專利名稱：低溫脂肪酶Lip1及其基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種低溫脂肪酶Lipl及其基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酶(LipaSe，EC 3.1.1.3)是一類在油-水界面上催化天然油脂(甘油三脂)降解為甘油和游離脂肪酸的酶，廣泛存在于植物、動物和微生物中。因?yàn)槠渚哂胁恍枰o酶就能催化正逆反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，近些年來，脂肪酶作為類脂化合物合成分解和酯交換的催化劑，已廣泛應(yīng)用于油脂水解、食品風(fēng)味和香味的改進(jìn)、皮革絹紡脫脂、生物柴油制備及添加于洗滌劑中以提聞去污能力等。目前工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶大多是中溫和高溫脂肪酶，它們大多由微生物產(chǎn)生，且基本上為胞外酶，產(chǎn)酶的最適溫度多在30°C以上，而酶的最適反應(yīng)溫度一般在40°C左右或更高，在0°C附近普遍喪失活性。目前研究的低溫脂肪酶普遍由低溫微生物分泌產(chǎn)生，酶的最適反應(yīng)溫度一般均低于40°C，而在0°C仍具高酶活。由于它們普遍具有低溫下酶活力高、抗有機(jī)溶劑等特點(diǎn)，因而成為了近年來酶學(xué)研究及工業(yè)應(yīng)用探索的一個熱點(diǎn)。生物柴油是由動植物油脂與一些短鏈醇發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成的脂肪酸酯類物質(zhì)，是一種新型的無污染的可再生能源。生物柴油的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物法，化學(xué)法使用的催化劑多為酸堿催化劑，容易造成二次污染；而生物法利用酶作為催化劑，具有反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好、反應(yīng)過程簡單易控等優(yōu)點(diǎn)；因此酶法生產(chǎn)生物柴油的研究己受到廣泛關(guān)注。由于酶法合成生物柴油一般是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，考慮到反應(yīng)底物和產(chǎn)物的易揮發(fā)性，在低溫條件下更加有利于酶反應(yīng)的進(jìn)行，并且也可同時改善生物柴油的特性(Juan等，EP1331260，2003 )。在洗滌行業(yè)，我 國的洗滌方法是以低溫洗滌為主，近來為了節(jié)省能源，歐美國家也出現(xiàn)了洗滌溫度低溫化的趨勢，中溫脂肪酶由于在低溫條件下酶活差，效率低，達(dá)不到最佳應(yīng)用效果，只有增加用量才能達(dá)到最佳應(yīng)用效果。因此理想的洗滌劑用脂肪酶是在低溫下也能充分發(fā)揮作用的脂肪酶。低溫脂肪酶的最適酶活溫度一般在40°C以下，它具有最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率等特點(diǎn)。因而在洗滌劑、生物柴油制備等工業(yè)上應(yīng)用有著中溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性。脂肪酶己從多種不同的微生物中分離，已有一些來自細(xì)菌的低溫脂肪酶，如嗜冷iPsychrobacter iimobilis產(chǎn)生的脂肪酶，最適溫度為55°C;假單胞菌sp.Bll產(chǎn)生的脂肪酶最適溫度為為45°C ;但目前還未見最適溫度低于30°C低溫脂肪酶的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種新型低溫脂肪酶Lipl，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明中低溫脂肪酶是具有SEQ ID NO:2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或與SEQ IDN0:2的氨基酸殘基序列具有至少80%的同源性且具有與SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質(zhì)，由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:2蛋白相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一目的是提供一種編碼上述低溫脂肪酶Lipl的基因。本發(fā)明中所述低溫脂肪酶Lipl的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或與SEQID N0:1的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列，且該序列編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列，或編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸序列蛋白質(zhì)的多核苷酸。本發(fā)明另一目的是提供含有低溫脂肪酶Lipl基因的重組表達(dá)載體pET28a_7i/77，將表達(dá)載體pET28a-7i/77導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，通過誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)，完成低溫脂肪酶Lipl的表達(dá)，從而為利用該表達(dá)載體制備低溫脂肪酶Lipl和其工業(yè)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。本發(fā)明另一目的是將低溫脂肪酶Lipl應(yīng)用在中長鏈的脂肪酸酯催化中，本發(fā)明采用橄欖油作為底物驗(yàn)證脂肪酶的催化活性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)現(xiàn)提供了下述技術(shù)方案:
