專利名稱：：抗微生物多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有編碼這些多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，包含該核酸構(gòu)建體的載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用這些多肽的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，在抗微生物劑的種類顯著增加的同時，具有抗性的病原微生物也同步增力口?，F(xiàn)在已認(rèn)識到所有臨床上可得的抗微生物劑都有抗性存在。迄今為止，醫(yī)學(xué)界對抗微生物劑抗藥性的應(yīng)對手段是使用對抗性藥細(xì)菌尚未使用過的新的或者替代性的抗生素。這就需要持續(xù)開發(fā)新的抗生素，或者作為現(xiàn)有化合物的變體，或者作為多種化合物的組合，它們可以抑制或者繞開細(xì)菌的抗性藥機制。本發(fā)明的一個目的是提供具有改善的抗微生物活性的新多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一個目的是提供新的抗微生物多肽，其可能具有降低的溶血活性和/或降低的細(xì)胞毒性。這些多肽還可能顯示對例如Ca2+、Mg2+和Na+等陽離子的降低的敏感性。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個方面中涉及具有抗微生物活性的多肽，其對應(yīng)于SEQIDN0:2所列出的氨基酸序列:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Xi6-Xi7;其中X1=N,F，I，W，M，S，A,T，Y，V，H，L，C，K或G;X2=L，I，F(xiàn)或W;X3=R,I,F,L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;X4=R或C;X5=I,L，W，M，V或F;X6=I,L或W;X7=R,L，T或C;X8=K,V,F，L,C，Y,I，R，N或W;X9=G,C，Y,L，F(xiàn)，W或V;X10=I,W，F(xiàn)或R;X11=H,K,C，A,S，I,N,L或Q;X12=I,L,F或V;X13=I,L,F1T或V;X14=K,I,S,L或R;X15=K,R或I;X16=Y,I,L,F或K;X17=G,I，S，L,R,F，T，C或V;且其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%且少于100%的同一'I"生。本發(fā)明的另一個方面中涉及具有編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的另一個方面中涉及核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，其可操作地連接于一種或多種指導(dǎo)所述多肽在合適的宿主中產(chǎn)生的控制序列。本發(fā)明的另一個方面中涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個方面中涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個方面中涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括:(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；及(b)回收該多肽。本發(fā)明的其它方面可以通過下面的詳述和所附權(quán)利要求而得以明示。具體地，本發(fā)明涉及如下各項:1.具有抗微生物活性的多肽，包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Xi6-Xi7;其中X1=N,F，I，W，M,S，A,T,Y,V，H，L，C，K或G;優(yōu)選X1=S,T，V，Y，W，I，G，F(xiàn)或L;X2=L,I,F或W;優(yōu)選X2=W或I;X3=R,I,F,L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X3=F,I，V或L;X4=R或C;X5=I,L,W，M,V或F;優(yōu)選X5=L或I;X6=I,L或W;優(yōu)選X6=I;X7=R,L,T或C;X8=K,V，F(xiàn)，L，C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X8=Y,F，W，V或L;X9=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X9=G或F;X10=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X10=W或I;X11=H,K，C，A，S，I，N，L或Q;優(yōu)選X11=I,S或K;X12=I,L,F或V;優(yōu)選X12=L;X13=I,L,F，T或V;優(yōu)選X13=L;X14=K,I，S，L或R;優(yōu)選X14=I,R或L;X15=K,R或I;X16=Y,I,L,F或K;優(yōu)選X16=L;X17=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X17=I,F或L;其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%的同一性而少于100%的同一性。2.具有抗微生物活性的多肽，包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列:K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Xi6;其中X1=L,I,F或W;優(yōu)選X1=W或I;X2=R,I,F,L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X2=F,I，V或L;X3=R或C;X4=I,L,W，M,V或F;優(yōu)選X4=L或I;X5=I,L或W;優(yōu)選X5=I;X6=R,L,T或C;X7=K,V，F(xiàn)，L，C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X7=Y,F，W，V或L;X8=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X8=G或F;X9=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X9=W或I;X10=H,K，C，A，S，I，N，L或Q;優(yōu)選X10=I,S或K;X11=I,L，F(xiàn)或V;優(yōu)選X11=L;X12=I,L，F(xiàn)，T或V;優(yōu)選X12=L;X13=K,I，S，L或R;優(yōu)選X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I,L,F或K;優(yōu)選X15=L;X16=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X16=I,F或L;其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一性。3.具有抗微生物活性的多肽，包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-Xi6;其中X1=N,F，I，W，M,S，A,T,Y,V，H，L，C，K或G;優(yōu)選X1=S,T，V，Y，W，I，G，F(xiàn)或L;X2=L,I,F或W;優(yōu)選X2=W或I;X3=R,I,F,L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X3=F,I，V或L;X4=R或C;X5=I,L，W，M，V或F;優(yōu)選X5=L或I;X6=I,L或W;優(yōu)選X6=I;X7=R,L,T或C;X8=K,V,F，L,C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X8=Y,F，W，V或L;X9=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X9=G或F;X10=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X10=W或I;X11=I,L,F或V;優(yōu)選X11=L;X12=I,L,F，T或V;優(yōu)選X12=L;X13=K,I，S，L或R;優(yōu)選X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I,L,F或K;優(yōu)選X15=L;X16=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X16=I,F或L;其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一性。4.項1-3任一項的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有至少60%的同一性，優(yōu)選與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有至少65%的同一性，至少70%的同一性，至少75%的同一性，或至少80%的同一性。5.項1-4任一項的多肽，包含SEQIDN0:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸序列。6.項1-4任一項的多肽，由SEQIDNO:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸序列組成。7.多核苷酸,其具有編碼項1-6的任一項所定義的多肽的核苷酸序列。8.核酸構(gòu)建體，包含項7中定義的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到一種或多種指導(dǎo)所述多肽在合適的宿主中生產(chǎn)的控制序列。9.包含項8中所定義的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。10.包含項8中所定義的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。11.生產(chǎn)如項1-6的任一項所定義的多肽的方法，該方法包括:(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)項10所定義的重組宿主細(xì)胞；及(b)回收該多肽。12.包含如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽的組合物。13.項12的組合物，其還包含附加的殺生物劑。14.殺死微生物細(xì)胞或抑制其生長的方法，包括將微生物細(xì)胞與如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽相接觸。15.去污劑組合物，包含表面活性劑和如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽。16.如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽，其用作藥物。17.如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽，其用作獸用或人用抗微生物治療劑或預(yù)防劑。18.如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽在制備用于治療微生物感染或預(yù)防用途的獸用或人用治療劑中的用途。19.如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽用于殺死微生物細(xì)胞或抑制其生長的用途。20.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼如項1-6的任一項所定義的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化。21.至少一種如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽在動物飼料中的用途。22.至少一種如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽在制備用于動物飼料的組合物中的用途。23.動物飼料添加劑，包含:(a)至少一種如項1-6的任一項所定義的抗微生物多肽，和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(C)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或(e)至少一種大量礦物質(zhì)。24.項23的動物飼料添加劑，還包含肌醇六磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶和/或葡聚糖酶。25.動物飼料組合物，具有50_800g/kg的粗蛋白含量，并包含至少一種如項1_6的任一項所定義的抗微生物多肽。定義在進(jìn)一步詳細(xì)討論本發(fā)明之前，首先定義下面的術(shù)語和約定:抗微生物活性:術(shù)語“抗微生物活性”在本文中定義為能夠殺死微生物細(xì)胞或者抑制其生長的活性。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“抗微生物的”(antimicrobial)意指存在殺細(xì)菌(bactericidal)和/或抑細(xì)菌(bacteriostatic)和/或殺真菌(fungicidal)和/或抑真菌(fungistatic)和/或殺病毒(virucidal)的作用,其中術(shù)語“殺細(xì)菌的”應(yīng)理解為能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語“抑細(xì)菌的”應(yīng)理解為能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞生長，即抑制生長中的細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語“殺真菌的”應(yīng)理解為能夠殺死真菌細(xì)胞。術(shù)語“抑真菌的”應(yīng)理解為能夠抑制真菌的生長，即抑制生長中的真菌細(xì)胞。術(shù)語“殺病毒的”應(yīng)理解為能夠滅活病毒。術(shù)語“微生物細(xì)胞”指細(xì)菌或真菌細(xì)胞(包括酵母)。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“抑制微生物細(xì)胞的生長”意指所述細(xì)胞在非生長狀態(tài)，即它們不能增殖。對本發(fā)明而言，抗微生物活性可以根據(jù)Lehrer等，JournalofImmunologicalMethods,Vol.137(2)pp.167-174(1991)所描述的方法來測定。具有抗微生物活性的多肽可能具有下面的能力:在20°C下，在所述具有抗微生物活性的多肽的25%(w/w)水溶液，優(yōu)選10%(w/w)水溶液，更優(yōu)選5%(w/w)水溶液，更優(yōu)選l%(w/w)水溶液，最優(yōu)選0.5%(w/w)水溶液，特別是0.l%(w/w)水溶液中，溫育8小時后(優(yōu)選4小時后，更優(yōu)選2小時后，最優(yōu)選I小時后，特別是30分鐘后)，將大腸桿菌(Escherichiacoli)(DSM1576)活細(xì)胞的數(shù)目降低到1/100。具有抗微生物活性的多肽還可能具有下面的能力:當(dāng)其以IOOOppm的濃度，優(yōu)選以500ppm的濃度，更優(yōu)選以250ppm的濃度，更優(yōu)選以IOOppm的濃度，更優(yōu)選以50ppm的濃度，特別是以25ppm的濃度加入時，在25°C下的微生物生長底物中，可抑制大腸桿菌(DSM1576)的長出(outgrowth)24小時。具有抗微生物活性的多肽還可能具有下面的能力:在20°C下，在具有抗微生物活性的多肽的25%(w/w)水溶液，優(yōu)選10%(w/w)水溶液，更優(yōu)選5%(w/w)水溶液，更優(yōu)選l%(w/w)水溶液，最優(yōu)選0.5%(w/w)水溶液，特別是0.l%(w/w)水溶液中，溫育8小時后(優(yōu)選4小時后，更優(yōu)選2小時后，最優(yōu)選I小時后，特別是30分鐘后)，將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(ATCC6633)活細(xì)胞的數(shù)目降低到1/100。具有抗微生物活性的多肽還可能具有下面的能力:當(dāng)其以IOOOppm的濃度，優(yōu)選以500ppm的濃度，更優(yōu)選以250ppm的濃度，更優(yōu)選以IOOppm的濃度，更優(yōu)選以50ppm的濃度，特別是以25ppm的濃度加入時，在25°C下的微生物生長底物中，可抑制枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的長出24小時。本發(fā)明的多肽應(yīng)優(yōu)選地具有由SEQIDN0:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18的所示的氨基酸序列所構(gòu)成的多肽的至少20%的抗微生物活性。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，該多肽應(yīng)具有由SEQIDN0:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18的所示的氨基酸序列所構(gòu)成的多肽的至少40%，例如至少50%，優(yōu)選至少60%，例如至少70%，更優(yōu)選至少80%，例如至少90%，最優(yōu)選至少95%，例如大約或至少100%的抗微生物活性。