專利名稱：一種使用通用緩沖液快速克隆基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，屬于基因克隆領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
遺傳工程涉及大量將DNA片段在不同的物種或細胞間轉(zhuǎn)移的操作，其中一個基本的步驟，就是將得到的DNA片段——無論它們是經(jīng)過PCR擴增還是別的手段產(chǎn)生——插入到克隆載體中形成重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒能夠在細胞或者微生物的體內(nèi)增殖，使得該DNA片段能長期保存，擴增，以便于后續(xù)研究。1991年，Holton.T.A和Graham M.W.等發(fā)明了“T-A”克隆方法。其原理是，用taqDNA聚合酶擴增的DNA，其3端都有突出一個腺嘌呤脫氧核苷酸(簡稱A);因此，研究人員研制出一種3端有突出一個胸腺嘧啶脫氧核苷酸(簡稱T)的線性載體。載體和PCR產(chǎn)物的末端形成一對互補堿基，經(jīng)T4DNA連接酶作用，兩個線性DNA分子形成一個閉合的環(huán)狀分子。這種閉合的環(huán)狀分子成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌后，就能得到穩(wěn)定的重組質(zhì)粒。這種預(yù)制的線性載體被稱簡稱為T載體。T載體的使用大大提高了 DNA的連接效率，長期以來得到廣泛的使用，但是也有幾個明顯的缺點:第一，連接時間長。為了在轉(zhuǎn)化后得到更多的克隆數(shù)和更高的陽性率，通常T載體和插入片段需要用T4DNA連接酶在室溫連接12-16個小時。這一步花費了很長的實驗時間。第二，只有taq DNA聚合酶擴增的DNA片段帶有懸掛的A，而對高保真DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物，是不含懸掛A的平端PCR產(chǎn)物。這類DNA分子需要用taq酶處理，使其3端加上一個腺嘌呤脫氧核苷酸，才能和T載體連接(通常簡稱為加A反應(yīng))。因此，在用T4噬菌體DNA連接酶作用之前，平端PCR產(chǎn)物要經(jīng)過加A反應(yīng)和`核酸純化兩個步驟。這兩步操作耗時長達3 — 5個小時，同時也損耗了一部分DNA，極大地降低了克隆效率。上述的加A反應(yīng)和連接反應(yīng)，必須經(jīng)過兩步處理，是因為加A反應(yīng)使用的taq DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液最佳pH在8.3 — 9.0之間，連接反應(yīng)使用的T4噬菌體DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液最佳pH在7.5 — 8.0之間。這兩種酶在對方的工作緩沖液都沒有活性。因此，針對上述缺點，我們產(chǎn)生了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，使用一種通用緩沖液，將雙鏈DNA片段快速連接到克隆載體上，省略已有的兩個酶反應(yīng)之間DNA分子的核酸的純化步驟，以提高實驗效率。本發(fā)明提出的使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，包括以下步驟:( I)制備一種通用緩沖液，該通用緩沖液中各組分的摩爾濃度為:三羥甲基氨基甲烷(Tris)，濃度為250 — 500毫摩爾/升，氯化鎂(MgC12)，濃度為10 - 20毫摩爾/升，二硫蘇糖醇(DTT)，濃度為10 - 20毫摩爾/升，
三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(ATP)，濃度為5 —10毫摩爾/升，三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)，濃度為100 - 200微摩爾/升，氯化六氨合高鈷(Hexamminecobalt(III) Chloride),濃度為 50—100 微摩爾 / 升，用鹽酸將通用緩沖液的pH值調(diào)至8.0 ；(2)用高保真DNA聚合酶 (如pfu DNA polymerase)通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)得到雙鏈DNA片段溶液；(3)取2微升步驟(I)的通用緩沖液，加入5微升步驟(2)得到的雙鏈DNA溶液，再加入I微升體積濃度為3單位/微升的Taq