1、低溫脂肪酶Lipl基因的獲得
(1)以耶爾森氏菌(/ersifliaenterocolitica)KMl (本實(shí)驗(yàn)室分離自昆明市肉聯(lián)廠冷庫，菌株已經(jīng)于2008年8月26日在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”保藏，保藏號為=CGMCC N0.2637)的基因組DNA為模板利用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下:
lipl Fl: 5，-GGGTTTCATATGATGTCTACAMTTCMCTTTGAAATATCCAGTCGTATTAGTT-Si
lipl Rl:5’ -CCGGAATTCTTACAGGCCTTTTGATTT-3’
在上下游引物的5’端和3’分別加入內(nèi)切酶和EcoRi酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，提取耶爾森氏菌(enterocolitica)m\的基因組DNA，并以基因組DNA為模板利用上述引物PCR擴(kuò)增得到低溫脂肪酶Lipl的基因707 ；
(2)膠回收目的基因707。2, Iipl基因的TA克隆及構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-7i/77
使用PMD18-T載體進(jìn)行TA克隆，于16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5a，用內(nèi)切酶和EcoRi酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證和PCR驗(yàn)證后，陽性克隆送去測序公司進(jìn)行測序；使用限制性內(nèi)切酶和EcoR\酶對pET28a和測序正確pMD18_7i/77載體進(jìn)行雙酶切，分別獲得5’和3’末端分別帶有內(nèi)切酶和EcoRl酶切位點(diǎn)的Iipl基因和pET28a載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物在16°C連接16h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，PCR驗(yàn)證，陽性克隆送樣測序，進(jìn)行測序比對分析，獲得大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-_/i/ /。Uipl基因的表達(dá) 制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞中，通過PCR驗(yàn)證成功得到轉(zhuǎn)化菌株，挑取單克隆接至Kan-LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)獲得種子液。按照1%接種量轉(zhuǎn)接菌液至Kan-LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2h后中加入IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)，使用LB-羅丹明B培養(yǎng)基驗(yàn)證脂肪酶活性。4、蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及低溫脂肪酶蛋白濃度的測定
利用BCA蛋白濃度測定試劑盒中的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA和待測低溫脂肪酶樣品，在酶標(biāo)儀上測定蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品在562nm (或540_595nm波長)波長下的吸光值，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光值，制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品稀釋倍數(shù)計算低溫脂肪酶樣品的蛋白濃度。5、利用Amersham公司的AKTA FPLC系統(tǒng)純化低溫脂肪酶
利用Amersham公司的AKTA FPLC系統(tǒng)純化低溫脂肪酶，獲得純度較高的低溫脂肪酶進(jìn)行后續(xù)脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)測定實(shí)驗(yàn)。6、采用橄欖油作為底物，驗(yàn)證低溫脂肪酶Lipl在中長鏈的脂肪酸酯催化中的應(yīng)用
