專利名稱：一種鑒定野生稻抗稻瘟病基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的鑒定方法，特別涉及一種鑒定野生稻抗稻瘟病基因的方法。
背景技術(shù)：
稻瘟病是全球性的水稻最主要的病害之一，可給水稻造成11% -30%的產(chǎn)量損失，損失稻谷高達(dá)數(shù)億公斤，全球每年約值損失1.57億美元。實(shí)踐證明，利用抗性品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施的措施之一，也符合人類綠色食物的要求。然而，由于稻瘟病菌生理小種的多樣性和易變性，抗性品種連續(xù)使用3-5年后，品種的抗性就會(huì)明顯衰退。因此，尋找和篩選穩(wěn)定持久的抗病品種，尤其是從古老的地方品種和野生稻資源中發(fā)掘利用持久抗性資源，是防治稻瘟病經(jīng)濟(jì)、有效的措施，也是保證稻作穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要途徑之一。無(wú)論是常規(guī)育種，還是分子育種，研究清楚不同水稻品種所蘊(yùn)藏的基因和發(fā)現(xiàn)它們的新基因是關(guān)鍵的一步。稻瘟病抗性鑒定的方法有2種:(I)人工接種鑒定。這種方法根據(jù)選用菌株的接種方式不同，又可分為①抗譜測(cè)定，即多個(gè)菌株單個(gè)接種鑒定:②多個(gè)菌株混合接種鑒定。(2)自然誘發(fā)鑒定。人工接種鑒定的優(yōu)點(diǎn)是接種的菌株是已知的，尤其是抗譜測(cè)定能知道被鑒定品種的抗菌株頻率和抗哪些小種，這對(duì)抗病基因的鑒定、定位、以及抗性品種利用和推廣有明確的指導(dǎo)作用，通常作為精細(xì)研究時(shí)采用人工接種鑒定。自然誘發(fā)鑒定通常是在稻瘟病病區(qū)設(shè)立病圃，發(fā)病條件好，葉瘟和穗瘟鑒定都很方便，由于病圃鑒定無(wú)論是葉瘟鑒定還是穗瘟鑒定，都是多次連續(xù)侵染，因此鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性高，但它的不足在于田間稻瘟病菌是一種混合群體，鑒定的結(jié)果不知道品種抗那些小種和抗譜，通常作為傳統(tǒng)的抗病育種和大批量的抗源篩選。野生稻的抗稻瘟病性鑒定主要是通過(guò)對(duì)宿根進(jìn)行分盆種植，并利用其長(zhǎng)出的新葉進(jìn)行鑒定。但可用于移植的宿根很有限，只能滿足接種幾個(gè)稻瘟病菌生理小種的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種鑒定野生稻抗稻瘟病基因的方法，本發(fā)明方法利用離體接種具有方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，易于控制溫度、濕度等外界環(huán)境因素，故在植物抗性鑒定中應(yīng)用價(jià)值較大。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種鑒定野生稻抗稻瘟病基因的方法，包括以下具體步驟:(4)葉片的取樣:在溫室中，剪取野生稻和感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)的葉片，放入冰盒中保鮮，并帶回實(shí)驗(yàn)室，把葉片剪成長(zhǎng)5cm的片段；(5)把濾紙放入直徑為9cm培養(yǎng)皿中，并加入無(wú)菌水2ml，使濾紙變濕；把上述剪好的葉片平置于濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿放置4段葉片；在每個(gè)葉片上滴入5uL的孢子懸浮液，各接種5個(gè)點(diǎn)，并蓋上蓋子，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24-260C，相對(duì)濕度100%，黑暗培養(yǎng)24小時(shí)，然后光照培養(yǎng)，每天24小時(shí)光照,光照強(qiáng)度3400Lux/1310Lux (12h/12h)，每天觀察濾紙濕度，以保持培養(yǎng)皿內(nèi)的濕度(相對(duì)濕度為100% )，培養(yǎng)6-7天后調(diào)查發(fā)病情況。(3)發(fā)病調(diào)查及標(biāo)準(zhǔn):調(diào)查病斑大小，并以LTH為對(duì)照品種，判定抗感，病級(jí)分5級(jí)，0-2級(jí)的為抗病，3-4級(jí)的為感病。病斑分級(jí):O級(jí):無(wú)病斑；I級(jí):深棕色，病斑沒(méi)有可見(jiàn)的中心2級(jí):病斑直徑為0.1厘米，病斑小，沒(méi)有顯著的中心:
3級(jí):病斑直徑為0.2厘米，病斑小，沒(méi)有顯著的中心:4級(jí):病斑大，形成菌絲和分生孢子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明優(yōu)化了接種稻瘟病菌的方法，創(chuàng)立了更簡(jiǎn)便、大批量快速的野生稻抗稻瘟病的鑒定方法。解決了因野生稻不育率高、容易落粒，采種困難，且有程度不同的休眠性和發(fā)芽生長(zhǎng)的不一致性等造成的抗病性鑒定困難的問(wèn)題，加速了野生稻抗稻瘟病基因的鑒定及利用效率，為水稻抗性基因的發(fā)掘和抗性育種提供方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:1、供試菌株:采自云南省水稻種植區(qū)的2個(gè)稻瘟病菌株YNC08-30和YNC08-20。2、水稻的種植:野生稻(普通野生稻、藥用野生稻、疣粒野生稻)3種和感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)，LTH在30°C的培養(yǎng)箱內(nèi)催芽3天后，播于塑料育苗盒(15 X 5 X IOcm)內(nèi)，土壤為滅菌土，每品種一行播5粒，置于24_30°C溫室育苗，每盒追施尿素0.2-0.3g，3種野生稻為宿根再生植株，保存于溫室。