同一性:在本文的語境中，兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列之間的同源性以參數(shù)“同一'I"生”來描述。對本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是利用FASTA程序包2.0x版本中包含的FASTA程序來確定的(參考W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448;及W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA^,MethodsinEnzymologyl83:63-98)。所用的評分矩陣(scoringmatrix)是BL0SUM50,缺口罰分(gappenalty)為-12,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)為-2。兩個核苷酸序列之間的同一性程度是利用同上所述的算法和程序包來確定的。所用的評分矩陣(scoringmatrix)是同一性矩陣(identitymatrix),缺口罰分為-16,缺口延伸罰分為_4。片段:用于本文時，如SEQIDN0:5至SEQIDNO:114的任一序列所示的氨基酸序列的“片段”是指這些多肽的子序列，其中從氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個氨基酸。優(yōu)選地，所述一個或多個氨基酸是從羧基末端缺失的。等位變體:在本文的上下文中，術(shù)語“等位變體”(alIeIicvariant)指基因的占據(jù)同一染色體座位的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變異由突變而自然產(chǎn)生，并可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛赡苁浅聊?被編碼的多肽不發(fā)生變化)或者可能編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是被基因的等位變體所編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪塑账?術(shù)語“基本上純的多核苷酸”在本文中指多核苷酸的制備物，其中多核苷酸已從其天然遺傳環(huán)境分離，因此不含其它外來的或不需要的編碼序列，而且具有適合在基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有以重量計最多10%的與其天然伴隨的其它多核苷酸物質(zhì)(優(yōu)選更低百分比的其它多核苷酸物質(zhì)，例如最多8%重量，最多6%重量，最多5%重量，最多4%重量，最多3%重量，最多2%重量，最多1%重量，和最多1/2%重量)。但是，基本上純的多核苷酸還可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子或終止子。優(yōu)選地，該基本上純的多核苷酸是至少92%純的，即該多核苷酸構(gòu)成制備物中存在的多核苷酸物質(zhì)的至少92%重量，優(yōu)選更高的百分比，例如至少94%純，至少95%純，至少96%純，至少96%純，至少97%純，至少98%純，至少99%純，和至多99.5%純。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地為基本上(substantially)純的形式。具體地，本文公開的多核苷酸優(yōu)選為“實質(zhì)上(essentially)純的形式”，即，該多核苷酸的制備物實質(zhì)上不含有與其天然相伴隨的其他多核苷酸物質(zhì)。本文中，術(shù)語“基本上純的多核苷酸”與術(shù)語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”同義?；@飾:本發(fā)明的語境中，術(shù)語“修飾”意指由SEQIDN0:2到SEQIDN0:114的任一序列的氨基酸I到18所示的氨基酸序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼這些多肽的DNA的遺傳操作。修飾可以是在氨基酸序列中氨基酸側(cè)鏈的置換，目標(biāo)氨基酸中或目標(biāo)氨基酸處的取代、缺失和/或插入；或者使用具有相似特征的非天然氨基酸。具體地，修飾可以是酰胺化，例如C-末端的酰胺化。CDNA:術(shù)語“CDNA”在本文的語境中使用時，涵蓋可以從來自真核細(xì)胞的成熟的、經(jīng)過剪接的mRNA分子通過逆轉(zhuǎn)錄而制備得到的DNA分子。cDNA缺少相應(yīng)的基因組DNA中通常存在的內(nèi)含子序列。初始的初級RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，它經(jīng)過一系列的加工事件后，作為成熟的、經(jīng)剪接的mRNA出現(xiàn)。上述事件包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。當(dāng)cDNA來源于mRNA時,其因此缺少內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體:本文中使用的術(shù)語“核酸構(gòu)建體”指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或者該核酸分子已受到修飾使得其以自然界中本來不存在(nototherwise)的方式含有核酸的片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需要的控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”和術(shù)語“表達(dá)盒”是同義的。控制序列:術(shù)語“控制序列”在這里定義為包括所有對于本發(fā)明的多肽的表達(dá)而言是必需的或者有利的組分。每一調(diào)控序列對于編碼該多肽的多核苷酸可以是天然的或者外來的。這些控制序列包括但不限于，前導(dǎo)序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。調(diào)控序列至少包括啟動子及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。這些調(diào)控序列還可以被提供接頭(linkers)，用于導(dǎo)入特定的限制性位點以便于將該控制序列和編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)域連接起來?？刹僮鞯剡B接(operablylinked):術(shù)語“可操作地連接”指這樣一種構(gòu)型,其中控制序列被置于相對DNA序列的編碼序列的合適位置上，使得該控制序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。編碼序列:本文中使用術(shù)語“編碼序列”時，意在涵蓋這樣的核苷酸序列，其直接指定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般是由開放閱讀框確定的，開放閱讀框一般從起始密碼子ATG開始。編碼序列通常包含DNA、cDNA和重組核苷酸序列。表達(dá):在本文的語境中，術(shù)語“表達(dá)”包括所述多肽的生產(chǎn)中涉及的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯和翻譯后修飾。優(yōu)選地，表達(dá)還包括多肽的分泌。表汰載體:在本文的語境中，術(shù)語“表達(dá)載體”涵蓋線性或者環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明的多肽的片段，且可操作地連接到為其轉(zhuǎn)錄提供條件的其他片段。宿主細(xì)胞:本文使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括易于用核酸構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞種類。術(shù)語“多核苷酸探針”、“雜交”及各種嚴(yán)緊度條件將在“具有抗微生物活性的多肽”一節(jié)定義。發(fā)明詳述具有抗微生物活性的多肽在第一個方面中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，其中該多肽包含并優(yōu)選地由SEQIDNO:2所列出的氨基酸序列組成:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17;其中X1=N1F,I，W，M，S，A，T，Y，V，H，L，C，K或G;優(yōu)選X1=S,T，V，Y，W，I，G，F(xiàn)或L;X2=L,I，F(xiàn)或W;優(yōu)選X2=W或I;X3=R,I,F，L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X3=F,I，V或LiX4=R或C;X5=I，L，W，M，V或F;優(yōu)選X5=L或I;X6=I1L,W^Y;優(yōu)選X6=I;X7=R,L1T或C;X8=K,V,F，L,C，Y,I，R，N或W;優(yōu)選X8=Y,F，W，V或L;X9=G,C，Y,L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X9=G或F;X10=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X10=W或I;X11=H,K，C，A，F(xiàn)，S，I，N，L或Q;優(yōu)選X11=I,S或K;X12=I,L,F或V;優(yōu)選X12=L;X13=I，L，F(xiàn)，T或V;優(yōu)選X13=L;X14=K,I，S，L*R;優(yōu)選X14=I,R或L;X15=K,R,I或G;X16=Y,I，L，F(xiàn)或K;優(yōu)選X16=L;X17=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X17=I,F或L;其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有多于55%而少于100%的同一性。在一個實施方式中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸序列相比有1，2，3，4，5，6，7或8個(優(yōu)選1，2，3，4，5或6個；更優(yōu)選1，2，3，4或5個；更優(yōu)選1，2，3或4個；更優(yōu)選1，2或3個，最優(yōu)選I或2個)氨基酸的不同。在第二個方面中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，其中該多肽包含并優(yōu)選地由SEQIDNO:3所列出的氨基酸序列組成:K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11-X12-X13-X14-X15-X16;其中X1=L,I，F(xiàn)或W;優(yōu)選X1=W或I;X2=R,I,F，L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X2=F,I，V或L;X3=R或C;X4=I,L，W，M，V或F;優(yōu)選X4=L或I;X5=I,L或W;優(yōu)選X5=I;X6=R,L,T或C;X7=K,V，F(xiàn)，L，C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X7=Y,F，W，V或L;X8=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X8=G或F;X9=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X9=W或I;X10=H,K，C，A，S，I，N，L或Q;優(yōu)選X10=I,S或K;X11=I,L，F(xiàn)或V;優(yōu)選X11=L;X12=I,L，F(xiàn)，T或V;優(yōu)選X12=L;X13=K,I，S，L*R;優(yōu)選X13=I,R或L;X14=K,R或I；X15=Y,I，L，F(xiàn)或K;優(yōu)選X15=L;X16=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X16=I,F或L;且其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有多于55%而少于90%的同一性。在一個實施方式中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸序列相比有2，3，4，5，6，7或8個(優(yōu)選2，3，4，5或6個；更優(yōu)選2，3，4或5個；更優(yōu)選2，3或4個；更優(yōu)選2或3個，最優(yōu)選2個)氨基酸的不同。在第三個方面中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，其中該多肽包含并優(yōu)選地由SEQIDNO:4所列出的氨基酸序列組成:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-Xie；其中X1=N1F,I，W，M，S，A，T，Y，V，H，L，C，K或G;優(yōu)選X1=S,T，V，Y，W，I，G，F(xiàn)或L;X2=L,I，F(xiàn)或W;優(yōu)選X2=W或I;X3=R,I,F，L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X3=F,I,V或L;X4=R或C;X5=I，L，W，M，V或F;優(yōu)選X5=L或I;X6=I，L或W;優(yōu)選X6=I;X7=R,L，T或C;X8=K,V,F，L,C，Y,I，R，N或W;優(yōu)選X8=Y,F，W，V或L;X9=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X9=G或F;X10=I，W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X10=W或I;Xn=I，L，F(xiàn)或V;優(yōu)選X11=L;X12=I,L,F1T或V;優(yōu)選X12=L;X13=K,I，S，L或R;優(yōu)選X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I,L,F或K;優(yōu)選X15=L;X16=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X16=I,F或L;其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有多于55%而少于90%的同一'丨生。在一個實施方式中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸序列相比有2，3，4，5，6，7或8個(優(yōu)選2，3，4，5或6個；更優(yōu)選2，3，4或5個；更優(yōu)選2，3或4個；更優(yōu)選2或3個，最優(yōu)選2個)氨基酸的不同。在一個實施方式中，本發(fā)明的多肽與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有至少60%的同一性，優(yōu)選與至少65%的同一性，至少70%的同一性，至少75%的同一性，和至少80%的同一I"生。在另一個實施方式中，所述多肽包含并優(yōu)選地由SEQIDN0:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18組成。術(shù)語:“SEQIDN0:5到SEQIDNO:114的任一序列”是指:SEQIDNO:5,SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24，SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48,SEQIDNO:49,SEQIDNO:50,SEQIDNO:51,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,SEQIDNO:54，SEQIDNO:55，SEQIDNO:56，SEQIDNO:57，SEQIDNO:58，SEQIDNO:59，SEQIDNO:60,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69,SEQIDNO:70,SEQIDNO:71,SEQIDNO:72，SEQIDNO:73，SEQIDNO:74，SEQIDNO:75，SEQIDNO:76，SEQIDNO:77，SEQIDNO:78,SEQIDNO:79,SEQIDNO:80,SEQIDNO:81,SEQIDNO:82,SEQIDNO:83,SEQIDNO:84，SEQIDNO:85，SEQIDNO:86,SEQIDNO:87,SEQIDNO:88,SEQIDNO:89,SEQIDNO:90,SEQIDNO:91,SEQIDNO:92,SEQIDNO:93,SEQIDNO:94,SEQIDNO:95,SEQIDNO:96，SEQIDNO:97，SEQIDNO:98，SEQIDNO:99，SEQIDNO:100,SEQIDNO:101,SEQIDNO:102,SEQIDNO:103,SEQIDNO:104,SEQIDNO:105,SEQIDNO:106,SEQIDNO:107,SEQIDNO:108,SEQIDNO:109,SEQIDNO:110,SEQIDNO:111,SEQIDNO:112，SEQIDNO:113，或SEQIDNO:114。在一個令人感興趣的實施方式中，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18具有最多5個氨基酸(例如5個氨基酸)的不同，例如最多4個氨基酸(例如4個氨基酸)，例如最多3個氨基酸(例如3個氨基酸)，特別是最多2個氨基酸(例如2個氨基酸)，例如最多I個氨基酸的不同。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包括SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸序列；或其具有抗微生物活性的片段。