本發(fā)明中克隆的脂肪酶·基因是首次從耶爾森氏菌enterocolitica)KMl中克隆得到的，并在大腸桿菌中(如BL21)表達(dá)，得到的基因工程菌株相對于野生型菌株可以顯著提高低溫脂肪酶的產(chǎn)量，為提高低溫脂肪酶的工業(yè)產(chǎn)量奠定了分子基礎(chǔ)。本發(fā)明對低溫脂肪酶理化性質(zhì)進(jìn)行研究，提供了該低溫脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中的多種用途，該基因表達(dá)產(chǎn)物一低溫脂肪酶Lipl相對其他中溫脂肪酶具有最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率、具有良好的活性和穩(wěn)定性，最適作用溫度為25°C，作用pH值為7.5，能夠有效的節(jié)約能源，可應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)和其他工業(yè)過程中；通過以橄欖油作為底物的中長鏈脂肪酸酯催化活性驗(yàn)證，證明了該低溫脂肪酶具有催化中長鏈脂肪酸酯的活性，可以運(yùn)用于該類酯的催化反應(yīng)。


圖1是本發(fā)明低溫脂肪酶基因的克隆產(chǎn)物電泳示意圖，圖中:M是M-marker ;泳道I是有信號肽引物的克隆產(chǎn)物707 ；
圖2是本發(fā)明克隆基因及表達(dá)載體雙酶切結(jié)果示意圖，圖中:M是M-marker ;泳道2是有信號肽的克隆產(chǎn)物Iipl ;泳道3是pET28a質(zhì)粒；
圖3是本發(fā)明SDS-PAGE檢測表達(dá)蛋白結(jié)果示意圖，圖中:M是M-marker ;泳道2是克隆基因Iipl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的上清；4是誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的沉淀；
圖4是本發(fā)明羅丹明B平板驗(yàn)證脂肪酶酶活結(jié)果示意圖，圖中:3是克隆基因Iipl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的上清-Allipl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的沉淀；
圖5是本發(fā)明SDS-PAGE檢測表達(dá)蛋白與對照結(jié)果示意圖，圖中:M是M-marker ;泳道I是未加誘導(dǎo)劑表達(dá)產(chǎn)物的沉淀；2是未加誘導(dǎo)劑表達(dá)產(chǎn)物的上清；3是克隆基因Iipl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的沉淀；4是克隆基因Iipl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的上清；5是原菌發(fā)酵液對照；6是空載pET28a上清對照；7是空載pET28a沉淀對照；
圖6是本發(fā)明SDS-PAGE檢測純化效果示意圖，圖中:M是M-marker ;泳道I是未加誘導(dǎo)劑對照；2是未純化的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的上清；3是純化后蛋白5 ul上樣量；4是純化后蛋白10 ul上樣量；5是未掛上柱子雜蛋白；
圖7是本發(fā)明誘導(dǎo)表達(dá)低溫脂肪酶蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖8是本發(fā)明不同反應(yīng)溫度對脂肪酶活力的影響結(jié)果示意 圖9是本發(fā)明溫度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響結(jié)果示意 圖10是本發(fā)明不同pH對脂肪酶活力的影響結(jié)果示意 圖11是本發(fā)明PH對脂肪酶穩(wěn)定性的影響結(jié)果示意 圖12是本發(fā)明不同鹽離子和EDTA對脂肪酶活性的影響結(jié)果示意圖，其中I是對照；2是 NaCl ;3 是 KCl ;4 是 CaCl2 ；5 是 MgCl2 ;6 是 BaCl2 ;7 是 ZnCl2 ;8 是 MnCl2 ;9 是 CuCl2 ；10是 NiCl2 ；11 是EDTA ；
圖13是本發(fā)明低溫脂肪酶水解長鏈脂肪酸(以橄欖油為底物)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。本實(shí)施例中采用的試劑主要為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP等為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，大腸桿菌DH5 α為TakaRa有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自于上海生工生物技術(shù)有限技術(shù)公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，儀器均為分子生物學(xué)及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。所有引物 序列合成和基因測序均在上海生工生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例1:低溫脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及純化
1、PCR擴(kuò)增編碼低溫脂肪酶Lipl的基因
采用CTAB法提取耶爾森氏菌(/ersiflia en terocoli tica ) KMl總DNA,具體操作如下:
(1)于無菌條件下，按照1%的接種量接入耶爾森氏菌enterocoli tica )KM1至5 ml
新鮮液體培養(yǎng)基中，15°C搖床恒溫大幅振蕩培養(yǎng)15小時；培養(yǎng)液0D_吸光值約1.0左右，取3ml菌液以4000 X g離心10 min收集菌體，用567 μ I的TE緩沖液重懸菌體沉淀；