DNA聚合酶，在68 — 74°C下作用5 —10分鐘，形成含有3末端含有未配對的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)的粘端DNA分子溶液；(4)在步驟(3)的反應(yīng)體系中加入I微升濃度為50納克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸載體(T載體)和I微升濃度為5單位/微升的T4噬菌體DNA連接酶，室溫下反應(yīng)5 — 30分鐘，使粘端DNA分子和載體DNA分子形成環(huán)狀的DNA質(zhì)粒，成為連接產(chǎn)物；(5)取5微升步驟(4)得到的連接產(chǎn)物，置于50微升感受態(tài)大腸桿菌細胞溶液，冰浴30分鐘，在42°C熱處理90秒，冰浴2分鐘，再加入200 — 500微升細菌液體培養(yǎng)基，在37°C搖床上以200轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)45分鐘后，從中取出200 — 400微升菌液涂布于含有I暈克異丙基β —D一硫代半乳糖昔(IPTG)和0.8暈克5_漠_4_氣-3- Π引噪-6-D-半乳糖苷(Xgal)的固體培養(yǎng)基平板上，在37°C溫箱培養(yǎng)12 — 16小時，在平板上克隆出白色和藍色的大腸桿菌細菌菌落。本發(fā)明提出的使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，其優(yōu)點是:(I)本發(fā)明方法中配制和使用的通用緩沖液，其中含有Taq DNA聚合酶和T4噬菌體DNA連接酶，這兩種酶在本溶液中都單獨具有活性。因此，如果一個DNA雙鏈分子要經(jīng)過兩個酶處理，這兩個酶可以先后加入同一個緩沖液中，不需要在兩步酶處理反應(yīng)之間對DNA做純化處理，這樣不僅節(jié)省了近1-3個小時的操作時間，而且也減少了 DNA在純化過程中的損耗。(2)傳統(tǒng)的T4噬菌體DNA連接酶緩沖液反應(yīng)時間比較長，需要的實驗條件從幾個小時到幾十個小時不等，而聚乙二醇，六氨合高鈷等添加劑加入到T4噬菌體DNA連接酶的工作緩沖液中，能極大的縮短反應(yīng)時間。將這類添加劑加入到通用緩沖液中，更進一步縮短了克隆連接的時間。(3)使用本發(fā)明方法得到的連接產(chǎn)物，進行轉(zhuǎn)化后的分析表明，無論轉(zhuǎn)化子的數(shù)目，藍白斑的比例，白斑的陽性率，都能達到傳統(tǒng)的克隆反應(yīng)的結(jié)果，極大提高了實驗效率。
具體實施例方式本發(fā)明提出的使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，包括以下步驟:( I)制備一種通用緩沖液，該通用緩沖液中各組分的摩爾濃度為:三羥甲基氨基甲烷(Tris)，濃度為250 — 500毫摩爾/升，氯化鎂(MgC12)，濃度為10 - 20毫摩爾/升，二硫蘇糖醇(DTT)，濃度為10 - 20毫摩爾/升，三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(ATP)，濃度為5 —10毫摩爾/升，三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)，濃度為100 - 200微摩爾/升，
氯化六氨合高鈷(Hexamminecobalt(III) Chloride),濃度為 50—100 微摩爾 / 升，用鹽酸將通用緩沖液的pH值調(diào)至8.0 ；(2)用高保真DNA聚合酶(如pfu DNA polymerase)通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)得到雙鏈DNA片段溶液；(3)取2微升步驟(I)的通用緩沖液，加入5微升步驟(2)得到的雙鏈DNA溶液，再加入I微升體積濃度為3單位/微升的Taq DNA聚合酶，在68 — 74°C下作用5 —10分鐘，形成含有3末端含有未配對的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)的粘端DNA分子溶液；(4)在步驟(3)的反應(yīng)體系中加入I微升濃度為50納克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸載體(T載體)和I微升濃度為5單位/微升的T4噬菌體DNA連接酶，室溫下反應(yīng)5 — 