專利名稱：副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基的制作方法
副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)能引起豬的多發(fā)性衆(zhòng)膜炎和關(guān)節(jié)炎。該菌十分嬌嫩，對培養(yǎng)基要求相對苛刻，生長依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)，不需要X因子(血紅素和其它卟啉類物質(zhì))，生長速度極其緩慢，體外培養(yǎng)保存易死亡，在鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)72h以上，才能長出針尖大小菌落，HPS極容易被忽略或被其他菌掩蓋。
副豬嗜血桿菌對冰凍、熱都敏感，分離細菌的樣品，如關(guān)節(jié)液、胸腔積液等采集時需立即接種培養(yǎng)基，否則分離培養(yǎng)往往不能成功，但在實際工作中到現(xiàn)場采集立即接種培養(yǎng)基的是很少一部分，畜主或基層獸醫(yī)人員采集樣品往往需要冷藏或冰凍一段時間后送到實驗室或通過運輸?shù)姆绞酵端?，樣品到達后分離培養(yǎng)出菌率較低。因此，分離培養(yǎng)該菌時遇到了很大的困難。
目前報道使用進口的TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)和TSB (胰蛋白胨大豆肉湯)作為分離副豬嗜血桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基營養(yǎng)極其豐富，HPS在這些培養(yǎng)基上生長速度較快。如果把其作為運輸副豬嗜血桿菌可疑樣品的培養(yǎng)基，由于可疑樣品可能還存在大腸桿菌、鏈球菌等菌，這些菌種在TSA或TSB上生長速度遠比副豬嗜血桿菌生長快得多，短時間內(nèi)就能把培養(yǎng)基的養(yǎng)分消耗完，且其生長產(chǎn)生的廢物能把副豬嗜血桿菌殺死。因此，TSA和TSB并不適合作為運輸可疑樣 品的培養(yǎng)基，也不適合作為保存副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基。臨床上迫切需要一種適合運輸副豬嗜血桿菌可疑樣品的培養(yǎng)基。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，由以下制備方法制備而成，其制備方法包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備、輔酶A處理和培養(yǎng)基的完善，具體步驟如下: 1)所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備 A、將基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分iri6g/L(重量/體積計，下同)蛋白胨、4^g/L胰蛋白胨、4 5g/L氯化鈉、2 3g/L葡萄糖、r6g/L酵母浸出液和13 18%。(按體積比計，下同)甘油，余量蒸餾水混合； B、將A步驟獲得的混合液加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解； C、將B步驟中獲得的溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2 ； D、將C步驟獲得的溶液分裝，在121°C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液； 2)所述的輔酶A處理 取0.ΙΟ.16g/L輔酶A，用8 12%。無菌水稀釋過濾除菌； 3)培養(yǎng)基的完善每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，r5°C保存?zhèn)溆谩?br> 以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為5g/L、葡萄糖為2g/L、酵母浸出液為5g/L和甘油為15%。。
以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為14g/L、胰蛋白胨為6g/L、氯化鈉為5g/L、葡萄糖為2g/L、酵母浸出液為5g/L和甘油為15%。。
以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液是的組分蛋白胨為16g/L、胰蛋白胨為4g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為4g/L和甘油為13%。。
以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為6g/L和甘油為18%。。
以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為5g/L、葡萄糖為2g/L、酵母浸出液為6g/L和甘油為16%。。
以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為14g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為6g/L和甘油為14%。。
以上所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為5g/L和甘油為17%。。
本發(fā)明的特點:本發(fā)明培養(yǎng)基中的蛋白胨等營養(yǎng)物質(zhì)正好滿足副豬嗜血桿菌存活的最低需要，其生長速度較慢；且本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加甘油，一方面甘油可以補充細菌生長所需的碳源；另一方面甘油是一種親水性物質(zhì)，起維持滲透壓的作用，保持細菌細胞壁的完整性作用，保證副豬嗜血桿菌存活時間較長，使運輸副豬嗜血桿菌樣品過程中維持細菌的活性，達到提高分離出菌率的目的。本發(fā)明的進步:1)便于運輸以無菌操作方式，將副豬嗜血桿菌可疑樣品菌株放入本發(fā)明培養(yǎng)基，裝于試管中，在室溫情況下，通過班車貨運的方式即可運輸，保存運輸時間為12 72h。2)提高出菌幾率本發(fā)明培養(yǎng)基作為運輸副豬嗜血桿菌可疑樣品的培養(yǎng)基，在室溫下保存運輸，到達實驗室后再進行分離培養(yǎng)，可明顯提高初次分離的副豬嗜血桿菌菌株的成功率。
具體實施方式
發(fā)明人近年來對副豬嗜血桿菌病的研究中，反復改進培養(yǎng)該細菌的流程，總結(jié)出運輸副豬嗜血桿菌可疑樣品的培養(yǎng)基，并把培養(yǎng)基送到畜主和基層獸醫(yī)人員的手上，指導他們以無菌操作的方式，將樣品放入培養(yǎng)基中，在室溫的情況下通過班車貨運的方式運送到發(fā)明人手上，到達實驗室再進行接種分離副豬嗜血桿菌，該方法提高了分離副豬嗜血桿菌的出菌率。
實施例1 取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L氯化鈉、2g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出液和15%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121 °C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.15g/L輔酶A，用10%。無菌水溶解稀釋過濾除菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保 存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例2 取14g/L蛋白胨、6g/L胰蛋白胨、5g/L氯化鈉、2g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出液和15%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121 °C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.14g/L輔酶A，用8%。無菌水溶解稀釋過濾除菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例3 取16g/L蛋白胨、4g/L胰蛋白胨、4g/L氯化鈉、3g/L葡萄糖、4g/L酵母浸出液和13%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121 °C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.15g/L輔酶A，用10%。