3、稻瘟病菌株的培養(yǎng)及產(chǎn)孢:用稻谷粉瓊脂培養(yǎng)基培菌，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面時(shí)，用自來(lái)水洗去氣生菌絲，置于日光燈下約40小時(shí)促其產(chǎn)孢。用蒸餾水洗下孢子，制成孢子懸浮液(孢子濃度5 X IO6個(gè)/m)加入適量0.02% Tween-20使，并置于冰上以保持稻瘟病菌孢子的侵染活力。4、稻瘟病菌接種:(6)葉片的取樣:在溫室中，剪取野生稻的心葉，放入冰盒中保鮮，并帶回實(shí)驗(yàn)室，選取葉片中部，把葉片剪成長(zhǎng)5cm的片段；(7)稻瘟病菌的接種:把濾紙放入直徑為9cm培養(yǎng)皿中，并加入無(wú)菌水2ml，使濾紙變濕；把上述剪好的葉片平置于濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿放置4段葉片；用IOuL的移液槍取5uL前面制備好的稻瘟病菌孢子懸浮液，并點(diǎn)接種于水稻葉片上，每段葉片接種5個(gè)點(diǎn)，蓋上蓋子，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24-26°C，相對(duì)濕度100%，黑暗培養(yǎng)24小時(shí)，然后光照培養(yǎng)，12小時(shí)光照(光照強(qiáng)度3400LuX/1310LuX)，每天觀察濾紙濕度，并加2ml無(wú)菌水，以保持培養(yǎng)皿內(nèi)的濕度(相對(duì)濕度為100% )。培養(yǎng)6-7天后調(diào)查發(fā)病情況。5、接種后發(fā)病調(diào)查及標(biāo)準(zhǔn):調(diào)查接種點(diǎn)的病斑大小，并以LTH為對(duì)照品種，判定抗感。調(diào)查病級(jí)分5級(jí)，0-2級(jí)的為抗病，3-4級(jí)的為感病。病斑分級(jí):
O級(jí):無(wú)病斑；I級(jí):深棕色，病斑沒(méi)有可見(jiàn)的中心；2級(jí):病斑直徑為0.1厘米，病斑小，沒(méi)有顯著的中心；3級(jí):病斑直徑為0.2厘米，病斑小，沒(méi)有顯著的中心；4級(jí):病斑大，并產(chǎn)生菌絲 和分生孢子。
權(quán)利要求
1.一種鑒定野生稻抗稻瘟病基因的方法，包括以下具體步驟: (1)葉片的取樣:在溫室中，剪取野生稻和感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷的葉片，放入冰盒中保鮮，并帶回實(shí)驗(yàn)室，把葉片剪成片段； (2)把濾紙放入直徑為9cm培養(yǎng)皿中，并加入無(wú)菌水2ml，使濾紙變濕；把上述剪好的葉片平置于濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿放置4段葉片；在每個(gè)葉片上滴入5uL的孢子懸浮液，各接種5個(gè)點(diǎn)，并蓋上蓋子，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24-260C，相對(duì)濕度100%，黑暗培養(yǎng)24小時(shí)，然后光照培養(yǎng)，每天24小時(shí)光照，光照強(qiáng)度分別為3400LUX和1310LUX，每天觀察濾紙濕度，以保持培養(yǎng)皿內(nèi)的濕度(相對(duì)濕度為100% )，培養(yǎng)6-7天后調(diào)查發(fā)病情況， (3)發(fā)病調(diào)查及標(biāo)準(zhǔn):調(diào)查病斑大小，并根據(jù)對(duì)照品種，判定抗感，病級(jí)分5級(jí)，0-2級(jí)的為抗病，3-4級(jí)的為感病。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述(I)中把葉片剪成長(zhǎng)5cm的片段。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中(2)中光照強(qiáng)度3400Lux照射12h，1310Lux照射12h。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中(3)中病斑分級(jí)為: O級(jí):無(wú)病斑； I級(jí):深棕色，病斑沒(méi)有可見(jiàn)的中心 2級(jí):病斑直徑為0.1厘米，病斑小，沒(méi)有顯著的中心: 3級(jí):病斑直徑為 0.2厘米，病斑小，沒(méi)有顯著的中心: 4級(jí):病斑大，形成菌絲和分生孢子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定野生稻抗稻瘟病基因的方法，該方法包括從野生稻植株上剪取葉片中部并放于放有單層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿加適量的無(wú)菌水，在每個(gè)葉片上滴入5uL的孢子懸浮液，各接種5個(gè)點(diǎn)，并蓋上蓋子，將培養(yǎng)皿放入23℃的光照培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)24小時(shí)，然后光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3400Lux/1310Lux(12h/12h)，培養(yǎng)6-7天后調(diào)查病情，調(diào)查病級(jí)分5級(jí)，0-2級(jí)的為抗病，3-4級(jí)的為感??；本發(fā)明優(yōu)化了接種稻瘟病的方法，創(chuàng)立了更簡(jiǎn)便，大批量的野生稻抗性鑒定方法。解決了因野生稻不育率高、容易落粒，采種困難，且有程度不同的休眠性和發(fā)芽生長(zhǎng)的不一致性等造成的抗病性鑒定困難的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK103205501SQ20131013669
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者李進(jìn)斌, 李成云, 劉林, 楊靜 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所