術(shù)語“SEQIDNO:2到SEQIDNO:114的任一序列”是指SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，或SEQIDNO:5到SEQIDNO:114的任一序列。組成本發(fā)明的多肽的氨基酸可以獨立地選自D或L型。本發(fā)明的多肽可以是人工變體，其包括并優(yōu)選由這樣的氨基酸序列組成:該氨基酸序列與SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18相比，具有最多3個，例如最多2個，如最多I個氨基酸的置換、缺失和/或插入。這樣的人工變體可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來構(gòu)建，例如通過對包含SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18所示的氨基酸序列的多肽進(jìn)行定點/隨機誘變。在本發(fā)明的一個實施方式中，氨基酸改變從性質(zhì)而言是微小的，即其是:不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性的氨基酸置換；小的缺失，通常為I到大約5個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；長達(dá)大約10-25個殘基的小接頭肽；或改變凈電荷或另一功能，從而有助于純化的小段延伸，諸如多組氨酸序列段(poly-histidinetract)、抗原性表位、或結(jié)合域。保守性置換的例子在下面各組內(nèi):堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸)。一般不改變特異活性的氨基酸置換是本領(lǐng)域已知的，例如H.Neurath和R.L.Hill在TheProteins中所述(1979,AcademicPress,NewYork)。最常發(fā)生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly,以及上述反向的置換。在一個令人感興趣的實施方式中，所述氨基酸改變具有改變多肽的物理化學(xué)特性的性質(zhì)。例如，氨基酸改變可提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳pH等等。在另一個實施方式中，所述氨基酸改變是在SEQIDN0:2到SEQIDN0:114的任一序列的氨基酸I到18所示的氨基酸序列的第一個氨基酸(賴氨酸)之后插入小氨基酸(例如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸或蘇氨酸)。N-末端延伸本發(fā)明的多肽的N-末端延伸可合適地由I到50個氨基酸，優(yōu)選2-20個氨基酸，特別是3-15個氨基酸組成。在一個實施方式中，N-末端肽延伸不含有Arg(R)。在另一個實施方式中，N-末端延伸包含將在下文進(jìn)一步定義的kex2或類kex2切割位點。在一個優(yōu)選的實施方式中，N-末端延伸是包含至少兩個Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸殘基的肽，例如包含下列序列之一的N-末端延伸:EAE,EE,DE和DD。Kex2位點Kex2位點(參見例如MethodsinEnzymologyVol185，D.Goeddel編，AcademicPressInc.(1990),SanDiego,CA,“GeneExpressionTechnology，，)和類Kex2位點是存在于某些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)域和成熟區(qū)域之間的d1-basic的識別位點(即切割位點)。在某些實例中，kex2位點或類kex2位點的插入已被證明可促進(jìn)前肽切割位點處的正確的內(nèi)肽酶加工，從而使蛋白質(zhì)分泌水平提高。在本發(fā)明的條件下，kex2位點或類kex2位點的插入使得在N-末端延伸中的特定位置發(fā)生切割成為可能，從而得到與SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18所示的成熟多肽相比得以延伸的抗微生物多肽。融合多肽本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽被融合到本發(fā)明的多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽可通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)融合來產(chǎn)生。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們處于同一讀碼框中且使得融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制之下。多核苷酸和核苷酸序列本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。具體地，本發(fā)明涉及由編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，對本發(fā)明的每一種多肽可以制備編碼它的數(shù)種核苷酸序列。編碼本發(fā)明的多肽的氨基酸密碼子由哪些核苷酸組成是本領(lǐng)域中眾所周知的。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其編碼SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列所示的氨基酸序列的片段，所述片段具有抗微生物活性。所述多核苷酸的子序列是一個或多個核苷酸已從5’和/或3’末端缺失的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以這樣得到:通過基因工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法將核苷酸序列從一個位置重新置于另一不同位置，在該位置上此核苷酸序列將被復(fù)制?？寺》椒砂ㄇ谐龊头蛛x包含編碼所述多肽的核苷酸序列的所希望片段，將該片段插入載體分子，和將該重組載體納入宿主細(xì)胞，在該細(xì)胞中所述核苷酸序列多個拷貝或克隆將被復(fù)制。所述核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成和合成來源，或上述的任意組合。對編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列進(jìn)行修飾可能是合成這樣的多肽所必需的:該多肽包含這樣的氨基酸序列，其與SEQIDNO:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18相比具有至少一個置換，缺失和/或插入。這樣的人工變體可能以某些經(jīng)過工程改造的方式相異于分離自其天然來源的多肽，例如特異性活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等相異的變體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，這樣的修飾可以在分子功能的關(guān)鍵區(qū)域之外進(jìn)行，而仍然得到活性多肽。有的氨基酸殘基對于由本發(fā)明的核苷酸序列所編碼的多肽的活性來說是至關(guān)重要的，因此優(yōu)選不被修飾例如置換，這樣的氨基酸殘基可根據(jù)本領(lǐng)域的已知程序諸如通過定點誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanningmutagenesis)(例如參見Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定。在后一種技術(shù)中，在分子中每一帶正電荷殘基處引入突變，然后測試所得到的突變分子的抗微生物活性，以鑒定對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可通過三維結(jié)構(gòu)分析來確定，其中三維結(jié)構(gòu)可由諸如核磁共振分析、晶體學(xué)、或光親和標(biāo)記等技術(shù)來測定(例如參見deVos等，1992,Science255:306-312；Smith等，1992,JournalofMolecularBiology224:899-904；fflodaver等，1992，F(xiàn)EBSLetters309:59-64)。另外，編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列還可以通過引入這樣的核苷酸取代來修飾，這些取代不會產(chǎn)生該核苷酸序列所編碼的多肽的另一種氨基酸序列，而是對應(yīng)于要用來生產(chǎn)酶的宿主生物的密碼子用法。利用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行定點誘變，可以將突變導(dǎo)入核苷酸序列中，使一個核苷酸被另一個核苷酸所替換。特別有用的是利用具有目標(biāo)插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個包含所需突變的合成引物的方法。各自與載體的相對鏈互補的寡核苷酸引物借助PfuDNA聚合酶在溫度循環(huán)過程中延伸。摻入引物后，生成包含錯列缺口的突變質(zhì)粒。在溫度循環(huán)后，用對甲基化和半甲基化DNA特異性的DpnI處理產(chǎn)物以消化親代DNA模板并選擇包含突變的合成的DNA。還可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法。關(guān)于核苷酸取代的一般性描述參見，例如，F(xiàn)ord等，1991,ProteinExpressionandPurification〗:95_107。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含可操作性連接到一種或多種控制序列上的本發(fā)明的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述控制序列在與控制序列相容的條件下于合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。可以用多種方式操作編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列以便于所述多肽的表達(dá)。在核苷酸序列插入載體之前對其進(jìn)行操作可以是有利的或必需的，這取決于表達(dá)載體。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動子序列，它是為了核酸序列的表達(dá)而被宿主細(xì)胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變型、截短型或雜合型啟動子，并可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的實例，有從大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核生物的β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)中獲得的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等，1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。還有“Usefulproteinsfromrecombinantbacteria”，ScientificAmerican,1980,242:74-94及Sambrook等，1989,同上中描述的其它啟動子。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的實例有從米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶,和尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787),以及NA2_tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的雜合啟動子)；及其突變的、截短的、和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子是從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所獲得的。其它用于酵母宿主細(xì)胞的有用啟動子在Romanos等，1992，Yeast8:423-488中有描述?？刂菩蛄幸部梢允沁m當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，即由宿主細(xì)胞識別來終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的3’端。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可用于本發(fā)明。優(yōu)選用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得的。優(yōu)選用于酵母宿主細(xì)胞的終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因中獲得的。還有Romanos等，1992，同上中描述的用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用終止子?？刂菩蛄羞€可以是適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列，即對宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’端。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。優(yōu)選地用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因中獲得的。優(yōu)選地用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因中獲得的?？刂菩蛄羞€可以是聚腺苷酸化序列，即可操作連接于核苷酸序列3’端的序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時可由宿主細(xì)胞識別為將聚腺苷殘基添加到轉(zhuǎn)錄的mRNA上的信號。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。優(yōu)選地用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖昔酶的基因獲得的。Guo和Sherman等，1995,MolecularCellularBiologyl5:5983-5990中描述了對酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列?？刂菩蛄羞€可以是信號肽編碼區(qū)，它編碼的氨基酸序列連接于多肽的氨基末端并指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’端可固有的包含信號肽編碼區(qū)，它在翻譯讀碼框中與編碼分泌多肽的編碼區(qū)段天然連接?；蛘撸幋a序列的5’端可以包含對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。如果編碼序列天然不含信號肽編碼區(qū)，則可能需要外來的信號肽編碼區(qū)?；蛘撸赡軆H由外來的信號肽編碼區(qū)替換天然信號肽編碼區(qū)以便增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選擇宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)有從芽孢桿菌NCIB11837的生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌的β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶類(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌的prsA基因獲得的信號妝編碼區(qū)。還有Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57=109-137中描述的其它信號肽。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicolainsolens纖維素酶和柔毛腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得的。Romanos等，1992，同上中描述了的其它有用的信號肽編碼區(qū)?？刂菩蛄羞€可以是前肽(prop印tide)編碼區(qū)，它編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有時候稱作酶原(zymogen))。多肽原一般是沒有活性的，且可通過前肽的催化或自催化切割從多肽原轉(zhuǎn)變成成熟有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(W095/33836)的基因獲得。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)與多肽氨基末端相鄰，而信號肽區(qū)于前肽區(qū)的氨基末端相鄰。還可能需要加上調(diào)節(jié)序列以使多肽的表達(dá)可以相對于宿主細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是能響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而引起基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉的那些。