專利名稱：一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物功能性物質(zhì)的提取方法以及其具體應(yīng)用，特別地涉及一種從蓮子中提取風(fēng)味酶的方法，以及使用該風(fēng)味酶生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，屬于植物提取及植物飲料生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
荷葉為睡蓮科植物蓮的葉，其上表面深綠色或黃綠較粗糙，下表面淡灰棕色，較光滑，中心有一突起的葉柄殘基，有多條粗脈由中心向四周射出。荷葉質(zhì)脆，易破碎，微有清香氣，味淡微潘。蓮在中國(guó)的分布區(qū)域極廣，主產(chǎn)于湖南、湖北、浙江、江蘇、江西等水源廣闊之地。無(wú)論是根據(jù)用途而區(qū)分的花蓮、藕蓮或子蓮，還是按照不同分類而歸屬的各種蓮，在收獲后均留余大量荷葉。荷葉營(yíng)養(yǎng)豐富，包含有大量活性化學(xué)物質(zhì)，如蓮堿、荷葉堿、原荷葉堿、亞美罌粟堿、前荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、D-N-甲基烏藥堿、番荔枝堿、鵝掌楸堿、槲皮素、異槲皮甙、蓮甙、蘋果酸、葡萄糖酸、草酸、琥珀酸、鞣質(zhì)、O-去甲荷葉堿、牛心果堿、斑點(diǎn)亞洲罌粟堿、去氫荷葉堿，以及維生素C、枸櫞酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、蛋白質(zhì)、尼克酸、硫胺素、胡蘿卜素等，還含抗有絲分裂作用的堿性成分。除此之外，還含有鈣、磷、鐵等多種微量元素以及黃酮類化合物，這些化合物均具有明顯的生物活性和生理功能
由于荷葉包含了上述具有活性功能的多種化合物物質(zhì)，因此其具有多種生物活性，在日常生活中具有開(kāi)胃升清、清熱祛暑、健脾利濕、升發(fā)清陽(yáng)、生津止渴、化瘀止血等功效，可治療暑熱煩渴、頭痛眩暈、食少腹脹、瀉痢、白帶、脫肛、吐血、衄血、咯血、便血、崩漏、產(chǎn)后惡露不凈、損傷瘀血、水氣浮腫等癥。正式由于荷葉如此之功效，于1991年11月被我國(guó)列于第二批“藥食同源”的名單之中。在疾病的預(yù)防與治療方面，長(zhǎng)期飲用荷葉茶汁，可起到降脂減肥、預(yù)防動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病的預(yù)防作用。在日常飲食方面，由于新鮮的荷葉具有令人愉悅的清香氣味，香氣清新淡雅，富有田園氣息，同時(shí)能夠賦予食物和/或飲料以令人賞心悅目的顏色。因此，荷葉風(fēng)味食品頗受崇尚健康、回歸自然的現(xiàn)代人的歡迎。其中，一個(gè)非常典型的實(shí)例便是荷葉飯，通過(guò)利用荷葉的清香、清新、淡綠色而使得米飯清香四溢，令人食欲大增。另個(gè)實(shí)例是荷葉粥，通過(guò)荷葉的熬制，可使得荷葉粥具有淡雅清香、色澤鮮亮，湯水糯甜，倍受歡迎。此外，將荷葉制作成炎熱季節(jié)的清涼飲料，亦具有廣闊的商業(yè)前景和良好的經(jīng)濟(jì)利益，一方面可以實(shí)現(xiàn)大量荷葉的深加工利用，另一方面可以也可以將其作為潛在的香料資源加以開(kāi)發(fā)，拓寬其新的應(yīng)用領(lǐng)域。雖然荷葉具有多種功效，以及在食品與飲料開(kāi)發(fā)上具有可預(yù)見(jiàn)的良好前景，但一直以來(lái)，在這些研發(fā)過(guò)程中面臨到的香氣較淡、難以持久的缺陷卻一直未能得到圓滿解決，這極大地限制了荷葉的深度應(yīng)用和拓展開(kāi)發(fā)，成為目前荷葉應(yīng)用研究領(lǐng)域的瓶頸和關(guān)鍵所在。
目前，荷葉風(fēng)味食品的增香研究多集中于采用護(hù)色和掩澀手段，或者采用復(fù)配的方式。黃阿根等人(“荷葉飲料的工藝研究”，《江蘇農(nóng)業(yè)研究》，2000年，21 (4))公開(kāi)了一種荷葉飲料的制備方法。所述方法以荷葉為主要原料，以d-葡萄糖酸-δ -內(nèi)酯為護(hù)色劑，以環(huán)糊精為掩澀劑，研制出了具有保健功能的荷葉飲料。彭凌等人(“果味荷葉汁清涼飲料的研制”，《食品工業(yè)科技》，2003，24 (4))公開(kāi)了一種包含荷葉的清涼飲料的制備方法。所述方法是將荷葉浸提物脫苦后與菠蘿汁復(fù)配，生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品具有荷葉、菠蘿的特有混合香氣、口感清涼、酸甜適口，非常適用于炎熱季節(jié)的消暑解渴。陳海光等人(“荷葉保健茶的研制及其功效研究”，《食品工業(yè)科技》，2002年)公開(kāi)了一種荷葉保健茶。