專利名稱：含有天然膽固醇和賴氨酸類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子及其脂質(zhì)體、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成脂質(zhì)體基因輸送功能載體材料領(lǐng)域，特別涉及一種由天然膽固醇和賴氨酸合成的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子及其脂質(zhì)體的制備方法及其作為小分子干擾RNA(SiRNA)轉(zhuǎn)染試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，基因治療(Gene Therapy)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)工程研究與應(yīng)用領(lǐng)域的新興研究熱點(diǎn)，其核心是將具有一定治療作用的基因片段通過基因輸送途經(jīng)導(dǎo)入人體靶細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，以糾正致病的基因缺陷，從而達(dá)到治療疾病的目的。這些導(dǎo)入的治療基因包括DNA、RNA等，其中基于小分子干擾RNA(SiRNA)技術(shù)的基因治療方法近年來引起了人們的極大興趣。與傳統(tǒng)的DNA基因治療相比，其方法優(yōu)點(diǎn)在于=SiRNA無需穿越核膜屏障進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行整合表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中就能方便、快速、且特異性與信使RNA(mRNA)結(jié)合，進(jìn)而抑制結(jié)合mRNA的翻譯表達(dá)，起到基因調(diào)控和治療的效果；另一方面，SiRNA可由人工合成制備得到，有利于其有效基因序列的篩選和優(yōu)化，由于其起效快，在治療過程中SiRNA給藥的時(shí)間間隔也靈活可控。因此，通過SiRNA輸送進(jìn)行基因治療的相關(guān)技術(shù)近年來得到了迅速的發(fā)展，而促使SiRNA基因高效輸送的相關(guān)功能載體材料的研究成為生命科學(xué)和材料科學(xué)交叉領(lǐng)域最為活躍的研究方向之一。據(jù)國(guó)內(nèi)外已有的研究報(bào)道，病毒以外作為SiRNA基因輸送的載體大多為合成陽離子有機(jī)功能分子、高分子，其實(shí)現(xiàn)基因負(fù)載與輸送的原理為利用載體陽離子功能分子、高分子中質(zhì)子化氨基官能團(tuán)的正電荷(+)與SiRNA基因序列中磷酸基團(tuán)所攜帶的負(fù)電荷(-)的靜電相互作用，結(jié)合組裝形成穩(wěn)定的聚集體納米復(fù)合物粒子(Polyplex)，保護(hù)所負(fù)載的SiRNA不易被細(xì)胞內(nèi)外的核酸酶降解，同時(shí)可提高聚集復(fù)合體粒子在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)提高SiRNA基因轉(zhuǎn)染的 效率。然而，到目前為止，雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)報(bào)道了多種陽離子功能分子如陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體等，并作為載體應(yīng)用于體外或體內(nèi)細(xì)胞/組織水平的SiRNA輸送與轉(zhuǎn)染研究，但仍然存在著一系列科學(xué)和技術(shù)問題，如大多數(shù)脂質(zhì)陽離子功能分子在血液循環(huán)環(huán)境中不穩(wěn)定，容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬后被肝、脾等器官清除。同時(shí)，在脂質(zhì)陽離子介導(dǎo)的SiRNA基因輸送研究中發(fā)現(xiàn)，許多陽離子聚合物具有免疫原性，刺激、誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)急反應(yīng)，從而導(dǎo)致毒副作用。以上這些因素限制了陽離子功能分子在SiRNA基因治療中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，如何改善合成基因載體的生物相容性、減低毒性及增強(qiáng)SiRNA基因的輸送與轉(zhuǎn)染效果，具有重要的研究和實(shí)用價(jià)值。目前，研究采用具有生物相容性的脂質(zhì)化合物構(gòu)建新型陽離子生物載體成為合成功能脂質(zhì)分子研究開發(fā)應(yīng)用的重要方向之一。膽固醇是一種具有重要生理活性的天然甾體化合物，其在動(dòng)物體內(nèi)多種脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中(如低密度脂蛋白LDL)以自由分子或者化學(xué)鍵合形態(tài)廣泛存在，具有較強(qiáng)的疏水性和良好的生物相容性。因此，充分利用膽固醇類天然產(chǎn)物的疏水性分子骨架結(jié)構(gòu)，通過進(jìn)一步化學(xué)偶聯(lián)水溶性陽離子片段，可合成制備新型脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，降低合成脂質(zhì)陽離子的細(xì)胞毒性，其不僅有可能應(yīng)用作為新型生物相容性基因載體，同時(shí)也是一類潛在的生物相容性藥物輸送輔助劑。