在原核系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的調(diào)節(jié)序列。在真核系統(tǒng)中，這些包括在氨甲喋呤存在時擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及有重金屬存在時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體?？梢詫⑸鲜龅母鞣N核苷酸和控制序列連接到一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，此重組表達(dá)載體可包括一個或多個便利的限制性位點使得在這些位點可插入或替換編碼多肽的核苷酸序列?；蛘?，可將核苷酸序列或含有序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。構(gòu)建表達(dá)載體時，將編碼序列置于載體中，使編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列可操作的連接。重組表達(dá)載體可以是可方便的接受重組DNA操作并能引起核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常取決于載體與要引入此載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，也就是說載體可以以染色體外實體的形式存在，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復(fù)制的手段。或者，載體可以是這樣的一種載體，它在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，整合到基因組中并與整合的染色體一起復(fù)制。此外，可使用單一載體或質(zhì)粒，或是一起含有待引入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩種或多種載體或質(zhì)粒，或者轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明載體優(yōu)選包含一種或多種選擇標(biāo)記，所述選擇標(biāo)記允許易于選擇轉(zhuǎn)化的的等細(xì)胞。選擇標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物有助于產(chǎn)生殺生物(biocide)或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型變成原養(yǎng)型等等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的實例有來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在絲狀宿主細(xì)胞中使用的選擇標(biāo)記包括但不限于:amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)、hpgB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(sulfateadenyltransferase))、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)及其等價物。優(yōu)選用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有這樣的元件，其允許載體向宿主細(xì)胞基因組中的穩(wěn)定整合或載體在細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞基因組的自主復(fù)制。對于向宿主細(xì)胞基因組中的整合而言，載體可依賴編碼多肽的核苷酸序列，或用于通過同源或非同源重組使載體穩(wěn)定地整合到基因組中的載體的任何其它元件?；蛘撸d體可以含有額外的核苷酸序列用于引導(dǎo)通過同源重組向宿主細(xì)胞基因組中整合。所述額外的核苷酸序列使載體能在染色體的精確位置整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件優(yōu)選地應(yīng)含有足夠數(shù)量的核苷酸，如100-1，500個堿基對，優(yōu)選地400-1，500個堿基對，最優(yōu)選地800-1，500個堿基對，這些核苷酸與相應(yīng)靶序列高度同源，以增加同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。對于自主復(fù)制而言，載體還可以包含使載體能在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。細(xì)菌復(fù)制起點的實例有:允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和PACYC184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點的實例有2微米(micro)復(fù)制起點、ARS1、ARS4、ARSl與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起點可以具有突變，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)的作用成為溫度敏感型的(見，例如，Ehrlich,1978,ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesUSA75:1433)?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的核苷酸序列插入宿主細(xì)胞中以提高該基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。通過將核苷酸序列的至少一個額外拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中，或者將核酸序列包含有可擴增的選擇性標(biāo)記基因，通過在合適的選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，能篩選出含有擴增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而也就含有所述核酸序列的更多拷貝的細(xì)胞，由此可以獲得核苷酸序列拷貝數(shù)的增加。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(例如參見Sambrook等，1989,同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，其有利地用于所述多肽的重組生產(chǎn)。將含有本發(fā)明的核苷酸序列的載體引入宿主細(xì)胞，以使載體作為染色體整合體或作為自我復(fù)制的染色體外載體而維持，如前述那樣。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。有用的單細(xì)胞微生物有細(xì)菌細(xì)胞，諸如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、Bacillusclausi1、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis);或鏈霉菌屬(Streptomyces)細(xì)胞，例如淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)和鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus),或者革蘭氏陰性細(xì)菌,諸如大腸桿菌和假單胞菌菌種(Pseudomonassp.)。在一個優(yōu)選的方面,細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草桿菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿的(alkalophilic)芽抱桿菌。將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Chang和Cohen，1979,MolecularGeneralGeneticsl68:111-115)、利用感受態(tài)細(xì)胞(參見例如Young和Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823-829;或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)、電穿孔(參見例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)、或接合(參見例如Koehler和Thorne,1987,JournalofBacteriologyl69:5771-5278)來實現(xiàn)。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，諸如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞?！罢婢痹谟糜诒疚臅r包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等，在《AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi》,第八版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995,同上第171頁中所引用的)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995,同上)。在一種更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在此所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子孢子囊酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽生菌綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變，對于本發(fā)明的目的而言，將如BiologyandActivitiesofYeastSkinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9，1980所述定義酵母。在一個更優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia屬細(xì)胞。在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化糖酵母(Saccharomycesdiastaticus)、Saccharomycesdouglasi1、克魯弗糖酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳克魯維氏酵母(KluyveromycesIactis)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是YarrowiaIipolytica細(xì)胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞門的所有絲狀體(如Hawksworth等，1995，同上中所定義的)。絲狀真菌通常是以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖、及其他復(fù)合多糖組成的菌絲壁為特征。營養(yǎng)生長表現(xiàn)為菌絲伸長，碳代謝是專性需氧的。相反，酵母諸如釀酒酵母的營養(yǎng)生長表現(xiàn)為單細(xì)胞菌體的出芽而碳代謝可以是發(fā)酵性的。在一個更優(yōu)選的實施方式中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Acremonium屬、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢霉菌(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、梭抱殼屬(Thielavia)、Tolypocladium屬或木霉屬(Trichoderma)的細(xì)胞。在一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾谷德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖抱德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、玫瑰色德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、妝色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusariumvenenatum細(xì)胞。在一個進(jìn)一步最優(yōu)選的實施方式中，所述絲狀真菌親本細(xì)胞是Fusariumvenenatum(Nirenbergsp.nov.)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方式中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicolainsolens、柔毛腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichodermaharzianum、康寧木霉(Trichodermakoningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉(Trichodermaviride)細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以以本身已知的方式，通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、和細(xì)胞壁再生的過程進(jìn)行轉(zhuǎn)化。EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述了適合曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。Malardier等，1989，Gene78:147-159和W096/00787中描述了適合轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的方法?？衫肂ecker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.1.編的《GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology》，MethodsinEnzymology,Vol.194,ppl82-187,AcademicPress公司，NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriologyl53:163;及Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所描述的程序轉(zhuǎn)化酵母。生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收該多肽。在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，用本領(lǐng)域中已知的方法在適于多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞，這在合適的培養(yǎng)基中和使多肽能被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行。用本領(lǐng)域中已知的方法，在含有碳源和氮源和無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商得到或根據(jù)公開的組成(例如，于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可直接從培養(yǎng)基中回收該多肽。如果該多肽不被分泌，則可從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收。所述多肽可使用本領(lǐng)域中已知的對該多肽特異性的方法檢測。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，如本文所述可使用酶測定法確定多肽的活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法回收得到的多肽。例如，可以通過常規(guī)方法，包括但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，將多肽從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收出來。本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域中已知的多種方法進(jìn)行純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差異溶解度法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(見，例如，ProteinPurificationJ._C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或者植物細(xì)胞，其被編碼本發(fā)明的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列所轉(zhuǎn)化，從而以可回收的量表達(dá)和生產(chǎn)該生物活性物質(zhì)的。