專利名稱：一種合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種合成Y-聚谷氨酸的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
y -聚谷氨酸(Poly- Y -glutamic acid, Y -PGA)是一種由 D-或 L-谷氨酸通過α-氨基和Y-羧基形成Y-酰胺鍵結(jié)合而成的陰離子聚合物。Y-PGA是一種水溶性可生物降解的新型綠色生物材料，具有可食用性、無毒性、成膜性、粘結(jié)性、保濕性等特點(diǎn)，其應(yīng)用非常廣泛，既可以作為藥物載體、增稠劑和保濕劑用于醫(yī)藥、食品和化妝品中，又可以作為保水劑及水果、蔬菜的防凍劑、保鮮劑，還可以作為水處理的絮凝劑和重金屬螯合劑等。隨著人們環(huán)保意識日益增強(qiáng)，Y-聚谷氨酸作為可生物降解高分子材料已備受關(guān)注。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶( glutamyltranspeptidase,GTP,EC2.3.2.2),又稱谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于微生物、植物以及動(dòng)物體內(nèi)。GTP可以催化以下三類反應(yīng):當(dāng)催化反應(yīng)的受體是氨基酸(或肽)時(shí)，形成Y-谷氨酰氨基酸或肽；當(dāng)Y-谷氨酰供體同時(shí)又是受體時(shí)，就發(fā)生自身轉(zhuǎn)肽反應(yīng)；當(dāng)親核試劑是水時(shí)，最終的結(jié)果為水解反應(yīng)。近年來，由于生物技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，生物催化與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中逐漸興起，利用GTP制備系列Y -谷氨酰基類化合物的研究已成為生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。已經(jīng)報(bào)道利用該酶的“ Y-谷氨?；狈磻?yīng)催化合成了谷胱甘肽、茶氨酸、Y -D-谷氨酰-L-色氨酸、7-氨基頭孢烷酸、Y -谷氨酰-?；撬岬榷喾N化合物。但到目前為止，尚未有能夠合成Y-聚谷氨酸的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，該基因編碼能夠合成Y-聚谷氨酸的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，該酶能夠以谷氨酰胺類單體為原料合成Y-聚谷氨酸，對豐富谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶家族成員，開發(fā)新的Y-聚谷氨酸合成途徑都具有重要意義。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種合成Y-聚谷氨酸的方法，利用基因工程獲取的重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y-聚谷氨酸。為了解決上述技術(shù)問題，一方面，本發(fā)明提供了一種谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白質(zhì)分子，該蛋白質(zhì)分子具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，該谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因具有編碼權(quán)利要求1中蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列。其中，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。對于具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，該序列無內(nèi)含子，具有1782bp完整的開放讀碼框，編碼593個(gè)氨基酸的多肽。另外，本發(fā)明還提供了一種獲取谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因的方法，包括如下步驟:
步驟一、提取沿海紅樹林淤泥樣品，提取起總DNA并純化；
步驟二、將純化后的總基因組經(jīng)Sau3AI酶切處理；
步驟三、將酶切產(chǎn)物連接到pUC18/BamHI (BAP)載體上，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，構(gòu)建紅樹林宏基因組文庫，用含有1-氨芐青霉素、Y -谷酰基-對硝基苯胺、葡萄糖和氨基酸復(fù)合物的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基，從文庫中篩選谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶陽性克隆，通過高通量篩選得到陽性克隆子；
步驟四、經(jīng)測序和Blast比較設(shè)計(jì)引物，以陽性克隆子的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行鏈?zhǔn)矫妇酆戏磻?yīng)，從而克隆得到如SEQ ID N0:1所示的目的片段。其中，步驟四中設(shè)計(jì)用于擴(kuò)展目的片段的引物包括:
上游引物 Fl:5’ -CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’ ；
下游引物 F2:5’ -CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’。另外，本發(fā)明還提供了一種重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的制備方法，包括如下步驟:
(1)采用如權(quán)利要求5中所述方法獲取谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，該基因具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)用上述基因目的片段經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切，與表達(dá)載體pET_32a(+)連接； (3)用表達(dá)載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞BL21，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，從培養(yǎng)物分離、純化，獲得重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。該重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶具有以谷氨酰胺類單體為原料合成Y-聚谷氨酸的作用。另外，本發(fā)明還提供了一種利用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟:
(1)采用如權(quán)利要求5中方法制備重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；
(2)將上述重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液或純化的酶液加入到谷氨酰胺溶液中，以Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)PH為7.0-8.0，在15_30°C條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)6_12h，合成γ-聚谷氨酸，并加入終止液終止Y-聚谷氨酸反應(yīng)。其中，合成的Y-聚谷氨酸的分子量大小為5 10kDa。優(yōu)選地,步驟(2)中酶催化反應(yīng)的最適溫度為20°C,最適pH值為7.0，最適底物濃度為IOM谷氨酰胺。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案應(yīng)用宏基因組技術(shù)獲得的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，該酶能夠以谷氨酰胺類單體為原料合成Y -聚谷氨酸，對豐富谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶家族成員，開發(fā)新的Y-聚谷氨酸合成途徑都具有重要意義。另外，本發(fā)明的方案還通過對該酶在合成Y -聚谷氨酸反應(yīng)中的最適條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在以谷氨酰胺單體為原料的Y -聚谷氨酸合成反應(yīng)中，本發(fā)明的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化反應(yīng)的最適溫度是20°c，最適pH值為7.0，最適底物濃度為IOM谷氨酰胺，采用上述反應(yīng)條件能夠高效、快速地合成目的產(chǎn)物Y-聚谷氨酸，并具有很好的應(yīng)用價(jià)值。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。