所述保健茶以荷葉為主要原料，再配以綠茶、山楂、甘草、菊花等原料，從而得到了一種新型的保健袋泡茶，口感醇和、香味濃郁，具備顯著的降脂保健功能。龔吉軍等人(“荷葉奶茶研制”，《食品研究與開(kāi)發(fā)》，2009年，第30卷第3期)公開(kāi)了一種荷葉奶茶的研制工藝。所述工藝是將荷葉進(jìn)行提取后，經(jīng)過(guò)各種處理，并加入脫脂奶粉，加熱、te裝、殺菌后得到荷葉奶茶，并確定最佳比例。此外，對(duì)于荷葉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提取，雖然可使用微波、超聲等進(jìn)行提取，但現(xiàn)有技術(shù)中涉及微波、超聲的提取僅只能針對(duì)某一類物質(zhì)，而不能同時(shí)兼顧提取多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的簡(jiǎn)便提取和同時(shí)提取，仍存在繼續(xù)研究的需要。另外，迄今為止，雖然人們對(duì)荷葉的利用進(jìn)行了大量的研究，但這些仍側(cè)重于護(hù)色、掩澀、脫苦，例如采用物理或化學(xué)方法來(lái)掩蓋荷葉飲料中的苦味，或者采用添加其它果汁等甜味劑的方法來(lái)稀釋或掩埋苦味。這些外源性物質(zhì)的引入，盡管在一定程度上增加了荷葉飲料的芳香味，但導(dǎo)致這些物質(zhì)的香味、甜味等與荷葉本身的味覺(jué)屬性不協(xié)調(diào)，同時(shí)通過(guò)添加化學(xué)掩蔽劑來(lái)掩蔽荷葉汁的苦味，存在食品安全的問(wèn)題。迄今為止，對(duì)于生物酶的增香技術(shù)，尤其是同類物質(zhì)的協(xié)同增香方面的研究仍鮮有報(bào)道。而大量的研究表明，風(fēng)味酶是植物中香氣形成的關(guān)鍵酶類，促使香氣形成的機(jī)理在于，風(fēng)味酶通過(guò)水解植物中的糖苷類香氣前體物質(zhì)從而釋放出香氣物質(zhì)。而經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，荷葉中并不存在目標(biāo)風(fēng)味酶，因此單純靠荷葉本身并不能釋放出足量的香氣，而蓮仁(亦稱“蓮子”)中含有一種目標(biāo)酶即β_葡萄糖苷酶，該酶屬于水解酶類，能夠水解結(jié)合于未端、非還原性的β-D-糖苷鍵，并同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)配基，從而釋放出香氣。由于蓮子與荷葉都來(lái)自同一種植物蓮，因此可將蓮子用于荷葉飲料的增香。此外，通過(guò)使用酶降解技術(shù)進(jìn)一步降低了荷葉飲料的苦澀感，同時(shí)替代了使用化學(xué)物質(zhì)掩蔽苦澀感而產(chǎn)生的引入外源性物質(zhì)的弊端，從而可最大限度地保持并增強(qiáng)了荷葉的特有清新風(fēng)味，更具天然。針對(duì)此發(fā)現(xiàn)，張亮(“蓮子β -葡萄糖苷酶特性及其對(duì)荷葉飲料增香作用的研究”，《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文》，2008年)對(duì)此進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)蓮子中的β -葡萄糖苷酶進(jìn)行了提取、分離純化，并將其應(yīng)用荷葉飲料中，考察了其對(duì)荷葉飲料的增香效果。雖然該論文對(duì)葡萄糖苷的增香效果進(jìn)行了研究，但對(duì)于葡萄糖苷的提取工藝、其分離純化等方面仍存在改進(jìn)余地，如果實(shí)現(xiàn)最大程度的β_葡萄糖苷的高效提取和簡(jiǎn)單的分離純化等，仍存有需求。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的深入研究，在付出了創(chuàng)造性勞動(dòng)后，從而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明方法中，通過(guò)選擇合適提取時(shí)間和功率的微波提取，可同時(shí)兼顧最大程度地提取荷葉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和增香物質(zhì)，從而增強(qiáng)了隨后的β_葡萄糖苷的增香效果，起到了協(xié)同效果。本發(fā)明的目的在于提供一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，所述方法包括如下步驟:
(1)稱取荷葉粉，加入一定量的水調(diào)勻，在水浴下浸提20-60min，然后微波提取I分鐘，微波功率為220W，微波提取完成后，過(guò)濾，除渣；
(2)常壓脫氣，調(diào)節(jié)pH值；