該多肽可以從該植物或植物部分中回收。或者，含有該重組多肽的植物或植物部分本身可以用來提高食品或飼料的質(zhì)量，例如，用來改善營養(yǎng)價值、適口性和流變學(xué)性質(zhì)，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子(antinutritionalfactor)?；厥盏亩嚯?、植物或植物部分還可以用來改善或改變動物或家畜的消化菌群(digestiveflora)。所述轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的例子有:禾本科的，禾草類(grasses),例如早熟禾(bluegrass,Poa);牧草(foragegrass),例如狐茅屬(festuca)和黑麥草屬(1lium);寒地型牧草(temperategrass),例如剪股穎屬(Agrotis);和谷類(cereals),如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱和玉米(maize)(玉米(corn))。雙子葉植物的例子有:煙草；馬鈴薯；甜菜；豆類(legumes)，例如羽扇豆(lupins);豌豆；菜豆(bean)和大豆,和十字花科(Brassicaceae)植物,例如花椰菜、油菜籽(rapeseed)和與之親緣關(guān)系緊密的模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的例子有莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖。另外，特定的植物組織，例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)，都被認(rèn)為是植物部分。另夕卜，任何植物細(xì)胞，無論來自什么組織，都被認(rèn)為是植物部分。這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述表達(dá)本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建。簡單地說，所述植物或植物細(xì)胞這樣構(gòu)建的:將一個或多個編碼本發(fā)明的多肽的表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主的基因組，并使所得的修飾植物或植物細(xì)胞增殖形成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。方便地，所述表達(dá)構(gòu)建體可為核酸構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列、該序列可操作地連接于在所選植物或植物部分中表達(dá)該核苷酸序列所需的合適的調(diào)控序列。另外，該表達(dá)構(gòu)建體還可以包括:可選擇的標(biāo)記，可用于鑒定其中已經(jīng)整合了表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞；以及將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述的植物所需的DNA序列(后者取決于要使用的DNA導(dǎo)入方法)。如啟動子、終止子序列，以及可選的信號或轉(zhuǎn)運序列等調(diào)節(jié)序列的選擇，是根據(jù)例如想要在何時、何處、怎樣表達(dá)該多肽而決定的。例如，編碼本發(fā)明的多肽的基因的表達(dá)可以是組成型或誘導(dǎo)型的，或者可為發(fā)育特異性、階段特異性或組織特異性的，而且基因產(chǎn)物可以被靶向于具體的組織或者植物部分例如種子或葉。對調(diào)節(jié)序列的描述有例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506。對于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV啟動子(Franck等，1980.Cell21:285-294)。器官特異性的啟動子可以是，例如，來自存儲性忙藏組織(storagesinktissues)例如種子、馬鈴薯的塊莖及果實的啟動子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303),或者來自代謝性忙藏組織(metabolicsinktissues),例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878);或者是種子特異性的啟動子，例如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),來自香(Viciafaba)的球蛋白B4和未知的種子蛋白基因的香豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708-711),來自一種種子油體蛋白的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941),來自歐洲油菜(Brassicanapus)的忙存蛋白napA啟動子，或任何其他本領(lǐng)域已知的種子特異性的啟動子，例如W091/14772所描述的。另外，該啟動子還可以是葉特異性的啟動子，例如水稻或西紅柿的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000)；小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra和Higgins,1994，PlantMolecularBiology26:85-93)，或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674);或為創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。也可以使用啟動子增強元件來獲得在植物中酶的更高表達(dá)。例如，啟動子增強元件可以是位于啟動子和編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如Xu等，1993(同上)公開了水稻肌動蛋白I基因的第一個內(nèi)含子增強表達(dá)的用途。所述可選擇的標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分都可以從本領(lǐng)域可得到的那些中進(jìn)行選擇。根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將該核酸構(gòu)建體整合入植物基因組，所述技術(shù)包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等，1989，Nature338:274)。目前，根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterimtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(見Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiologyl9:15-38的綜述)。不過該方法也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管單子葉植物一般優(yōu)選別的轉(zhuǎn)化方法。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選方法是粒子(被用于轉(zhuǎn)化的DNA所包被的極小的金或鶴粒子)轟擊胚愈傷組織(embroyniccalli)或發(fā)育中的胚(Christou,1992，PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等,1992,Bio/Technology10:667-674)。另外一種可選的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-428所述。轉(zhuǎn)化以后，選擇并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子，并根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方使其再生為完整植株。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有利于生產(chǎn)本發(fā)明的具有抗微生物活性的多肽的條件下，培養(yǎng)包含編碼該多肽的基因的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收該多肽。組合物在進(jìn)一步的一個方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗微生物多肽的組合物，例如藥物組合物。該組合物可以含有一種本發(fā)明的多肽作為主要多肽組分，例如單組分組合物。或者，該組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、溶果膠酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。所述組合物還可以包含另一藥學(xué)活性劑，例如附加的殺生物劑(biocidalagent)，例如另一種顯示如上述定義的抗微生物活性的抗微生物多肽。所述殺生物劑可以是本領(lǐng)域所知的抗生素?？股氐姆N類包括青霉素類(penicillins)，例如青霉素G，青霉素V，甲氧苯青霉素(methicillin)，苯唑青霉素，羧芐青霉素，乙氧萘青霉素，氨芐青霉素，等等；青霉素類結(jié)合內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭孢菌素，例如頭孢克洛，頭孢唑啉，頭孢呋辛，拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素(monobactams);氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類；氯霉素cloramphenical;甲硝咕唑；壯觀霉素；trimethoprim;萬古霉素等。所述殺生物劑還可以是抗真菌劑(ant1-mycoticagent),包括多烯類化合物,例如兩性霉素B,制霉菌素；5_flucosyn;以及唑類,例如咪康唑(miconazol),酮康唑(ketoconazol),伊曲康唑和氟康唑(fluconazol)。在一個實施方式中所述殺生物劑是非酶的化學(xué)劑。在另一個實施方式中所述殺生物劑是非多肽的化學(xué)劑。該殺生物劑可能具有下面的能力:在20°C下，在該殺生物劑的25%(w/w)水溶液，優(yōu)選10%(w/w)水溶液，更優(yōu)選5%(w/w)水溶液，甚至更優(yōu)選l%(w/w)水溶液,最優(yōu)選0.5%(w/w)水溶液，特別是0.l%(w/w)水溶液中，溫育8小時后(優(yōu)選4小時后，更優(yōu)選2小時后，最優(yōu)選I小時后，特別是30分鐘后)，將大腸桿菌(DSM1576)活細(xì)胞的數(shù)目降低到1/100。該殺生物劑還可能具有下面的能力:當(dāng)其以IOOOppm的濃度,優(yōu)選以500ppm的濃度，更優(yōu)選以250ppm的濃度,甚至更優(yōu)選以IOOppm的濃度,更優(yōu)選以50ppm的濃度,特別是以25ppm的濃度加入時，在25°C下的微生物培養(yǎng)基中，可抑制大腸桿菌(DSM1576)的長出(outgrowth)24小時。該殺生物劑還可能具有下面的能力:在20°C下，在該殺生物劑的25%(w/w)水溶液，優(yōu)選10%(w/w)水溶液,更優(yōu)選5%(w/w)水溶液,更優(yōu)選1%(w/w)水溶液,最優(yōu)選0.5%(w/w)水溶液，特別是0.l%(w/w)水溶液中，溫育8小時后(優(yōu)選4小時后，更優(yōu)選2小時后，最優(yōu)選I小時后，特別是30分鐘后)，將枯草芽孢桿菌(ATCC6633)活細(xì)胞的數(shù)目降低到1/100。該殺生物劑還可能具有下面的能力:當(dāng)其以IOOOppm的濃度,優(yōu)選以500ppm的濃度，更優(yōu)選以250ppm的濃度,甚至更優(yōu)選以IOOppm的濃度,更優(yōu)選以50ppm的濃度,特別是以25ppm的濃度加入時，在25°C下的微生物培養(yǎng)基中，可抑制枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的長出24小時。該組合物可包含合適的載體物質(zhì)。該組合物還可包含合適的送遞媒介物，當(dāng)該組合物用作藥物時，該媒介物可以將本發(fā)明的抗微生物多肽送遞到希望的位點。該組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，并可以是液體或干燥組合物的形式。例如，該多肽組合物可以使顆?；蛭㈩w粒的形式。組合物中要包含的多肽可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來穩(wěn)定化。下面給出了本發(fā)明的多肽組合物的優(yōu)選的用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和該組合物的使用條件可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來確定。方法和用途本發(fā)明還包含本發(fā)明的抗微生物多肽的各種用途。所述抗微生物多肽通?？梢杂糜谌魏问艿郊?xì)菌、真菌、酵母或藻類污染的地方。通常，在水系統(tǒng)例如冷卻水系統(tǒng)、洗衣漂洗用水，和油系統(tǒng)例如切削油(cuttingoil),潤滑劑,油田(oilfield)等中有需要殺死微生物或控制微生物生長的地方。但是，本發(fā)明還可以用于已知的抗微生物組合物有用的所有用途，例如木材、膠乳(latex)、膠粘劑(adhesive)、膠水類(glue)、紙、紙板、紡織品、皮革、塑料、斂縫材料(caulking)和飼料的保護(hù)。其他的應(yīng)用包括:保存食品，飲料，化妝品如洗液(lotions)，乳膏，凝膠(gel)，油膏,肥阜，香波，護(hù)發(fā)劑(conditinoers)，止汗劑(antiperspirants)，除臭劑(deodorants),漱口劑(mouthwash),隱形眼鏡(contactlens)產(chǎn)品，酶制劑，或食品成分。因此，本發(fā)明的抗微生物多肽可以用作消毒劑(disinfectant)，例如在痤瘡(acne)、眼或口腔感染,及皮膚感染的治療中；在止汗劑或除臭劑中；在足浴鹽(footbathsalts)中；及用于隱形眼鏡、硬表面、牙齒(口腔護(hù)理)、傷口、瘀傷(bruises)等等的清潔和消毒。一般認(rèn)為本發(fā)明的抗微生物多肽可用于在任何硬表面上進(jìn)行清潔、消毒和抑制微生物生長。可有利地與本發(fā)明的抗微生物多肽相接觸的表面的例子有例如乳制品廠、化學(xué)或藥品加工廠、水凈化系統(tǒng)、油加工廠、紙漿加工廠、水處理廠和冷卻塔中所用的加工設(shè)備的表面。本發(fā)明的抗微生物多肽的使用量應(yīng)該能夠有效地在所述的表面上進(jìn)行清潔、消毒或抑制微生物生長。另外，認(rèn)為本發(fā)明的抗微生物多肽可以有利地應(yīng)用于在位清洗(cleaning-1n-place,C.1.P.)系統(tǒng)中,用于清潔任何種類的加工設(shè)備。本發(fā)明的抗微生物多肽還可以用在食品加工廠和任何制備或供應(yīng)食品的地方，例如醫(yī)院，療養(yǎng)院(nursinghome),及餐館尤其是快餐廳,熟食店(delicatessens)等地方，用于清潔表面和烹飪用具。它還可以用作食品中的抗微生物劑，并且作為干酪(cheese)、水果、蔬菜及沙拉自助長條桌(saladbars)上的食物的抗微生物劑特別有用。它還可以用作水基涂料中的防腐劑保存劑(preservationagent)或消毒劑。本發(fā)明的抗微生物多肽還可以用于水線路的微生物控制，水的消毒，特別是用于工業(yè)用水的消毒。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物作為藥物的用途。另外本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物還可以用來制造藥物，用于控制或抗(combating)微生物,例如真菌類生物或細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性細(xì)菌。本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物還可以用作人用或獸用的抗微生物治療或預(yù)防劑。因此，本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物可以用于制備人用或獸用的抗微生物治療或預(yù)防劑，用于治療微生物感染，例如細(xì)菌或真菌感染，優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌感染。具體地，所述微生物感染可以與肺病相關(guān)，所述肺病包括但不限于結(jié)核，肺炎和囊性纖維化??；還可與性轉(zhuǎn)播疾病相關(guān)，所述性轉(zhuǎn)播疾病包括但不限于淋病(gonorrhea)和衣原體感染(chlamydia)。本發(fā)明的組合物包含有效量的本發(fā)明的抗微生物多肽。術(shù)語“有效量”在本文中指包含SEQIDN0:2到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸I到18所示的氨基酸序列的抗微生物多肽，或其片段或變體的足以抑制所述微生物的生長的量。本發(fā)明還涉及愈合傷口的組合物或產(chǎn)品，例如繃帶(bandages),醫(yī)療設(shè)備例如導(dǎo)管，還涉及抗頭屑(ant1-dandruff)的頭發(fā)用品,例如香波。