(2)加入30μ I的10%的SDS和3 μ I的20mg/ml的蛋白酶K，充分混勻后置于37°C恒溫溫育I小時；
(3)加入100μ I的5 mo I/L的NaCl溶液和80 μ I的CTAB/NaCl溶液，充分混勻后再置于65°C恒溫溫育IOmin ；
(4)加入等體積的氯仿/異戊醇，輕搖混勻后，經(jīng)6000Xg離心10 min ；
(5)用槍頭小心吸取上層清水相，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I)混合溶液，輕搖混勻后，以6000 Xg離心10 min ；
(6)重復(fù)上一步操作直至蛋白雜質(zhì)完全被析出；
(7)小心吸取上層親水相，加入1/10倍體積的3M乙酸鈉與預(yù)冷的無水乙醇，于_80°C冰箱靜置30min后，經(jīng)12000 X g，4°C，離心15min，棄上清；加入70%乙醇洗滌DNA沉淀，以12000 Xg，4°C離心2min，棄上清，重復(fù)洗滌一次，將離心管敞口放置于室溫10 20 min,用適量的dd H2O溶解沉淀后保存?zhèn)溆?。以耶爾森氏?Yersinia en terocoli ti ca) KMl的基因組DNA為模板,利用引物L(fēng)ipl Fl (含信號肽)、Lipl Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，本實(shí)施例所用的引物序列如下:
Lipl Fl:GGGTTTCATATGATGTCTACAAATTCAACTTTGAAATATCCAGTCGTATTAGTTLipl Rl:CCGGAATTCTTACAGGCCTTTTGATTT
2、表達(dá)載體的構(gòu)建
使用PMD18-T載體進(jìn)行TA克隆，連接體系為0.5μ1 pMD18_T載體，3ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物lipl, 2.5μ1的Τ4 DNA連接酶于16°C過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18_7i/77。熱刺激法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pMD18-h>7于感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α中，涂布于Amp-LB平板37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果后，陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序。使用限制性內(nèi)切酶和EcoR\酶分別對pET_28a載體和測序正確pMD18_7i/77載體進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果見圖2，分別獲得5’和3’末端分別帶有和EcoRl酶切位點(diǎn)的Iipl基因和p ET-28a載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收。按照目的基因:載體=5:1 (摩爾比)加樣，然后加入T4 DNA連接酶在16°C連接16h ;將感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α 50μ1加入6μ1連接產(chǎn)物中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s后冰浴2min，加入400μ1的LB培養(yǎng)基；37°C搖床200rpm培養(yǎng)60min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后吸取200μ1培養(yǎng)液涂布在含有卡那霉素(Kan)抗性的LB平板上；37°C過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落，接種到卡那霉素Kan+LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果；陽性克隆送去上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證插入基因的正確性，獲得重組表達(dá)載體pET28a-7i/77，該表達(dá)載體含有Iipl基因。3、轉(zhuǎn)化、篩選以及測序驗(yàn)證
用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體pET28a-7i/77轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，具體方法為:在50μ1大腸桿菌疋coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中加入 μ 重組表達(dá)載體pET28a_7i/77混合均勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s后冰浴2min，加入400μ1的LB液體培養(yǎng)基；37°C搖床200rpm培養(yǎng)60min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后吸取200μ1培養(yǎng)液涂布于含有卡那霉素(Kan)抗性的LB平板上，于37°C過夜培養(yǎng)；用含有卡那霉素(Kan) (50μ g/ml)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取單克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證。Lipl編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；低溫脂肪酶Lipl蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，證明構(gòu)建的質(zhì)粒及重組菌正確，將陽性克隆記作BL21-pET-Zi/77，陽性質(zhì)粒記作pET-Zi/77。4、低溫脂肪酶的表達(dá)