圖1重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶純化的SDS-PAGE電泳圖。M: Protein Marker; 1:純化后蛋白。圖2重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成的Y-聚谷氨酸的SDS-PAGE電泳圖。M: ProteinMarker; 1:重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液合成的Y -聚谷氨酸；2:純化后重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成的Y-聚谷氨酸.。圖3純化的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y-聚谷氨酸最適反應(yīng)pH值的測定結(jié)果。圖4純化的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y -聚谷氨酸最適反應(yīng)溫度的測定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因的獲得及合成Y-聚谷氨酸功能的驗(yàn)證 1、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因的獲得
從廣東省湛江市沿海紅樹林淤泥樣品，構(gòu)建紅樹林宏基因組文庫。用含有l(wèi)OOPg/ml氨芐青霉素、0.1% Y -谷酰基-對硝基苯胺、1%葡萄糖和0.5%氨基酸復(fù)合物的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基，從文庫中篩·選谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶陽性克隆。將文庫中的細(xì)胞同影印接種針復(fù)制到固體選擇性培養(yǎng)基平板上，37°C下培養(yǎng)3天，篩選菌落周圍有黃色水解圈出現(xiàn)的陽性克隆子。為了篩選出合成Y-聚谷氨酸的克隆子，挑取在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃色水解圈的克隆子，接種到IOml含lOOPg/ml氨芐青霉素和0.5mM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷的LB培養(yǎng)液中，30°C，250 r/min下培養(yǎng)24h，12000r/min離心2min收集菌體，Tris-HCl緩沖液(50mM, pH7.5)洗滌菌體二次，Tris-HCl緩沖液重新懸浮菌體，用超聲波破碎儀(Sonics公司)破碎菌體，離心收集上清(粗酶液)。取Iml粗酶液，加入I ml 20%的谷氨酰胺，2 mlTris-HCl緩沖液(50mM, ρΗ7.5)，30°C水浴12h后，加入Iml 15%醋酸溶液終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，能夠使谷氨酰胺聚合成大分子的Y -聚谷氨酸的為真陽性克隆子。通過篩選獲得一個(gè)陽性克隆子。提取上述陽性克隆子的質(zhì)粒送去測序公司進(jìn)行測序，得到一個(gè)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的核酸序列，該序列由1782個(gè)堿基組成，其核酸序列如SEQ ID N0.1所示，將其命名為ggt_015 ；該核酸編碼的多肽，含593個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，將其命名為GGT_015。2、基因片段的克隆
根據(jù)核酸ggt_015序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物:上游引物Fl:5 ’ -CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’ (下劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn)序列);下游引物 F2:5，-CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’ (下劃線為HindIII酶切位點(diǎn)序列)。以陽性克隆子的質(zhì)粒為模版，以Fl和F2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:PrimeSTAR HS DNA Ploymerase (2.5U/μ I) 0.3μ 1，5Χ 緩沖液 6 μ 1，dNTPMix (2.5mM) 2.4 μ 1，模板(lOOng/μ I) 0.6 μ 1，引物 Fl 和 F2(10 mM)各 0.3 μ I，超純水補(bǔ)足至50μ1。PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性2 min ；98 °C變性10 s，68 °C退火15 s，72 °〇延伸 1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 °C延伸 10 min, 4 °C。
將PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后用BamHI和HindIII雙酶切16，與經(jīng)過同樣處理的pET-32a(+) (Invitrogen)表達(dá)載體進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列與SEQ ID N0.1中的序列相同，能夠有效地獲取目的基因片段。3、重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶GGT_015的獲得
將含有經(jīng)測序驗(yàn)證正確質(zhì)粒的菌株接種至含lOOPg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C，250 r/min下培養(yǎng)14h，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至IOOml的含lOOPg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)生長至0D_=0.8時(shí)加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷至終濃度0.6mM,20 °C, 200 r/min下培養(yǎng)20h，12000r/min離心5min，棄上清，將菌體重懸于20ml 50mMTr1-HCl (pH7.5)中，用超聲波破碎儀破碎菌體，4°C，13000r/min離心15min，收集上清，即獲得重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。將重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液用Invitrogen公司的His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒Proband Purification system進(jìn)行純化重組蛋白，具體操作步驟按該公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。純化后的重組蛋白液氮速凍，保存至超低溫冰箱中。4、合成Y-聚谷氨酸功能的驗(yàn)證
將上述重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液Iml或純化的酶液ΙΟμΙ，加入I ml 20%的谷氨酰胺，