無菌水溶解稀釋過濾出菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例4 取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、4g/L氯化鈉、3g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出液和18%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121 °C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.16g/L輔酶A，用12%。無菌水溶解稀釋過濾出菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例5 取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L氯化鈉、2g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出液和16%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121 °C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.15g/L輔酶A，用10%。無菌水溶解稀釋過濾除菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例6 取14g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、4g/L氯化鈉、3g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出液和14%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121°C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.15g/L輔酶A，用10%。無菌水溶解稀釋過濾除菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例7 取15g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、4g/L氯化鈉、3g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出液和17%。甘油，余量蒸餾水混合，加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解，將溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2，將調(diào)節(jié)好pH值的溶液進行分裝，在121 °C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；取0.15g/L輔酶A，用10%。無菌水溶解稀釋過濾除菌；每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，4 5°C保存，得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。
實施例8 將實施例1制備的培養(yǎng)基運輸分離副豬嗜血桿菌樣品時，將無菌采集的血液、關(guān)節(jié)液、胸腔積液、肺等組織樣品放入培養(yǎng)基中，裝于l(Tl5ml試管中，蓋好蓋封裝好，垂直放在合適的泡沫箱中(氣溫超過40°C時加適量的冰袋，預防溫度過高)密封好運輸。運輸中不可倒立，在室溫的情況下通過班車貨運的方式運送到發(fā)明人手上，到達實驗室后，將培養(yǎng)基接種于分離副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)基上進行分離。
實施例9 表1:使用本發(fā)明培養(yǎng)基保存運輸組織樣品與冷凍保存運輸樣品出菌效果比較
權(quán)利要求
1.一種副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:由以下制備方法制備而成，其制備方法包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備、輔酶A處理和培養(yǎng)基的完善，具體步驟如下: 1)所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備 A、將基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分iri6g/L(重量/體積計，下同)蛋白胨、4^g/L胰蛋白胨、4 5g/L氯化鈉、2 3g/L葡萄糖、r6g/L酵母浸出液和13 18%。(按體積比計，下同)甘油，余量蒸餾水混合； B、將A步驟獲得的混合液加熱至沸騰并不斷攪拌直至混合液完全溶解； C、將B步驟中獲得的溶液通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.(Γ7.2 ； D、將C步驟獲得的溶液分裝，在121°C下滅菌15 20min，冷卻后即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液； 2)所述的輔酶A處理 取0.ΙΟ.16g/L輔酶A，用8 12%。無菌水稀釋過濾除菌； 3)培養(yǎng)基的完善 每IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)液以無菌手續(xù)加入Iml輔酶A稀釋液和5ml無菌的小牛血清，混勻，將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管l(Tl5ml，r5°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為5g/L、葡萄糖為2g/L、酵母浸出液為5g/L和甘油為15%。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為14g/L、胰蛋白胨為6g/L、氯化鈉為5g/L、葡萄糖為2g/L、酵母浸出液為5g/L和甘油為15%。。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為16g/L、胰蛋白胨為4g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為4g/L和甘油為13%。。
5.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為6g/L和甘油為18%。。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為5g/L、葡萄糖為2g/L、酵母浸出液為6g/L和甘油為16%。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為14g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為6g/L和甘油為14%。。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其特征在于:所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分是蛋白胨為15g/L、胰蛋白胨為5g/L、氯化鈉為4g/L、葡萄糖為3g/L、酵母浸出液為5g/L和甘油為17%。。
全文摘要
本發(fā)明公開一種副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，其制備方法包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備、輔酶A處理和培養(yǎng)基的完善；基礎(chǔ)培養(yǎng)液包括蛋白胨、胰蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、酵母浸出液、甘油和蒸餾水，基礎(chǔ)培養(yǎng)液與輔酶A及小牛血清混合均勻即得副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基能夠保存副豬嗜血桿菌，方便運輸副豬嗜血桿菌可疑樣品，運輸過程中不會造成副豬嗜血桿菌死亡，提高該菌的分離幾率。
文檔編號C12N1/20GK103215208SQ201310135288
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者陳澤祥, 李軍, 楊威, 彭昊, 許力干, 謝宇舟, 禤雄標, 胡帥, 馬春霞, 謝永平, 潘艷 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所