加BugBuster Master Mix體積3倍的用去離子水稀釋10倍的BugBuster Master Mix稀釋液，充分潤旋后4°C、5000g離心15min后傾去上清,重復(fù)2次后4°C、16000g離心15min，傾去上清得到高純度包涵體；向包涵體中加入包涵體溶解液(0.05M CAPS緩沖液，含0.3% (0.3g/100mL) N-十二烷基肌胺酸鈉；10mg包涵體對應(yīng)Iml包涵體溶解液),輕緩重懸包涵體，4°C溶解過夜；4°C、12000g離心20min后吸取上清，得到包涵體溶解液。將步驟f )所得上清以及包涵體溶解液分別進行SDS-PAGE電泳檢測；SDS_PAGE方法參照張龍翔等所著《生化實驗方法和技術(shù)》第二版，高等教育出版社(2006)，第100-106頁。采用5%濃縮膠，電壓50V。分離膠采用12%膠濃度，電壓100V。上樣量為lOiil。結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，與轉(zhuǎn)入pET28a空載體的對照組相比，轉(zhuǎn)入步驟一得到的重組表達載體pET28a-9C的實驗組在大小約為58KD的位置有目的條帶出現(xiàn)，與理論上根據(jù)氨基酸序列計算的目的蛋白分子量大小一致。另外，從結(jié)果中還可以看出，在ImMIPTG，25°C誘導9小時的條件下，蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C主要表達在包涵體中。2、蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的純化上述步驟I中f )所收集的包涵體溶解液即為粗提的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C,使用BugBuster N1-NTA His Bind純化試劑盒(購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為70751-3)和BugBuster His*Bind純化試劑盒(購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為70899-3)對其進行純化，獲得純化后的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C。純化過程中，采用BugBuster N1-NTA His Bind試劑盒提供的樹脂，采用BugBuster His*Bind純化試劑盒提供的純化緩沖液。純化的具體操作按BugBuster His^Bind純化試劑盒提供的說明書進行。3、蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的鑒定(I)測序驗證對步驟2所得 純化后的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt CryQC進行N端測序，結(jié)果證實其序列與序列2相符，證實了序列的正確性。(2) SDS-PAGE 鑒定采用SDS-PAGE對步驟2所得純化后的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的純化結(jié)果進行驗證。以純化前粗提的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C為對照。SDS-PAGE方法參照張龍翔等所著《生化實驗方法和技術(shù)》第二版，高等教育出版社(2006)，第100-106頁。采用5%濃縮膠，電壓50V。分離膠采用12%膠濃度，電壓100V。上樣量為6 u 10SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，與純化前相比，純化后的蛋白目的條帶單一，有效的去除了雜蛋白。4、蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的產(chǎn)量檢測采用BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit,購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為71285-3)對步驟2所得純化后的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C進行濃度測定，進而得到蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的總產(chǎn)量。濃度測定具體操作參見試劑盒說明書進行。蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的產(chǎn)量測定實驗共設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取三次重復(fù)的平均值。結(jié)果表明蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的產(chǎn)量為0.0268mg蛋白/g菌體，其中“菌體”為經(jīng)IPTG誘導表達培養(yǎng)后所收集的菌體沉淀。實施例3、實施例2得到的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的活性測定
取實施例2中純化得到的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C，用0.1% (體積t匕)Triton-100水溶液稀釋，配成5個稀釋度的稀釋液，同時以0.1% (體積比)Triton水溶液作對照，將稍小于培養(yǎng)皿底部的潔凈水稻莖段浸入稀釋液10秒鐘后自然晾干，莖段切片放入底部鋪有經(jīng)水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿接入10頭第一齡水稻三化螟(Scirpophagaincertulas (Walker)),室溫條件下培養(yǎng)。72小時后統(tǒng)計水稻三化螟幼蟲的死亡情況(用筆輕觸幼蟲，若其頭部不能擺動，不能向前爬動則視為死亡)，并據(jù)此利用POLO軟件計算實施例2得到的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C對水稻三化螟幼蟲的LC50值(半數(shù)致死濃度，表示殺死50%水稻三化螟幼蟲的蛋白濃度)。每個濃度設(shè)置4個重復(fù)處理組，結(jié)果取平均值。結(jié)果表明，實施例2得到的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C對水稻三化螟幼蟲的LC50值為83.42 mg/L。
權(quán)利要求
1.DNA分子，為如下a) -c)中任一: a)序列表中序列I的第109-1548位核苷酸所示的DNA分子； b)序列表中序列I所不的DNA分子； c)與a)或b)所限定的DNA分子至少具有98%的同一性，且編碼序列2或序列2的第37-516位氨基酸所示蛋白質(zhì)的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達載體中啟動所述DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動子為T7啟動子； 所述重組表達載體具體為將所述DNA分子插入到質(zhì)粒pET28a的多克隆位點處得到的重組質(zhì)粒。
5.由權(quán)利要求1所述DNA分子轉(zhuǎn)錄所得的RNA分子。
6.蛋白質(zhì)，為如下I)或II): I)序列表中序列2的第37-516位氨基酸組成的蛋白質(zhì)； II)序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1所 述的DNA分子，或權(quán)利要求2-4中任一所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌，或權(quán)利要求5所述的RNA分子，或權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)在制備具有殺蟲活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述DNA分子在提高大腸桿菌中蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白BtCry9C表達量中的應(yīng)用；所述蘇z 金芽抱桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C為序列表中序列2所不蛋白質(zhì)。
9.一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C的制備方法,包括如下步驟: 1)將權(quán)利要求2-4中任一所述的重組載體導入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌； 2)培養(yǎng)所述重組大腸桿菌，進行誘導表達，收集并裂解菌體，獲得蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C ； 所述蘇z 金芽抱桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C為序列表中序列2所不蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述誘導表達為:向培養(yǎng)有所述重組大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為lmM，30°C震搖培養(yǎng)9小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的制備方法。該方法涉及一種經(jīng)過密碼子優(yōu)化的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C的基因，具體如序列表中序列1所示。本發(fā)明所提供的蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的制備方法，包括如下步驟1)將含有序列1的第109-1548位或整個序列1所示DNA片段的重組載體導入大腸桿菌，得到重組大腸桿菌；2)培養(yǎng)所述重組大腸桿菌，進行誘導表達，收集并裂解菌體，獲得蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白Bt Cry9C(序列2)。在大腸桿菌中，本發(fā)明所提供的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry9C基因(N-Cry9C基因)表達所得蛋白并未因密碼子優(yōu)化而影響其蛋白活性。
文檔編號C12N15/62GK103233022SQ20131013384
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者王保民, 何麗珊, 張瑞, 譚桂玉, 曹振, 張亮, 郭素琴, 張威 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學