挑取BL21-pET-Zi/77單菌落接入含有卡那霉素(Kan)(50 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物按照1%接種量接種于IL含有卡拉霉素(Kan)(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基，37°C劇烈振蕩(200rpm)培養(yǎng)，至發(fā)酵液的OD6tltl值達(dá)到0.6-0.8左右，向發(fā)酵體系中加入IPTG(終濃度0.5mM)，30°C培養(yǎng)6小時；5000rpm離心15min,收集菌體；用pH7.5 Tris-Cl緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后12，OOOrpm離心15min ；SDS-PAGE檢測蛋白，LB-羅丹明B培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基中加入羅丹明B至終濃度為0.1% (V/V))驗(yàn)證脂肪酶酶活，酶活驗(yàn)證表明克隆基因Iipl重組表達(dá)產(chǎn)物的上清具有脂肪酶活性，收集上清液，即為含有目的蛋白的粗酶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，泳道2 (克隆基因707重組表達(dá)產(chǎn)物的上清)和4 (克隆基因707重組表達(dá)產(chǎn)物的沉淀)均有新的蛋白條帶出現(xiàn)，且其蛋白分子量與理論推定的融合蛋白值35KDa基本相符，但泳道4的蛋白可能是以包涵體的形式存在，無脂肪酶活性；進(jìn)一步通過LB-羅丹明B培養(yǎng)基驗(yàn)證脂肪酶活性，結(jié)果見圖4，樣品3 (克隆基因Upl重組表達(dá)產(chǎn)物的上清)在LB-羅丹明B平板上能形成明顯的水解圈，而樣品4 (克隆基因Iipl重組表達(dá)產(chǎn)物的沉淀)未在平板上形成水解圈，進(jìn)一步證明克隆基因Iipl重組表達(dá)產(chǎn)物的上清具有脂肪酶活性而沉淀沒有脂肪酶活性。通過設(shè)置未添加誘導(dǎo)劑IPTG的表達(dá)產(chǎn)物和空載體pET28a (即不含有脂肪酶的克隆基因lipl)的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為對照，來驗(yàn)證誘導(dǎo)劑的作用及含有脂肪酶的克隆基因Hpl的表達(dá)載體能夠提高脂肪酶的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，泳道I和2為沒有添加誘導(dǎo)劑的表達(dá)產(chǎn)物的上清和沉淀，通過SDS-PAGE圖可以看出，在理論推定的融合蛋白值(35KDa)處，上清和沉淀均有少量蛋白出現(xiàn)，但與加了誘導(dǎo)劑的表達(dá)產(chǎn)物(泳道3和4)相比，蛋白量很少，說明添加誘導(dǎo)劑能明顯提高蛋白表達(dá)量；空載體pET28a誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物(泳道6和7)也出現(xiàn)了極少量蛋白，但與含有有脂肪酶的克隆基因Iipl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物(泳道3和4)相t匕，可以通過設(shè)置對照的方法來消除干擾。因此，通過實(shí)驗(yàn)可以說明含有低溫脂肪酶基因的表達(dá)載體可以用于制備低溫脂肪酶Lip I，且表達(dá)量較高。5、低溫脂肪酶的純化
采用鎳親和層析柱進(jìn)行純化，在Amersham公司的AKTA FPLC系統(tǒng)中用Iml裝量的HiTrap chelating HP column (鎳柱)純化上清,非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I用于平衡純化柱體和上樣；蛋白上樣量為10ml，流速設(shè)為lml/min ;用20%非變性鎳柱洗脫緩沖液(B卩非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為80:20)進(jìn)行洗滌，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。用80%非變性鎳柱洗脫緩沖液(S卩非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為20:80)進(jìn)行洗脫，收集含洗脫峰的洗脫液，SDS-PAGE檢測洗脫液中樣品純度，純化結(jié)果見圖6，從圖中可看出，通過鎳親和層析柱的純化，蛋白濃度提高了大約I倍以上(泳道2和3的上樣量相同，但蛋白含量明顯提高了約I倍)。其中:非變性鎳 柱結(jié)合緩沖液1:0.05 M Tris-Cl緩沖液，0.5 M氯化鈉，pH7.5 ；
非變性鎳柱洗脫緩沖液I1:0.05 M Tris-Cl緩沖液，0.5 M氯化鈉，0.5 M咪唑，pH
7.5。實(shí)施例2:低溫脂肪酶酶液的酶活檢測
