專利名稱：一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說是一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法。
背景技術(shù)：
水母是海洋中重要的刺胞動物，含有大量刺細(xì)胞，在受到刺激后可放出刺絲并釋放毒素。人若被蜇傷會出現(xiàn)皮膚局部紅腫、刺痛、壞死，嚴(yán)重的可出現(xiàn)全身癥狀，甚至死亡。近年來水母暴發(fā)頻繁，水母蜇傷的事件越來越多，嚴(yán)重影響海濱旅游、海洋捕撈、海軍訓(xùn)練及海上運動項目等涉?；顒?。據(jù)青島第一海水浴場醫(yī)務(wù)室的統(tǒng)計，每年的7月底-9月初，每天有上百人因水母蜇傷接受簡單的治療。水母毒素主要存在于刺絲囊中，為預(yù)防水母蜇傷必須研究其刺絲囊細(xì)胞釋放的影響因素及機(jī)制，因此需要以未釋放的刺絲囊細(xì)胞作為研究對象，但由于水母在捕撈過程中，觸手刺絲囊細(xì)胞會不可避免的部分釋放，所以建立合適方法分離出高純度未釋放的水母刺絲囊細(xì)胞是研究其釋放影響因素及機(jī)制的基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實意義。此外制備高純度未釋放的水母刺絲囊細(xì)胞為改進(jìn)毒素的提取方法，以獲取雜質(zhì)更少的水母毒素提供了原材料，對深入研究水母毒素有著重要意義。由于釋放、未釋放水母刺 絲囊以及其他雜質(zhì)的沉降系數(shù)和體積大小存在差異，采用合適的離心速度與不同目數(shù)的篩子可以實現(xiàn)未釋放水母刺絲囊的分離，操作具有可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法。為達(dá)到此目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，將冷凍溶解后水母觸手離心，收集上清液，上清液經(jīng)離心后，收集沉淀，將沉淀用海水溶解后，過濾收集濾液，離心后收集的沉淀為高純度未釋放的水母刺絲囊。進(jìn)一步的說，取冰凍水母觸手并加入其重量2-0.5倍的海水，采用電磁攪拌或玻璃棒攪拌，以加速溶解，溶解后再攪拌10-30min ;而后冷凍離心，離心力為100-1000 X g，離心5_20min,收集上清液,上清液經(jīng)冷凍離心,離心力為1000-4000X g,離心時間5_20min ；收集沉淀，將沉淀再經(jīng)海水溶解，溶解后20-100目篩網(wǎng)過濾，濾液再經(jīng)300-600目篩過濾，收集濾液；濾液以8000-16000 X g冷凍離心5-20min，收集沉淀即為高純度未釋放水母刺絲囊樣品。其中溶解沉淀的海水用量與溶解冰凍水母觸手時所用海水量相等。所述海水為2_6°C的海水。所述冷凍離心溫度0_6°C。將所得高純度未釋放刺絲囊沉淀用少量海水溶解后，加入0.4%臺盼藍(lán)染色劑少量染色，l-2min后置顯微鏡下血球板觀察計數(shù)未釋放刺絲囊拒染比例，檢驗未釋放刺絲囊活性。本發(fā)明的優(yōu)點:1.本發(fā)明成功實現(xiàn)了水母未釋放刺絲囊的制備，制取的水母未釋放刺絲囊純度高，活性好。2.本發(fā)明所用制備方法快速，設(shè)備簡單，可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，為水母刺絲囊釋放機(jī)制及水母毒素的研究奠定了基礎(chǔ)。3.采用本發(fā)明方法分離得到樣品置光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)，未釋放刺絲囊比例超過97%。采用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性，刺絲囊細(xì)胞幾乎全部拒染，證明制備的刺絲囊細(xì)胞完整未受損傷。


圖1為本發(fā)明實施例提供的所制取的水母未釋放刺絲囊在光學(xué)顯微鏡下的照片(X640)。圖2為本發(fā)明實施例提供的所制取的水母未釋放刺絲囊臺盼藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下的照片(X 1600)。圖3A、B、C、D分別為本發(fā)明不同實施例所制取的水母未釋放刺絲囊的純度檢驗結(jié)
果O