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑被施用給受到或易受微生物感染的宿主。施用可以是表面、局部或全身性的，這取決于具體的微生物，優(yōu)選局部施用(localized)。一般而言，本發(fā)明的抗微生物多肽的劑量足以使微生物群體減少至少50%，通常為至少I個對數(shù)級，還可能是2個或更多對數(shù)級的殺滅。本發(fā)明的化合物的施用量可減小微生物群體而同時使任何副作用最小化。本發(fā)明人認(rèn)為該組合物將在內(nèi)科醫(yī)生的建議下獲得并用于體內(nèi)用途。本發(fā)明的抗微生物多肽特別有用于殺死革蘭氏陰性細(xì)菌，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),和沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis);及革蘭氏陽性細(xì)菌,包括鏈球菌例如肺炎鏈球菌(S.pneumonia),乳房鏈球菌(S.uberis),S.hyointestinalis,化膿鏈球菌(S.pyogenes)或S.agalactiae;和葡萄球菌例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis),S.simulans,S，xylosus和S.carnosus。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑可以被施用給受到或易受微生物性肺感染例如肺炎，或微生物性傷口感染例如傷口細(xì)菌感染的宿主。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑還可以被施用給受到或易受皮膚感染例如痤瘡，特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)或脂溢性(seborrheic)皮炎的宿主；優(yōu)選地，該皮膚感染是細(xì)菌性皮膚感染，例如由表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)，卵瓶形酵母(Pityrosporumovale)或Malasseziafurfur引起的感染。本發(fā)明的抗微生物多肽還可以用于體外制劑來殺死微生物，特別是當(dāng)人們不希望引入大量的常規(guī)抗生素的時候。例如，本發(fā)明的抗微生物多肽可以添加到動物和/或人的食品制備物中；或者它們可以作為體外細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑，用于防止和抑制組織培養(yǎng)物中長出微生物。特定的微生物對本發(fā)明的抗微生物多肽殺滅的敏感性可以通過本文實驗部分要詳述的體外測試來確定。典型地，使微生物培養(yǎng)物和不同濃度的抗微生物多肽在一起經(jīng)過足以使該蛋白起作用的時間，通常為大約I小時到I天。然后計算活的微生物的數(shù)目并確定殺滅水平。目標(biāo)微生物包括但不限于,朽1檬酸桿菌屬菌種(Citrobactersp.);腸桿菌屬菌種(Enterobactersp.);埃希氏菌屬菌種(Escherichiasp.),例如大腸桿菌；克雷白氏桿菌屬菌種(Klebsiellasp.);Morganellasp.;變形菌屬菌種(Proteussp.);普羅威登斯菌屬菌種(Providenciasp.);沙門氏菌屬菌種(Salmonellasp.)，例如傷寒沙門氏菌(S.typhi)，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium);沙雷氏菌屬菌種(Serratiasp.);志賀氏菌屬菌種(Shigellasp.);假單胞菌屬菌種，例如銅綠假單胞菌；耶爾森氏菌屬菌種(Yersiniasp.)，例如鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)，假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis),小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica);弗朗西斯氏菌屬菌種(Franciscellasp.);巴斯德氏菌屬菌種(Pasturellasp.);弧菌屬菌種(Vibriosp.),例如霍亂弧菌(V.cholerae)，副溶血性弧菌(V.parahemolyticus);彎曲桿菌屬菌種(Campylobactersp.),例如C.jejuni;嗜血桿菌屬菌種(Haemophilussp.),例如流感嗜血菌(H.1nfluenzae),杜克氏嗜血桿菌(H.ducreyi);博德特氏菌屬菌種(Bordetellasp.),例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)，B.bronchiseptica,副百日咳博德特氏桿菌(B.parapertussis);布魯氏菌屬菌種(Brucellasp.),奈瑟氏球菌屬菌種(Neisseriasp.),例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)，等等。其他目標(biāo)細(xì)菌包括Legionellasp.，例如L.pneumophila;利斯特氏菌屬菌種(Listeriasp.)，例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes);枝原體屬菌種(Mycoplasmasp.),例如人型枝原體(M.hominis),肺炎枝原體(M.pneumoniae);分枝桿菌屬菌種(Mycobacteriumsp.),例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis),麻瘋分枝桿菌(M.leprae);密螺旋體屬菌種(Treponemasp.),例如蒼白密螺旋體(T.pallidum);疏螺旋體屬(Borreliasp.),例如B.burgdorferi;Leptospiraesp.;立克次氏體屬菌種(Rickettsiasp.),例如立氏立克次氏體(R.rickettsii)，傷寒型立克次氏體(R.typhi);Chlamydiasp.,例如沙眼衣原體(C.trachomatis)，C.pneumoniae,嬰鳥踏熱衣原體(C.psittaci);Helicobactersp.,例如H.pylori,等等。非細(xì)菌類的目標(biāo)病原體包括真菌和原生動物病原體，例如瘧原蟲屬的種(Plasmodiasp.),例如惡性痕原蟲(P.falciparum);錐蟲屬的種(Trypanosomasp.),例如布氏維蟲(T.brucei);血吸蟲(shistosomes);內(nèi)阿米巴屬的種(Entaemoebasp.),隱球菌屬的種(Cryptococcussp.),念珠菌屬的種(Candidasp.),例如白色念珠菌(C.albicans);等等?？梢圆扇《喾N施用方法。所述多肽制劑可以口服施用，或者可以血管內(nèi)、皮下和腹膜注射，通過氣霧劑施用，眼施用，膀胱內(nèi)施用，表面施用(topically)等等。例如,通過吸入施用的方法是本領(lǐng)域熟知的。所述治療性制劑的劑量可以在寬的范圍內(nèi)變化，這取決于要施用的具體的抗微生物多肽、疾病的性質(zhì)、施用頻率、施用方式、宿主對該試劑的清除，等等。開始的劑量可以較大，然后以維持較小的劑量。劑量使用的頻率可以低到每周或每兩周，也可以分成較小的劑量，每天或每半周使用一次或數(shù)次等等，來維持有效的劑量水平。在很多情況下，口服施用比靜脈內(nèi)施用要求更高的劑量?？梢孕揎楑０锋I以及氨基和羧基末端，以增加口服時的穩(wěn)定性。例如，羧基末端可以酰胺化。制劑本發(fā)明的化合物可以摻入多種用于治療性施用的制劑中。更具體地，本發(fā)明的化合物可通過與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合配制成藥物組合物，還可以制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、乳膏、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、洗劑和氣霧劑(aerosols)。同樣地，可以通過多種途徑施用這些化合物，包括口服、含服(buccal)、直腸、胃腸外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、氣管內(nèi)施用等等。本發(fā)明的抗微生物多肽可以在施用后作用于全身，也可以通過使用能在植入部位維持活性劑量的植入物(implant)或其他制劑而作用于局部。在一個實施方式中，表面使用的制劑包含螯合劑，其可降低二價陽離子特別是鈣和鎂的有效濃度。例如，可以包含檸檬酸鹽，EGTA或EDTA，其中優(yōu)選檸檬酸鹽。通常檸檬酸鹽的濃度為大約1-lOmM。本發(fā)明的化合物可以單獨施用，相互組合施用，或者與其它已知的化合物(例如穿孔蛋白，抗炎劑，抗生素等等)。在藥物劑型中，這些化合物可以以它們的藥學(xué)上可接受的鹽的形式施用。下面所述的方法和賦形劑都是示例性的而不是限制性的。對于口服制劑，這些化合物可以單獨使用或者與合適的添加劑組合制造片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑，例如與常規(guī)的添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與粘合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠(acacia)、玉米淀粉或明膠；與崩解劑(disintegrators)例如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑如云母或硬脂酸鎂組合；希望的話，還可以與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調(diào)味劑組合。通過將所述化合物溶解、懸浮或乳化在水性或非水性的溶劑中，例如植物油或其它類似的油，合成的脂肪族酸甘油酯，高碳脂肪酸(higheraliphaticacids)或丙二醇的酯；希望的話可加入常規(guī)的添加劑例如增溶劑、等滲劑(isotonicagents)、助懸劑、乳化齊U、穩(wěn)定劑和防腐劑，所述化合物可以制成注射制劑。所述化合物可以在用于吸入給藥的氣霧劑制劑中使用。本發(fā)明的化合物可以制入加壓的可接受的推進(jìn)劑(propellant)中,例如二氯二氟甲燒,丙燒,氮氣等。通過與常規(guī)的添加劑例如增溶劑、等滲劑、助懸劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑配制，所述化合物可以用作洗劑，例如用來防止燒傷感染的洗劑。另外，通過與多種基質(zhì)(bases)例如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合,所述化合物可以制成栓劑。本發(fā)明的化合物可以通過栓劑直腸施用。所述栓劑可包含溶媒(vehicles)例如可可脂(cocoabutter),carbowaxes和聚乙二醇,它們在體溫下熔解,在室溫下固化?？梢蕴峁┨菨{、酏劑和混懸劑等口服或直腸施用的單位劑型，其中每個劑量單位，例如每茶匙量、每湯匙量、每片或每栓，含有預(yù)定量的、包含一種或多種本發(fā)明的化合物的組合物。類似地，注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可以包含這樣的組合物中的本發(fā)明的化合物:該組合物是無菌水、生理鹽水或另一藥學(xué)上可接受的載體中的溶液。用于緩釋劑型的植入物是本領(lǐng)域熟知的。植入物與生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主可良好耐受的易蝕聚合物。含有本發(fā)明的抗微生物多肽的植入物被置于感染部位附近，使得活性劑的局部濃度相對于身體的其它部分升高。本文中使用的術(shù)語“單位劑型”是指適合作用單位劑量用于人和動物受體的物理上離散的單位，每個單位包含預(yù)定量的本發(fā)明的化合物，該化合物的量根據(jù)計算足以產(chǎn)生所希望的作用；還包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體和溶媒。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格取決于所用的具體化合物和要實現(xiàn)的作用，及該化合物在宿主中的相關(guān)藥物動力學(xué)。所述藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如溶媒、佐劑、載體或稀釋劑，是公眾容易獲得的。另外，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑等等，是公眾容易獲得的。用于全身施用的通常劑量為0.1pg到100毫克每千克受體體重每次施用。典型的劑量可以是每天2至6次,每次一片,或者每天一次,每次一顆/片緩釋(timerelease)膠囊或片，其中該緩釋膠囊或片含有按比例增高的活性成分。該緩釋作用可以通過下列手段實現(xiàn):在不同的PH值下溶解的膠囊材料，通過滲透壓緩慢釋放的膠囊，或者其他任何已知的控釋手段。技術(shù)人員容易理解，劑量水平可能作為具體的化合物、癥狀的嚴(yán)重性、以及受體對副作用的敏感性的函數(shù)而變化。一些特定的化合物比其他化合物更強效。對于給定的化合物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地使用多種手段確定其優(yōu)選劑量。一種優(yōu)選的手段是測量給定的化合物的生理效能。一種感興趣的方法是用脂質(zhì)體作送遞載體。脂質(zhì)體與目標(biāo)部位的細(xì)胞融合并將內(nèi)腔中的內(nèi)容物送到胞內(nèi)。使用多種保持接觸的方法，如分離，結(jié)合劑等等，使脂質(zhì)體與細(xì)胞維持足以融合的時間的接觸。在本發(fā)明的一個方面中，脂質(zhì)體設(shè)計為可以被霧化(aerosolized)以便肺部給藥。脂質(zhì)體可以用介導(dǎo)膜融合的純化的蛋白或肽例如仙臺病毒(Sendaivirus)或流感病毒(influenza)等來制備。脂類可以是已知的形成脂質(zhì)體的脂類一包括陽離子或兩性離子例如磷脂酰膽堿一的任何有用的組合。剩下的脂類通常是中性或酸性的脂類，例如膽固醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，等等?？梢杂肒ato等，(1991)T.Biol.Chem.266:3361所述的方法來制備脂質(zhì)體。簡單地說，在合適的水性介質(zhì)中合并脂類和含有肽的內(nèi)腔(lumen)組合物，方便地，水性介質(zhì)可以為鹽水介質(zhì)，其中總固形物為大約I一10重量％。短時間(約5—60秒)劇烈攪拌后，將管置于25-40°C的溫水浴中，如此循環(huán)5-10次。然后將該組合物超聲處理合適的時間，一般為I一10秒，還可以通過渦旋混合來進(jìn)一步攪拌。然后加入水性介質(zhì)來擴大體積，一般將體積擴大至約I一2倍,再進(jìn)行振蕩和冷卻。該方法使得聞分子量的分子可以被納入到內(nèi)腔中。含其他活性劑的制劑本發(fā)明的抗微生物多肽可以與其他的藥學(xué)活性劑，特別是其他的抗微生物劑配制來用于本發(fā)明主題的方法。其他感興趣的試劑包括如本領(lǐng)域已知的多種抗生素?？股锏念悇e包括青霉素類(penicillins)，例如青霉素G，青霉素V，甲氧苯青霉素，苯唑青霉素，羧芐青霉素，乙氧萘青霉素，氨芐青霉素，等等；青霉素類結(jié)合β_內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭孢菌素，例如頭孢克洛，頭孢唑啉，頭孢呋辛，拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類；氯霉素；甲硝噠唑；壯觀霉素；trimethoprim;萬古霉素等。抗真菌劑也是有用的，包括多烯類化合物，例如兩性霉素B，制霉菌素；5-fIucosyn;以及唑類，例如咪康唑，酮康唑，伊曲康唑和氟康唑?？菇Y(jié)核藥包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和利福平。本發(fā)明的抗微生物多肽的制劑中還可包含細(xì)胞因子，例如干擾素Y、腫瘤壞死因子α、白介素12等。體外合成本發(fā)明的抗微生物肽可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)通過體外合成來制備?？梢垣@得的商品化的合成設(shè)備有很多，例如AppliedBiosystemsInc.，Beckman提供的自動合成儀等等。使用合成儀，天然的氨基酸可以被置換為非天然的氨基酸，尤其是D-異構(gòu)體(或D-型)例如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對映異構(gòu)體、具有不同長度或功能性的側(cè)鏈等等。具體的序列和制備方式將取決于方便性、經(jīng)濟性、所需的純度等等?？梢詫泻线m的成鍵官能團(tuán)(functionalities)的多種肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，所述成鍵官能團(tuán)的例子有:氨基，用于形成酰胺或取代的胺，例如還原性氨化；硫醇基，用于形成硫醚或二硫鍵；羧基，用于形成酰胺，等等。需要的話，在合成或者表達(dá)過程中可以向肽中引入多種可供于連接其他分子或表面的基團(tuán)。這樣，半胱氨酸可用來形成硫醚，組氨酸可以用來與金屬離子復(fù)合物連接，羧基可用來形成酰胺或酯，氨基可用來形成酰胺，等等。還可以依照常規(guī)的重組合成方法來分離純化所述多肽?？梢灾苽浔磉_(dá)載體的裂解物，再利用HPLC、排阻色譜、凝膠電泳、親和色譜(affinitychromatography)或其它純合技術(shù)來純化該裂解物。大多數(shù)情況下，所使用的組合物可包括至少20重量％的所希望的產(chǎn)物，更通常為至少約75重量％，優(yōu)選至少約95重量％，用于治療的，通常至少約99.5重量％，相對于與該產(chǎn)物的制備和純化方法相關(guān)的污染物。上述百分?jǐn)?shù)通?；诳偟鞍?。