30分鐘，使粘端DNA分子和載體DNA分子形成環(huán)狀的DNA質(zhì)粒，成為連接產(chǎn)物；(5)取5微升步驟(4)得到的連接產(chǎn)物，置于50微升感受態(tài)大腸桿菌細胞溶液，冰浴30分鐘，在42°C熱處理90秒，冰浴2分鐘，再加入200 — 500微升細菌液體培養(yǎng)基，在37°C搖床上以200轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)45分鐘后，從中取出200 — 400微升菌液涂布于含有I暈克異丙基β —D一硫代半乳糖昔(IPTG)和0.8暈克5_漠_4_氣-3- Π引噪-6-D-半乳糖苷(Xgal)的 固體培養(yǎng)基平板上，在37°C溫箱培養(yǎng)12 — 16小時，在平板上克隆出白色和藍色的大腸桿菌細菌菌落。以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明方法作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1:比較通用緩沖液和其它緩沖液對平端PCR產(chǎn)物連接到T載體的效率(I)制備通用緩沖液，含有下列成份:三羥甲基氨基甲烷(Tris)濃。C是250毫摩爾/升，氯化鎂(MgC12)濃。C是10毫摩爾/升，二硫蘇糖醇(DTT)濃。C是10毫摩爾/升，三磷酸腺苷(ATP)濃。C是5毫摩爾/升，三磷酸脫氧腺苷(dATP)濃。C是100微摩爾/升，氯化六氨合高鈷(Hexamminecobalt (III)Chloride)是50微摩爾/升。將溶液分成5份,分別用鹽酸將溶液的pH值調(diào)整為7.6,7.8,8.0,8.2,8.4;制備taq DNA聚合酶的工作緩沖液，其成份為:三羥甲基氨基甲烷(Tris濃。C是500毫摩爾/升，氯化鎂(MgC12)濃。C是10毫摩爾/升，氯化鉀(KCl)濃。C是50毫摩爾/升，三磷酸脫氧腺苷(dATP)濃。C是100微摩爾/升，鹽酸將溶液的pH值調(diào)整為8.3。制備T4DNA聚合酶的工作緩沖液，其成份為:三羥甲基氨基甲烷(Tris)濃。C是200毫摩爾/升，氯化鎂(MgC12)濃。C是20毫摩爾/升，二硫蘇糖醇(DTT)濃。C是50毫摩爾/升，三磷酸腺苷(ATP)濃。C是5毫摩爾/升，用鹽酸將溶液的pH值調(diào)整為7.6 ；(2)用高保真DNA聚合酶(pfu DNA polymerase)通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)制備長度為Ikb的平端雙鏈DNA分子，整個反應(yīng)體系中依次加入下列物質(zhì):19微升去離子水，25微升含有pfu DNA聚合酶的預(yù)制PCR反應(yīng)液，2.5微升濃度為10微摩爾/升的上游引物(其序列為 5 - CCGGTACCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC 一 3)，取 2.5 微升濃度為 10 微摩爾 / 升的下游引物(其序列為5 - CCGGTACCCAAATATGTATCCGCTCATG 一 3)，I毫升濃度為10納克/毫升的質(zhì)粒pet28a溶液。聚合酶鏈式反應(yīng)的反應(yīng)條件為94°C下反應(yīng)5分鐘，9°C下反應(yīng)30秒，5°C下反應(yīng)30秒，7°C下反應(yīng)90秒，共30個循環(huán)，7°C下延伸10分鐘。反應(yīng)得到1000個堿基長度的雙鏈DNA片段，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，進行膠回收，定量為60納克/微升；(3)將步驟(I)制備的七種緩沖液各取2微升，加入5微升步驟(2)得到的雙鏈DNA溶液，再加入I微升體積濃度為3單位/微升的Taq DNA聚合酶，在72°C下作用10分鐘，形成含有3末端含有未配對的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)的粘端DNA分子溶液，置于冰上，(4)在步驟(3)的反應(yīng)體系中加入I微升濃度為50納克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸載體(T載體)和I微升濃度為5單位/微升的T4噬菌體DNA連接酶，室溫下反應(yīng)30分鐘，使粘端DNA分子和載體DNA分子形成環(huán)狀的DNA質(zhì)粒，成為連接產(chǎn)物；(5)取5微升步驟(4)得到的連接產(chǎn)物，置于50微升感受態(tài)大腸桿菌細胞溶液，冰浴30分鐘，在42°C熱處理90秒，冰浴2分鐘，再加入200 — 500微升細菌液體培養(yǎng)基，在37°C搖床上以200轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)45分鐘后，從中取出200 — 400微升菌液涂布于含有I暈克異丙基β —D一硫代半乳糖昔(IPTG)和0.8暈克5_漠_4_氣-3- Π引噪-6-D-半乳糖苷(Xgal)的固體培養(yǎng)基平板上，在37°C溫箱培養(yǎng)12 — 16小時，在平板上會長出白色和藍色的細菌菌落(6)對步驟(5)的平板上的克隆進行計數(shù)。