具體實施例下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實施例。實施例1:I)取冰凍水母觸手50g于燒杯中，加入2-6°C的海水25ml，電磁攪拌至冰凍觸手全部溶解后再攪拌lOmin，紗網(wǎng)濾除殘余觸手。2)將步驟I)中所得的濾液進(jìn)行4°C冷凍離心5min，離心力為100Xg后，收集上清，混勻后，4°C冷凍離心5min，離心力為1000 X g，收集沉淀，待用。3)步驟2)中所得沉淀用25ml的2_6°C的海水溶解后，20目篩過濾，濾液再經(jīng)300目篩過濾，收集濾液，4°C冷凍離心5min，離心力為8000 X g，收集沉淀即為高純度未釋放的水母刺絲囊樣品(參見圖1)。即溶解沉淀的海水用量與溶解冰凍水母觸手時所用海水量相等。4)將步驟3)分離所得的高純度未釋放刺絲囊沉淀用2ml海水溶解后，取少量樣品置顯微鏡下血球板觀察計數(shù)未釋放刺絲囊比例，檢驗未釋放刺絲囊的純度(參見表I和圖3A)。5)將步驟3)分離所得的高純度未釋放刺絲囊沉淀用2ml海水溶解后，加入0.4%臺盼藍(lán)染色劑少量，l_2min后置顯微鏡下觀察刺絲囊染色情況，幾乎全部拒染，制備的刺絲囊細(xì)胞完整未受損傷(參見圖2)。表1水母未釋放刺絲囊純度檢測表
權(quán)利要求
1.一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于:將冷凍溶解后水母觸手離心，收集上清液,上清液經(jīng)離心后，收集沉淀,將沉淀用海水溶解后，過濾收集濾液，離心后收集的沉淀為高純度未釋放的水母刺絲囊。
2.按權(quán)利要求1所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于:取冰凍水母觸手并加入其重量2-0.5倍的海水，采用電磁攪拌或玻璃棒攪拌，以加速溶解，溶解后再攪拌10-30min ;而后冷凍離心,離心力為100-1000 X g,離心5_20min,收集上清液，上清液經(jīng)冷凍離心，離心力為1000-4000 X g，離心時間5-20min ;收集沉淀，將沉淀再經(jīng)海水溶解，溶解后20-100目篩網(wǎng)過濾，濾液再經(jīng)300-600目篩過濾，收集濾液；濾液以8000-16000 Xg冷凍離心5-20min，收集沉淀即為高純度未釋放水母刺絲囊樣品。
3.按權(quán)利要求1或2所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于: 所述海水為2-6°C的海水。
4.按權(quán)利要求1或2所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于: 所述冷凍離心溫度0-6 °C。
5.按權(quán)利要求1或2所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于: 將所得高純度未釋放刺絲囊沉淀用少量海水溶解后，加入0.4%臺盼藍(lán)染色劑少量染色，l-2min后置顯微鏡下血球板觀察計數(shù)未釋放刺絲囊拒染比例，檢驗未釋放刺絲囊活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說是一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法。將冷凍溶解后水母觸手離心，收集上清液，上清液經(jīng)離心后，收集沉淀，將沉淀用海水溶解后，過濾收集濾液，離心后收集的沉淀為高純度未釋放的水母刺絲囊。將上述所得水母刺絲囊置光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)，未釋放刺絲囊比例超過97%。采用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性，刺絲囊細(xì)胞幾乎全部拒染，證明制備的刺絲囊細(xì)胞完整未受損傷。本發(fā)明方法快速、簡單，操作性強(qiáng)，為水母觸手刺絲囊釋放的影響因素及機(jī)制的研究提供了重要的方法指導(dǎo)。
文檔編號C12N5/07GK103232968SQ20131014031
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者李鵬程, 薛偉, 于華華, 李榮鋒, 邢榮娥, 劉松, 秦玉坤, 陳曉琳, 胡林峰 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所