動物飼料本發(fā)明還涉及在動物飼料中使用所述具有抗微生物活性的多肽的方法，以及包含本發(fā)明的抗微生物多肽的飼料組合物和飼料添加劑。術(shù)語“動物”包含所有的動物,包括人類。動物的例子有非反芻類動物，和反芻類動物如牛、綿羊和馬。在一個具體的實施方案中，所述動物是非反芻類動物。非反芻類動物包括單胃動物，例如豬(Pigs)或豬(swine)(包括但不限于仔豬、生長期豬和大母豬(sow))；禽類例如火雞和雞(包括但不限于肉仔雞(broilerchick),產(chǎn)蛋雞(layers));年幼的小牛；和魚類(包括但不限于鮭魚)術(shù)語“飼料”或“飼料組合物”指適于被動物攝取或供動物攝取的任何化合物、制備物、混合物或組合物。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，所述抗微生物多肽可以在飲食之前、之后或同時飼喂給動物。優(yōu)選后者。在一個特定的實施方案中，當(dāng)所述抗微生物多肽被添加到飼料中或被包含在飼料添加劑中時，它是明確定義的?！懊鞔_定義”(well-defined)是指該抗微生物多肽制備物如大小排阻層析(sizeexclusionchromatography)測定為至少50%純(參考W001/58275的實施例12)。在其他的具體實施方案中，如該方法所測定的，微生物多肽制備物為至少60，70，80，85，88，90，92，94，或至少95%純。明確定義的抗微生物多肽制備物是有利的。例如，對于基本上不含其他干擾性或污染性的抗微生物多肽的抗微生物多肽，將其正確地按劑量施用于飼料要容易得多。術(shù)語“正確地按劑量施用”(dosecorrectly)具體是指獲得一致和恒定結(jié)果的目標(biāo)，和根據(jù)所需效果來最優(yōu)化劑量的能力。但是用于動物飼料時，該抗微生物多肽并不需要那么純；它可以，例如，包含其他的酶，在這種情況下它可以稱為抗微生物多肽制備物。該抗微生物多肽制備物可以(a)直接加入飼料中(或直接用于植物蛋白的處理工藝中)，或(b)用于生產(chǎn)一種或多種中間性組合物，例如飼料添加劑或預(yù)混物，其隨后被加入飼料(或用于處理工藝中)。上面所述的純度是指原來的抗微生物多肽制備物的純度，該制備物是根據(jù)上述(a)或(b)使用的。具有該數(shù)量級的純度的抗微生物多肽制備物，具體地可以使用重組生產(chǎn)方法得至IJ，但當(dāng)使用常規(guī)的發(fā)酵方法來生產(chǎn)所述抗微生物多肽時，它們不那么容易獲得，并且批次間的變差要高得多。當(dāng)然，這樣的抗微生物多肽制備物可與其他的酶混合。術(shù)語“植物蛋白”(vegetableproteins)在本文中用于指包含至少一種來自或源自植物的蛋白，包括修飾蛋白和蛋白衍生物的任何化合物、組合物、制備物或混合物。在具體的實施方案中，植物蛋白的蛋白含量為至少10，20，30，40，50，或60%(w/w)。植物蛋白可以來自植物蛋白源，例如豆類和谷物，如來自豆科(Fabaceae(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、黎科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)等科的植物的材料,如大豆柏(soybeanmeal)、羽扇豆柏(lupinmeal)和油菜桿柏(rapeseedmeal)。在一個具體的實施方案中，植物蛋白源是來自豆科的一種或多種植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆(bean)的材料。在另一個具體的實施方案中，植物蛋白源是來自藜科的一種或多種植物例如甜菜(beet)、糖用甜菜(sugarbeet)、菠菜或昆諾阿藜(quinoa)的材料。植物蛋白源的其他例子有油菜籽和甘藍(lán)。大豆是優(yōu)選的植物蛋白源。植物蛋白源的其他例子有谷物，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米(maize/corn)、水稻和高粱?？刮⑸锒嚯目梢砸匀魏涡问郊尤腼暳?，或者作為相對純的抗微生物多肽，或者與其他供加入該動物飼料的組分摻合，即以動物飼料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料用預(yù)混物(pre-mix)。在進(jìn)一步的一個方面，本發(fā)明涉及組合物，其用于動物飼料，例如動物飼料，或動物飼料添加劑，例如預(yù)混物。除了本發(fā)明的抗微生物多肽，本發(fā)明的動物飼料添加劑含有至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或至少一種大量礦物質(zhì)(macromineral)。另外，任選的飼料添加劑成分包括著色劑(coloringagents)、香味化合物(aromacompounds)、穩(wěn)定劑,和/或至少一種選自下列的酶:肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2.1.89;和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4。在一個具體的實施方式中，所述其他酶是明確定義的(如上述用于抗微生物多肽制備物的定義)。其他抗微生物肽(AMP’s)的例子有CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-1>Thanatin>Defensin>Ovispirin例如Novispirin(RobertLehrer,2000)、及它們的保留抗微生物活性的變體或片段。其他抗真菌多肽(AFP’s)的例子有巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉的肽，及它們的保留抗真菌活性的變體和片段，如W094/01459和W002/090384所公開的。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質(zhì)形成要加入飼料的所謂預(yù)混物的一部分，而大量礦物質(zhì)通常單獨加入該飼料。這些組合類型中的任一種當(dāng)添加了本發(fā)明的抗微生物多肽時就是本發(fā)明的動物飼料添加劑。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑要以0.01—10.0%，更具體為0.05—5.0%，或0.2—1.0%(%表示g添加劑每IOOg飼料)的水平被包含在(或者根據(jù)配方必須包含在)動物飲食或飼料中。特別是對于預(yù)混物是這樣。下面列出了這樣的組分的非排他性示例:脂溶性維生素的例子有維生素A、維生素D3、維生素E、和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸和其鹽(panthothenate),例如D-泛酸隹丐。痕量礦物質(zhì)的例子有錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。大量礦物質(zhì)的例子有鈣、磷和鈉。W001/58275的表A列出了這些組分的營養(yǎng)需求(以家禽和豬/仔豬為例)。營養(yǎng)需求(nutritionalrequirement)是指這些組分必須以所指明的濃度在飲食中提供?；蛘?，本發(fā)明的動物飼料添加劑包含W001/58275的表A所列的單個組分中的至少一種?！爸辽僖环N”指組分中的任一種，一種或多種，一種，或兩種，或三種，或四種，如此直至全部13種，或全部15種單個組分。更具體地，該至少一種單個組分以這樣的量被包含在本發(fā)明的添加劑中，以提供表A的第4列，或第5列，或第6列所示的范圍之內(nèi)的飼料中濃度(in-feedconcentration)。本發(fā)明還涉及動物飼料組合物,動物飼料組合物或飲食具有較高的蛋白質(zhì)含量。家禽和豬的飲食可以如W001/58275的表B、列2—3來描述。魚類的飲食可以如表B的第4列來描述。另外該魚類飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據(jù)本發(fā)明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，還包含至少一種如本申請所要求保護(hù)的抗微生物多肽。并且，或者作為(上述粗蛋白含量的)替代，本發(fā)明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量(metabolizableenergy)含量；和/或0.l_200g/kg的I丐含量；和/或0.l-200g/kg的有效磷(availablephosphorus)含量；和/或0.Ι-lOOg/kg的甲硫氨酸含量，和/或0.l-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體的實施方案中，所述可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸含量在W001/58275的表B的范圍2、3、4或5(2-5行)的任一范圍內(nèi)。粗蛋白是用氮(N)乘以因數(shù)6.25來計算的，即，粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)X6.25。氮含量是用凱氏(Kjeldahl)定氮法(A.0.A.C.,1984,OfficialMethodsofAnalysis第14版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)石角定的?？纱x能量可以根據(jù)下列文獻(xiàn)來計算:國家研究委員會(NRC)的出版物Nutrientrequirementsinswine,第九次修訂版，1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.,pp.2-6；和EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuff's,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,ffageningen.1SBN90-71463-12-5鈣、有效磷和氨基酸在完全動物飲食中的飲食含量根據(jù)例如Veevoedertabel1997,gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureaujRunderweg6,8219pkLelystad.1SBN90-72839-13-7等飼料表來計算。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物含有至少一種如上面定義的植物蛋白或蛋白源。在進(jìn)一步的具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物含有0-80%的玉米；和/或0-80%的高粱；和/或0-70%的小麥；和/或0-70%的大麥；和/或0-30%的燕麥；和/或0-40%的大豆柏(soybeanmeal);和/或0-10%的魚粉；和/或0-20%的乳清。動物飲食可以例如制成粉狀(mash)飼料(非顆粒的)或顆粒飼料。典型地，將粉碎的飼料原料混合，并根據(jù)所述物種所用的規(guī)格加入足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。酶可以作為固體或液體酶制劑加入。例如，固體酶制劑通常在混合步驟前或期間加入；而液體酶制備物通常在造粒步驟之后加入。酶還可以摻入飼料添加劑或預(yù)混物。飲食中的酶終濃度為0.01_200mg酶蛋白每kg飲食，例如為5_30mg酶蛋白每kg動物飲食。所述抗微生物多肽可以以下列量施用(劑量范圍):0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10一上述范圍都是指mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料(ppm)。如下測定mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料:從飼料組合物中純化出抗微生物多肽，再使用相關(guān)的測定方法(見抗微生物活性、底物和測定方法條目下)確定純化的抗微生物多肽的具體活性(specificactivity)。使用同樣的測定方法確定所述飼料組合物的抗微生物活性，根據(jù)這兩個測定，計算以mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料表示的劑量。同樣的原則也可以用于確定飼料添加劑中的mg抗微生物多肽蛋白質(zhì)。當(dāng)然，如果可以獲得制備所述飼料添加劑或飼料所用的抗微生物多肽的樣品，就由此樣品確定具體的活性(不需要從飼料組合物或添加劑中純化該抗微生物多肽)。去污劑組合物本發(fā)明的抗微生物多肽可以添加到去污劑組合物中并因此成為其組分。本發(fā)明的去污劑組合物可以，例如，配制為手洗或機洗衣物用去污劑組合物，其包括適用于預(yù)處理染污織物的洗衣添加劑組合物和漂洗加入的織物軟化組合物(rinseaddedfabricsoftenercomposition);或者可以配制為用于一般家用清洗硬表面的去污劑組合物，或配制用于手洗或機洗碗碟。在一個特定的方面中，本發(fā)明提供去污添加劑，其包含本發(fā)明的抗微生物多肽和表面活性劑。該去污添加劑及去污劑組合物可包含一種或多種其他的酶例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或過氧化物酶(例如鹵素過氧化物酶)。一般而言，所選的酶的性質(zhì)應(yīng)該與所選的去污劑相容(例如最適pH、與其他酶或非酶成分的相容性等等)，而且該酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。微生物來源是優(yōu)選的。還包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。該蛋白質(zhì)可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選地為堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣(trypsin-like)蛋白酶。堿性蛋白酶的例子有枯草桿菌蛋白酶，特別是來自芽孢桿菌的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(如W089/06279所述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和鐮孢屬真菌蛋白酶，其在W089/06270和W094/25583中有描述。有用的蛋白酶的例子有W092/19729、W098/20115、W098/20116和W098/34946中所描述的變體，特別是在下面一個或多個位置上有置換的變體:27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。脂肪酶:合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些脂肪酶。還包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質(zhì)霉屬(Humicola，與Thermomyces同義)的脂肪酶，例如EP258068和EP305216所描述的來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶,或W096/13580所描述的來自H.1nsolens的脂肪酶,假單胞菌脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、蔥頭假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、司徒茨氏假單胞菌(P.stutzeri)(GBI,372，034)、熒光假單胞菌(P.fIuorescens)、假單胞菌菌株SD705(W095/06720和W096/27002)和P.wisconsinensis(W096/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽抱桿菌(Dartois等，(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)、或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(W091/16422)的脂肪酶。其他的例子有W092/05249,W094/01541,EP407225,EP260105,W095/35381,W096/00292,W095/30744,W094/25578,W095/14783,W095/22615,W097/04079和TO97/07202中所描述的脂肪酶變體。淀粉酶:合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌或真菌來源的那些淀粉酶。還包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。淀粉酶包括，例如，得自芽孢桿菌，例如一個特別的地衣芽孢桿菌菌株(在GB1，296，839中有詳述)的α-淀粉酶。有用的淀粉酶的例子有W094/02597,W094/18314,W096/23873和W097/43424中描述的變體，特別是在下列一個或多個位置上有置換的變體:15，23，105，106，124，128，133，I54，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。纖維素酶:合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些纖維素酶。還包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬和Acremonium屬的纖維素酶，例如在US4，435，307,US5,648，263，US5,691，178，US5,776，757和W089/09259中描述的、由Humicolainsolens、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有護(hù)色(colorcare)效益的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子有EP0495257,EP0531372,W096/11262,W096/29397和W098/08940中描述的纖維素酶。