近年來，國(guó)內(nèi)外合成報(bào)道了多種由天然膽固醇衍生的陽離子脂質(zhì)，如膽固醇胺鹽(J.Med.Chem.2007, 50，2432)、膽固醇取代胺類(Bioorg.Med.Chem.Lett.2009, 19，2986)等，這些合成陽離子脂質(zhì)作為藥物和基因輸送載體得到了廣泛的研究(Mol.Pharm.2012，9，3579)。一些基于天然膽固醇的陽離子脂質(zhì)表現(xiàn)出了良好的藥物和基因負(fù)載、可控緩釋以及基因輸送與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效果，提高了載體與藥物或基因復(fù)合納米粒子(NP)的細(xì)胞內(nèi)攝入能力。在此基礎(chǔ)上，人們又相繼合成了由核苷酸或氯喹修飾的膽固醇衍生物陽離子脂質(zhì)，發(fā)展更為有效可控的基因輸送載體體系。在相關(guān)前期的工作中，申請(qǐng)者發(fā)現(xiàn)了系列基于二硫鍵的膽固醇脂質(zhì)基因載體(Biomaterials2011, 11, 3507;中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01010182428.4)，并發(fā)現(xiàn)二硫化學(xué)鍵的引入對(duì)降低合成脂質(zhì)載體的細(xì)胞毒性具有重要作用。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)了系列基于天然生物相容性膽固醇的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，作為基因轉(zhuǎn)染試劑(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110040189.3)并成功應(yīng)用于質(zhì)粒DNA的高效細(xì)胞轉(zhuǎn)染。然而，上述作為基因輸送載體的合成膽固醇類脂質(zhì)大多集中應(yīng)用于質(zhì)粒DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面，用于SiRNA轉(zhuǎn)染的比較少。因此，研究和開發(fā)生物相容性、高效和低細(xì)胞毒性的膽固醇類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，進(jìn)一步拓展其作為小分子干擾SiRNA功能載體的應(yīng)用，對(duì)于開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物功能載體材料具有重要意義，其也是本發(fā)明所致力解決的目標(biāo)。

發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子。本發(fā)明的目的之二是提供上述一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的合成方法。本發(fā)明的目的之三是含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子用于制備含有天然膽固醇和賴氨酸的脂質(zhì)體及其它們的制備方法。本發(fā)明的目的之四是提供一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)體作為SiRNA基因輸送載體功能材料的用途。根據(jù)本發(fā)明所提供的一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可由通式(I)表示:
權(quán)利要求
1.一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可由通式(I)表示:
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1中所述的含有天然膽固醇和氨基酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的合成方法，其特征是由以下兩個(gè)步驟組成: 第一步:將烷基二醇溶于充分脫水干燥的有機(jī)溶劑中，在堿催化下緩慢滴加到事先溶于有機(jī)溶劑的膽固醇氯甲酸酯中，于O 50°C攪拌反應(yīng)12 24h中間體膽固醇單取代二醇碳酸酯；上述反應(yīng)中，堿、烷基二醇和膽固醇氯甲酸酯的摩爾比為0.05 0.1:4.0 6.0:1.0 ； 第二步:將BOC保護(hù)的天然賴氨酸砌塊化合物溶于脫水干燥的有機(jī)溶劑中，在堿催化下緩慢滴加到溶于有機(jī)溶劑的第一步驟制備所得的中間體膽固醇單取代二醇中，加入一定量的縮合劑后于O 50°C攪拌反應(yīng)12 24h，蒸餾除去有機(jī)溶劑，進(jìn)行柱層析；然后產(chǎn)品溶于過量酸中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)I 2h，加醚沉淀后過濾干燥得到含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子；上述反應(yīng)中，BOC保護(hù)的天然賴氨酸砌塊化合物與膽固醇單取代二醇碳酸酯中間體的摩爾比為1.0:1.0 1.5 ; 所述的堿是三乙胺、氨水、碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、吡啶或4- 