如果平板上白斑個數(shù)超過20，則每個平板上各挑取20個白色克隆。如果平板上白斑個數(shù)不足20，則挑取所以白斑。采用天根的菌落PCR鑒定試劑盒進行鑒定。擴增產(chǎn)物中含有特異性的為陽性克隆，沒有擴增產(chǎn)物或者擴增產(chǎn)物長度不同的克隆為陰性克隆。表一各種pH值下的克隆效果(值取3次平均)
權(quán)利要求
1.一種使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)制備一種通用緩沖液，該通用緩沖液中各組分的摩爾濃度為: 三羥甲基氨基甲烷(Tris)，濃度為250 - 500毫摩爾/升， 氯化鎂(MgC12)，濃度為10 - 20毫摩爾/升， 二硫蘇糖醇(DTT)，濃度為10 - 20毫摩爾/升， 三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(ATP)，濃度為5 —10毫摩爾/升， 三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)，濃度為100 - 200微摩爾/升， 氯化六氨合高鈷(Hexamminecobalt (III) Chloride),濃度為50—100微摩爾/升， 用鹽酸將通用緩沖液的pH值調(diào)至8.0 ； (2)用高保真DNA聚合酶(如pfuDNA polymerase)通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)得到雙鏈DNA片段溶液； (3)取2微升步驟(I)的通用緩沖液，加入5微升步驟(2)得到的雙鏈DNA溶液，再加入I微升體積濃度為3單位/微升的Taq DNA聚合酶，在68 — 74°C下作用5—10分鐘，形成含有3末端含有未配對的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)的粘端DNA分子溶液； (4)在步驟(3)的反應(yīng)體系中加入I微升濃度為50納克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸載體(T載體)和I微升濃度為5單位/微升的T4噬菌體DNA連接酶，室溫下反應(yīng).5 - 30分鐘，使粘端DNA分 子和載體DNA分子形成環(huán)狀的DNA質(zhì)粒，成為連接產(chǎn)物； (5)取5微升步驟(4)得到的連接產(chǎn)物，置于50微升感受態(tài)大腸桿菌細胞溶液，冰浴.30分鐘，在42°C熱處理90秒，冰浴2分鐘，再加入200 — 500微升細菌液體培養(yǎng)基，在37°C搖床上以200轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)45分鐘后，從中取出200 - 400微升菌液涂布于含有I毫克異丙基β —D一硫代半乳糖昔(IPTG)和0.8暈克5_漠_4_氣-3- 1 丨噪-6-D-半乳糖昔(Xgal)的固體培養(yǎng)基平板上，在37°C溫箱培養(yǎng)12 — 16小時，在平板上克隆出白色和藍色的大腸桿菌細菌菌落。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用通用緩沖液快速克隆基因的方法，屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法首先配制一種通用緩沖液，Taq DNA聚合酶和T4噬菌體DNA連接酶在該緩沖液中都具有酶活性。將待連接的DNA雙鏈分子加入通用緩沖液中，用Taq DNA聚合酶對DNA做加A處理后，再直接加入T4噬菌體DNA連接酶和線性載體，得到連接產(chǎn)物，進行轉(zhuǎn)化后完成克隆反應(yīng)。本發(fā)明方法省略了Taq DNA聚合酶和T4噬菌體DNA連接酶反應(yīng)之間DNA分子核酸的純化步驟，極大提高了實驗效率。
文檔編號C12N15/66GK103205449SQ201310142219
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者吳勁松, 俞萍, 李曉晨, 孫克非 申請人:天根生化科技(北京)有限公司