2ml Tris-HCl緩沖液(50mM, ρΗ7.5)，30°C水浴12h后，加入Iml 15%醋酸溶液終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，由于重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶可以將谷氨酰胺合成多肽——Y -聚谷氨酸，Y -聚谷氨酸能被考馬斯亮藍(lán)R-250染色，所以在SDS-PAGE電泳上Y-聚谷氨酸顯示藍(lán)色。結(jié)果表明，重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶GGT_015具有合成Y-聚谷氨酸的能力，且合成的Y-聚谷氨酸的分子量大小為^lOkDa (如附圖2所示)。實(shí)施例2重組谷·氨酰轉(zhuǎn)肽酶GGT_015合成Y -聚谷氨酸條件的研究
1、pH值對合成Y-聚谷氨酸能力的影響
取10μ1純化的酶液，加入Iml 20%的谷氨酰胺，分別在ρΗ6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液中，30 V下分別水浴反應(yīng)2h、4h、6h、8h，加入Iml 15%醋酸溶液終止反應(yīng)，214nm波長測定光吸收值，吸收值越大表明合成Y-聚谷氨酸的量越大。同時(shí)以滅活的酶液做對照。結(jié)果如圖3所示，GGT_015合成Y-聚谷氨酸的最適pH值為7.5 ;低于或高于此pH值，GGT_015的合成能力會(huì)相對降低。2、溫度對合成Y-聚谷氨酸能力的影響
取10μ1純化的酶液，加入Iml 20%的谷氨酰胺，2 ml Tris-HCl緩沖液(50mM,pH7.5)，分別在15°C、20°C、25°C、30°C、35°C下分別水浴反應(yīng)2h、4h、6h、8h，加入Iml 15%醋酸溶液終止反應(yīng)，214nm波長測定光吸收值。同時(shí)以滅活的酶液做對照。結(jié)果如圖4所示，GGT_015合成Y-聚谷氨酸的最適溫度為20°C ;低于或高于此溫度，GGT_015的合成能力會(huì)相對降低。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白質(zhì)分子，其特征在于，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
2.一種分離出的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，其特征在于，該谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因具有編碼權(quán)利要求I中蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，其特征在于，該谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，其特征在于，該序列無內(nèi)含子，具有1782bp完整的開放讀碼框，編碼593個(gè)氨基酸的多肽。
5.一種獲取谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因的方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟一、提取沿海紅樹林淤泥樣品，提取起總DNA并純化； 步驟二、將純化后的總基因組經(jīng)Sau3AI酶切處理； 步驟三、將酶切產(chǎn)物連接到pUC18/BamHI (BAP)載體上，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中構(gòu)建紅樹林宏基因組文庫，用含有1-氨芐青霉素、Y -谷酰基-對硝基苯胺、葡萄糖和氨基酸復(fù)合物的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基，從文庫中篩選谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶陽性克隆，通過高通量篩選得到陽性克隆子； 步驟四、經(jīng)測序和Blast比較設(shè)計(jì)引物，以陽性克隆子的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行鏈?zhǔn)矫妇酆戏磻?yīng)，從而克隆得到如SEQ ID N0:1所示的目的片段。
6.如權(quán)利要求5所述·的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，其特征在于，步驟四中設(shè)計(jì)用于擴(kuò)展目的片段的引物包括:上游引物 Fl:5’ -CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’ ；下游引物 F2:5’ -CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’。
7.—種重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)采用如權(quán)利要求5中所述方法獲取谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，該基因具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列； (2)用上述基因目的片段經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切，與表達(dá)載體pET-32a(+)連接； (3)用表達(dá)載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞BL21，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，從培養(yǎng)物分離、純化，獲得重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
8.一種利用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)采用如權(quán)利要求5中方法制備重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶； (2)將上述重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液或純化的酶液加入到谷氨酰胺溶液中，以Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)PH為7.0-8.0，在15_30°C條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)6_12h，合成γ-聚谷氨酸，并加入終止液終止Y-聚谷氨酸反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8所述利用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，合成的Y-聚谷氨酸的分子量大小為5 10kDa。
10.如權(quán)利要求8所述利用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步驟(2)中酶催化反應(yīng)的最適溫度為20°C，最適pH值為7.0，最適底物濃度為IOM谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供一種合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶及其編碼基因，該氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白質(zhì)分子具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，該谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。另外，本發(fā)明還公開了一種利用重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，該方法通過采用本發(fā)明的重組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，以谷氨酰胺類單體為原料合成γ-聚谷氨酸。本發(fā)明的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能夠以谷氨酰胺類單體為原料合成γ-聚谷氨酸，對豐富谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶家族成員，開發(fā)新的γ-聚谷氨酸合成途徑都具有重要意義。
文檔編號C12P13/02GK103232980SQ20131013985
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者葉茂 申請人:華南理工大學(xué)