二甲氨基吡啶；所述的烷基二醇是丁二醇或戊二醇；所述的縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺或羰基二咪唑；所述的過量酸為鹽酸、磷酸、甲磺酸或三氟乙酸；所述的醚為乙醚、丙醚、異丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚或甲基乙烯基醚；所述的BOC是碳酸二叔丁酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的一種含有天然膽固醇和氨基酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的合成方法，其特征是步驟(一)中，所述的產(chǎn)物經(jīng)過蒸餾除去有機(jī)溶劑；然后用有機(jī)溶劑柱層析分離純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的一種含有天然膽固醇和氨基酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的合成方法，其特征是步驟(一)和(二)中，所述的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、四氫呋喃、1,4- 二氧六環(huán)、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、N, N- 二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯；所述柱層析所用的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈或它們的混合溶劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的一種由天然膽固醇和氨基酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的合成方法，其特征是步驟(一)中的反應(yīng)溫度為O 50°C ;所述步驟(二)中的反應(yīng)溫度為O 50°C。
6.一種如權(quán)利要求1所述的含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的應(yīng)用，其特征是用于制備SiRNA轉(zhuǎn)染試劑。
7.如權(quán)利要求6所述的一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的應(yīng)用，其特征是采用如權(quán)利要求1所述的含有天然膽固醇和賴氨酸的功能分子為制備原料，與二油酰磷脂酰乙醇胺混合制備脂質(zhì)體制備含有天然膽固醇和賴氨酸的脂質(zhì)體。
8.如權(quán)利要求7所述的一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的應(yīng)用，其特征是稱取如權(quán)利要求1所述的含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子，然后加入摩爾比為1:1的二油酰磷脂酰乙醇胺與之混合，再將該混合脂質(zhì)充分溶解于色譜級(jí)氯仿溶液中，二者的氯仿體積/混合脂質(zhì)摩爾比為100 200:1 ;隨后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿溶劑，形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜后，加入去離子水，去離子水和脂質(zhì)薄膜的體積/摩爾比為100 200:1，超聲水化0.5h Ih后得到一種含有天然膽固醇和賴氨酸的脂質(zhì)體。
9.一種如權(quán)利要求7或8所述的一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子的應(yīng)用，其特征是所述的含有天然膽固醇和賴氨酸的脂質(zhì)體作為制備小分子干擾RNA基因輸送載體的應(yīng)用 。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染生物試劑領(lǐng)域，特別涉及一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)陽離子有機(jī)功能分子及其脂質(zhì)體、制備方法和其作為小分子干擾RNA(SiRNA)轉(zhuǎn)染試劑的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的一種含有天然膽固醇和賴氨酸的類脂質(zhì)功能分子，合成方法簡(jiǎn)單且效率高，其與輔助脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)復(fù)合形成的脂質(zhì)體制備方法簡(jiǎn)便，易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苽?。作為SiRNA基因轉(zhuǎn)染試劑，本發(fā)明提供的一種含有天然膽固醇和賴氨酸的脂質(zhì)體與市售商品化基因轉(zhuǎn)染試劑bPEI-25k相比具有明顯較低的細(xì)胞毒性，且具有相對(duì)高效的SiRNA基因轉(zhuǎn)染效果，可以作為新型類脂質(zhì)基因載體功能試劑在SiRNA的轉(zhuǎn)染中得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/88GK103214541SQ20131013899
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者曹阿民, 盛瑞隆, 陳劍, 徐宇虹, 王昭, 田曉婧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所