其他例子有纖維素酶變體，例如W094/07998，EP0531315,US5,457，046,US5,686，593，US5,763，254，W095/24471,W098/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。過氧化物酶/氧化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些過氧化物酶/氧化酶。還包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的過氧化物酶的例子包括來自鬼傘屬(Coprinus)的過氧化物酶,例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus),及其變體，如W093/24618,W095/10602,和W098/15257所述的那些的過氧化物酶?？梢酝ㄟ^加入單獨的含有一種或多種酶的添加劑，或加入包含所有酶的復(fù)合添加齊U，來使去污酶(detergentenzyme(s))包含在去污劑組合物中。本發(fā)明的去污添加劑，即單獨的添加劑或復(fù)合添加劑，可以配置為例如顆粒、液體、漿液等等。優(yōu)選的去污添加劑的劑型為顆粒，特別是非粉化(non-dusting)顆粒、液體,特別是穩(wěn)定化的液體，或衆(zhòng)液。非粉化(non-dusting)顆?？梢?，例如，如US4,106，991和4，661，452所公開的那樣制備，任選地，還可以用本領(lǐng)域已知的方法來包被。蠟包被材料的例子有平均摩爾(moIe)為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);具有16-50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含12-20個碳原子，且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯。GB1483591提供了適于通過流化床施用的成膜包被材料的例子。液體酶制備物可以，例如，按照已確立的方法，通過加入多元醇，如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定化?？梢愿鶕?jù)EP238，216所公開的方法制備被保護(hù)的酶。本發(fā)明的去污劑組合物可以是任何方便的形式，例如條、片、粉、顆粒、糊或液體。液體去污劑可以是水性的，通常含有高達(dá)70%的水和O—30%的有機溶劑，或者是非水性的。所述去污劑組合物包含一種或多種表面活性劑，表面活性劑可以是非離子型包括半極性的，和/或陰離子型的，和/或陽離子型的，和/或兩性離子型的。表面活性劑典型地以0.1—60重量％的水平存在。當(dāng)被包括在其中時，所述去污劑通常含有大約1%到大約40%的陰離子表面活性劑例如線性燒基苯磺酸鹽(alkylbenzenesulfonate)、α-烯屬磺酸酯、燒基硫酸鹽(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(alcoholethoxysulfate)、二級鏈燒磺酸鹽(secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、燒基或烯基琥拍酸或肥阜。當(dāng)被包括在其中時，所述去污劑通常含有約0.2%到約40%的非離子表面活性劑如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺(“葡萄糖胺”(“glucamides”))的N-酰基N-烷基衍生物。所述去污劑可進(jìn)一步包括O—65%的洗漆增效劑(detergentbuilder)或絡(luò)合劑如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、磷酸鹽(phosphonate)、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶的硅酸鹽或分層的(layered)硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)所述去污劑可包含一種或多種聚合物。例如羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。所述去污劑可包含漂白系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括H2O2來源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可與產(chǎn)過酸漂白激活劑(peracid-formingbleachactivator)如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ醣交撬狨?nonanoyloxybenzenesulfonate)組合。或者，漂白系統(tǒng)可包括例如酰胺、二酰亞胺或砜類型的過氧酸。本發(fā)明的去污劑組合物的酶可以用常規(guī)的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定化，例如多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香族硼酸酯，或苯硼酸衍生物如4-甲酰苯硼酸，并且該組合物可以如W092/19709和W092/19708中描述的那樣配制。洗滌劑也可包括其他常規(guī)的洗滌劑組分，例如織物調(diào)理劑(conditioner)包括粘土，促泡劑，抑泡劑，防蝕劑，污物懸浮劑，防污物再沉淀劑，染料，殺菌劑，熒光增白劑，水溶助長劑，晦暗抑制劑，或香料。在此預(yù)計，在所述去污劑組合物中，任何酶，以及本發(fā)明的抗微生物多肽，可以以相應(yīng)于0.0l-1OOmg酶蛋白每升洗漆液,優(yōu)選0.05-10mg酶蛋白每升洗漆液,更優(yōu)選0.l_5mg酶蛋白每升洗滌液，最優(yōu)選0.1-1mg酶蛋白每升洗滌液的量加入。本發(fā)明的抗微生物多肽還可以摻入到W097/07202所公開的去污劑組合物中，在此將W097/07202并入本文作為參考。下面通過實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)被理解為對本發(fā)明的范圍的限制。實施例用作緩沖液和底物的化學(xué)品是商業(yè)產(chǎn)品，至少為試劑級。實施例1抗微生物活性的評估如國際專利申請W000/73433的實施例1所公開的那樣(作了微小的修改)，在大腸桿菌T0P10(InvitiOgen)中用阿拉伯糖作誘導(dǎo)物表達(dá)了若干抗微生物多肽，它們都是SEQIDNO:1的變體。本發(fā)明的抗微生物多肽的表達(dá)導(dǎo)致了宿主細(xì)胞的生長抑制。簡言之，在微量滴定板中，將在含0.2%葡萄糖和氨芐青霉素(100yg/ml)的RM培養(yǎng)基中生長的新鮮過夜培養(yǎng)物在150微升的含0.2%甘油和氨芐青霉素(100μg/ml)及0.01%阿拉伯糖的RM培養(yǎng)基中稀釋300倍，然后在37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)。每隔30分鐘用BioscreenCMicrobiologyreader(ThermoElectronCorporation)測量0D450,持續(xù)14小時，來檢測生長曲線(緩沖液的培養(yǎng)基組成可參考Invitrogen的pBAD/gllIA，B和C載體操作規(guī)程，目錄號V450-01)。生長抑制的百分率這樣計算:以每個樣品的終點OD測量值，除以從含對照載體的細(xì)胞獲得的終點OD測量值，再乘以100。公式如下:權(quán)利要求1.具有抗微生物活性的多肽，包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17;其中X1=N,F，I，W，M,S，A,T,Y,V，H，L，C，K或G;優(yōu)選X1=S,T，V，Y，W，I，G，F(xiàn)或L;X2=L,I,F或W;優(yōu)選X2=W或I;X3=R,I，F(xiàn)，L，Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X3=F,I，V或L;X4=R或C;X5=I,L，W，M，V或F;優(yōu)選X5=L或I;X6=I,L或W;優(yōu)選X6=I;X7=R,L，T*C;X8=K,V,F，L,C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X8=Y,F，W，V或L;X9=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X9=G或F;X10=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X10=W或I;X11=H,K,C，A，S，I，N，L或Q;優(yōu)選X11=I,S或K;X12=I,L,F或V;優(yōu)選X12=L;X13=I,L，F(xiàn)，T或V;優(yōu)選X13=L;X14=K,I，S，L或R;優(yōu)選X14=I,R或L;X15=K,R或I;X16=Y,I，L，F(xiàn)或K;優(yōu)選X16=L;X17=G,I,S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X17=I,F或L;其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%的同一性而少于100%的同一'I"生。2.具有抗微生物活性的多肽，包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列:K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Xi6;其中X1=L,I,F或W;優(yōu)選X1=W或I;X2=R,I,F,L,Y,V,A,T，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X2=F,I，V或L;X3=R或C;X4=I,L，W，M，V或F;優(yōu)選X4=L或I;X5=I,L或W;優(yōu)選X5=I;X6=R,L，T*C;X7=K,V,F，L,C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X7=Y,F，W，V或L;X8=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X8=G或F;X9=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X9=W或I;X10=H,K，C，A，S，I，N，L或Q;優(yōu)選X10=I,S或K;X11=I,L,F或V;優(yōu)選X11=L;X12=I,L，F(xiàn)，T或V;優(yōu)選X12=L;X13=K,I，S，L或R;優(yōu)選X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I，L，F(xiàn)或K;優(yōu)選X15=L;X16=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X16=I,F或L;其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一'I"生。3.具有抗微生物活性的多肽，包含SEQIDΝ0:4所示的氨基酸序列:K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-Xi6;其中X1=N,F，I，W，Μ,S，A,Τ,Y,V，H，L，C，K或G;優(yōu)選X1=S,Τ，V，Y，W，I，G，F(xiàn)或L;X2=L,I,F或W;優(yōu)選X2=W或I;X3=R,I，F(xiàn)，L，Y,V,A,Τ，C，H，G，Q或P;優(yōu)選X3=F,I，V或L;X4=R或C;X5=I,L，W，Μ，V或F;優(yōu)選X5=L或I;X6=I,L或W;優(yōu)選X6=I;X7=R,L，T*C;X8=K,V,F，L,C，Y，I，R，N或W;優(yōu)選X8=Y,F，W，V或L;X9=G,C，Y，L，F(xiàn)，W或V;優(yōu)選X9=G或F;X10=I,W，F(xiàn)或R;優(yōu)選X10=W或I;X11=I,L,F或V;優(yōu)選X11=L;X12=I,L，F(xiàn)，T或V;優(yōu)選X12=L;X13=K,I，S，L或R;優(yōu)選X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I，L，F(xiàn)或K;優(yōu)選X15=L;X16=G,I，S，L，R，F(xiàn)，T，C或V;優(yōu)選X16=I,F或L;其中該氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一'I"生。4.權(quán)利要求1-3任一項的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有至少60%的同一性，優(yōu)選與SEQIDNO:1的氨基酸I到18具有至少65%的同一性，至少70%的同一性，至少75%的同一性，或至少80%的同一性。5.權(quán)利要求1-4任一項的多肽，包含SEQIDNO:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸序列。6.權(quán)利要求1-4任一項的多肽，由SEQIDNO:5到SEQIDNO:114的任一序列的氨基酸序列組成。7.多核苷酸，其具有編碼權(quán)利要求1-6的任一項所定義的多肽的核苷酸序列。8.核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求7中定義的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接到一種或多種指導(dǎo)所述多肽在合適的宿主中生產(chǎn)的控制序列。9.包含權(quán)利要求8中所定義的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。10.包含權(quán)利要求8中所定義的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。11.生產(chǎn)如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的多肽的方法,該方法包括:(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求10所定義的重組宿主細(xì)胞'及(b)回收該多肽。12.包含如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽的組合物。13.權(quán)利要求12的組合物，其還包含附加的殺生物劑。14.殺死微生物細(xì)胞或抑制其生長的方法，包括將微生物細(xì)胞與如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽相接觸。15.去污劑組合物，包含表面活性劑和如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽。16.如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽，其用作藥物。17.如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽，其用作獸用或人用抗微生物治療劑或預(yù)防劑。18.如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽在制備用于治療微生物感染或預(yù)防用途的獸用或人用治療劑中的用途。19.如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽用于殺死微生物細(xì)胞或抑制其生長的用途。20.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化。21.至少一種如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽在動物飼料中的用途。22.至少一種如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽在制備用于動物飼料的組合物中的用途。23.動物飼料添加劑，包含:(a)至少一種如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽，和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(C)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或(e)至少一種大量礦物質(zhì)。24.權(quán)利要求23的動物飼料添加劑，還包含肌醇六磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶和/或葡聚糖酶。25.動物飼料組合物，具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并包含至少一種如權(quán)利要求1-6的任一項所定義的抗微生物多肽。全文摘要本發(fā)明涉及抗微生物多肽，具體地涉及具有抗微生物活性的多肽和具有編碼這些多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，包含該核酸構(gòu)建體的載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用這些多肽的方法。文檔編號C12N1/15GK103214558SQ20131013398公開日2013年7月24日申請日期2005年5月3日優(yōu)先權(quán)日2004年5月4日發(fā)明者漢斯-亨里克.K.霍根豪格,珀.H.邁金德,多羅蒂.R.塞古拉,奧利維爾.泰博利厄,卡斯坦.P.松克森申請人:諾維信阿德寧生物技術(shù)公司