1、純化后蛋白濃度測定，采用BCA試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白濃度。蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法:
(1)采用梯度稀釋的方法，準(zhǔn)確稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)樣品(原濃度2000ug/ml)，分別得到濃度為 Oug/ml (空白對照)、25ug/ml、125ug/ml、250ug/ml、500ug/ml、750ug/ml 及 1000ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品；同時稀釋待測樣品至不同濃度(根據(jù)酶標(biāo)儀的有效讀數(shù)范圍確定);
(2)根據(jù)測定樣品的數(shù)量，按照50/1比例混合A液和B液(試劑盒自帶)配制成工作液；
(3)在96孔板各孔中加入20ul不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品及空白對照，每孔加入200 ul工作液，于37°C放置30 min ；
(4)在酶標(biāo)儀上測定540nm下的吸光度；
(5)根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光值，制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品稀釋倍數(shù)計算樣品的蛋白濃度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7，根據(jù)圖可得出蛋白濃度與吸光度OD5一之間的方程:y =0.3519x - 0.0001，R2 = 0.9992，同時測得待測樣品低溫脂肪酶的蛋白濃度為:2.147mg/ml ο2、脂肪酶酶活的測定
脂肪酶酶活的測定采用堿式滴定法，具體操作如下:
(1)酶活定義:在試驗(yàn)條件下，每毫升酶液每分鐘催化底物釋放出Iymol的游離脂肪酸，定義為一個脂肪酶活力單位(U)；
(2)本實(shí)施例中使用的橄欖油乳化液為3%(W/V)的聚乙烯醇與橄欖油按3:1 (V/V)的比例混合，然后在乳化機(jī)中最大轉(zhuǎn)速3分鐘/次進(jìn)行乳化，重復(fù)3次，直至聚乙烯醇與橄欖油的混合液靜置數(shù)分鐘后不分層為止；
(3)對照組:同時將空載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選驗(yàn)證，得到含有空載體pET-28a (+)的陽性克隆，記作BL21-pET-28a (+)，作為對照菌，按照上述步驟將對照菌進(jìn)行酶的表達(dá)和純化，對純化得到的液體進(jìn)行酶活檢測；
(4)實(shí)驗(yàn)方法:取4個IOOml的潔凈燒杯，編號1_4(其中I為對照，2_4為三個平行)，每個燒杯中分別加入5ml的50 mM pH7.5的Tris-Cl緩沖液和4ml的橄欖油乳化液，于25°C恒溫水浴搖床中溫浴IOmin后，I號燒杯中加入Iml對照酶液(空載表達(dá)產(chǎn)物),2-4號燒杯加入Iml的酶液(2ug/ml)，于25°C恒溫水浴搖床中持續(xù)振蕩反應(yīng)lOmin，隨后加入15ml 95%的無水乙醇終止反應(yīng),每個燒杯中加入25 μ I的1%酚酞指示劑，用50 mM NaOH溶液進(jìn)行堿式滴定，分別記錄滴定前和滴定后滴定管的刻度，計算所消耗的NaOH溶液體積，根據(jù)酶活計算公式計算脂肪酶的酶活；
(5)酶活計算公式:酶活力單位
權(quán)利要求
1.一種低溫脂肪酶Lipl，其特征在于:所述低溫脂肪酶Lipl的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述低溫脂肪酶Lipl的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低溫脂肪酶Lipl基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.含有權(quán)利要求2所述低溫脂肪酶Lipl基因的表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求4所述低溫脂肪酶Lipl基因的表達(dá)載體在制備低溫脂肪酶Lipl中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要 求1所述的低溫脂肪酶Lipl在中長鏈脂肪酸酯催化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低溫脂肪酶及其基因，該低溫脂肪酶氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其基因來源于昆明市屠宰場冷庫的耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)KM1，本發(fā)明利用含該酶基因的重組表達(dá)載體制備低溫脂肪酶，該表達(dá)載體制得的低溫脂肪酶在低溫條件具有良好的活性和穩(wěn)定性，最適作用溫度為25℃，作用pH值為7.5，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、生物柴油制備等工業(yè)領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/20GK103194433SQ20131013741
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者魏云林, 王寶強(qiáng), 季秀玲, 林連兵, 張琦 申請人:昆明理工大學(xué)