(3)加入蓮子風(fēng)味酶，在水浴下進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后趁熱過(guò)濾除渣；
(4)調(diào)味:在步驟(3)得到的液體中加入維生素C和蔗糖，然后過(guò)濾、滅菌、冷卻、罐裝，從而得到增香去苦的荷葉飲料；
在本發(fā)明提供一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的所述方法中，步驟(I)中的荷葉粉與水的質(zhì)量比為1:60-200,該范圍包括了其中的任何子區(qū)間范圍，也包括了其中的任何具體點(diǎn)值之比，如 1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150、1:160、1:170、1:180、1:190 或 1:200。水浴溫度為 60-100°C，如為 60°C、70°C、80°C、90°C或 100。。。浸提時(shí)間為20-60 min,如20 min、30 min、40 min、50 min或60 min。為了更充分地進(jìn)行浸提，可在浸提過(guò)程中每5 min攪動(dòng)一次。浸提完成后，進(jìn)行微波提取0.5-1.5分鐘，優(yōu)選為I分鐘，微波功率為200-240W，優(yōu)選為220W，微波提取完成后，過(guò)濾、除渣，如通過(guò)多層紗布過(guò)濾。在本發(fā)明提供一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的所述方法中，步驟(2)中，常壓脫氣溫度為 80-95 V，例如脫氣溫度可為 80°C、82°C、84°C、86°C、88°C、90°C、92°C 或 94V。脫氣后，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至3-6，例如為3、4、5或6。在本發(fā)明提供一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的所述方法中，步驟(3)中的水浴酶解反應(yīng)溫度為40-50°C，時(shí)間為0.5-1.5h。在本發(fā)明提供一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的所述方法中，步驟(4)中，所述調(diào)味是:以步驟(3)得到的液體的質(zhì)量為基準(zhǔn)，向其中加入0.02% -0.10%的維生素C和1-4%的蔗糖。其中，在步驟(3)中加入的蓮子風(fēng)味酶是指從蓮子中得到的葡萄糖苷酶，其酶活力為2-20 U，其提取方法如下:
提取方法:稱取蓮子，加入聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)和預(yù)冷至4°C的鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液，冰浴上研磨成漿，5°C下11000 rpm離心7分鐘，取上清液，用同一緩沖溶液定容至50 mL,即得粗酶液，然后經(jīng)分離純化即得所述蓮子風(fēng)味酶。其中以質(zhì)量比計(jì)，蓮子與PVPP的比例為2-10:1，例如可為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。所述鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液的pH為2.2-3.8，優(yōu)選為2.5-3.5，最優(yōu)選為3.0。蓮子與所述鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液的質(zhì)量比為1:5-10，例如可為1:5、1:6、1:7、1:8、1:9 或 1:10。
提取完成后，為了提高純度可按照如下公知的方法進(jìn)行分離純化:
純化方法:可使用已經(jīng)公知的任何現(xiàn)有技術(shù)純化，例如根據(jù)張亮(“蓮子β_葡萄糖苷酶特性及其對(duì)荷葉飲料增香作用的研究”，《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文》，2008年)中第三章所述方法進(jìn)行提純。例如β -葡萄糖苷酶的硫酸銨鹽析范圍為50-70%的飽和度，選用DEAE-5纖維素進(jìn)行離子交換柱層析，再經(jīng)Sephadex G-100純化。由于在提取時(shí)使用特定的緩沖溶液和特定PH值而使得所得粗酶液的酶活大大提高(見(jiàn)實(shí)施例)，從而使得純化后的β -葡萄
糖苷酶的比酶活力高于965.03 X 10_3 U/mg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)中得到的比酶活力。本發(fā)明的所述方法取得了如下效果:
1.通過(guò)使用微波提取，顯著地同時(shí)增大了最終荷葉飲料中的黃酮含量和生物堿含量，提供了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和嗅感。2.通過(guò)合適緩沖液體和pH值的選擇，而獲得了更高酶活的β_葡萄糖苷酶，進(jìn)而得到了具有更高比酶活力的純化葡萄糖苷酶。3.獲得了具有良好嗅感的荷葉飲料，香味悠長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式如下對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明和/或闡述，但應(yīng)該理解，這只是對(duì)本發(fā)明方法做出的示例性描述，其意圖是用來(lái)解釋/闡述本發(fā)明的實(shí)施方法，而非用來(lái)限定和/或限制本發(fā)明，更非將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于此。制備例1:鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液的制備
分別量取5 ml 0.2 mol/L的鄰苯二甲酸水溶液、4.070 ml 0.2 mol/L的HCl水溶液進(jìn)行混合，然后用水稀釋至20 ml，得到pH為2.2的鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖溶液。將上述4.07 ml的0.2 mol/L HCl溶液的體積分別替換為3.960 ml,3.295 ml、2.642 ml,2.022 ml、1.470 ml、0.990 ml、0.597 ml、0.263 ml，從而分別得到 pH 為 2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6 和 3.8 的緩沖溶液。制備例2: β -葡萄糖苷酶的提取
稱取9份重量相同的蓮子，分別加入與蓮子質(zhì)量比為1:5的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，然后加入預(yù)冷至4°C的上述pH為2.2-3.8的鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液(共9份)，其與蓮子的質(zhì)量比為1:8，冰浴上研磨成漿，5°C下11000 rpm離心7分鐘，取上清液，用同一緩沖溶液定容至50 mL，即得粗酶液，分別編號(hào)為1-9，即編號(hào)I對(duì)應(yīng)pH 2.2緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)2對(duì)應(yīng)pH 2.4緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)3對(duì)應(yīng)pH 2.6緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)4對(duì)應(yīng)pH 2.8緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)5對(duì)應(yīng)pH 3.0緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)6對(duì)應(yīng)pH 3.2緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)7對(duì)應(yīng)pH 3.4緩沖溶液所得的粗酶液、編號(hào)8對(duì)應(yīng)pH 3.6緩沖溶液所得的粗酶液和編號(hào)9對(duì)應(yīng)pH 3.8緩沖溶液所得的粗酶液。制備例3: β -葡萄糖苷酶分離純化
按照張亮(“蓮子葡萄糖苷酶特性及其對(duì)荷葉飲料增香作用的研究”，《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文》，2008年)中的方法，對(duì)上述編號(hào)1-9的粗酶液進(jìn)行分離純化，條件如下:硫酸銨鹽析范圍為50-70%的飽和度，選用DEAE-5纖維素進(jìn)行離子交換柱層析，再經(jīng)S印hadexG-100純化。每個(gè)編號(hào)所得到的純化后β-葡萄糖苷酶的比酶活力菌均高于965.03 X 10_3U/mg
酶活測(cè)試
根據(jù)張亮(“蓮子β_葡萄糖苷酶特性及其對(duì)荷葉飲料增香作用的研究”，《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文》，2008年)第二章2.2.2中的測(cè)試方法，使用pNPG法分別測(cè)定編號(hào)1_9粗酶液的酶活，結(jié)果見(jiàn)下表I。表1.不同pH緩沖溶液所得粗酶液的酶活
權(quán)利要求
1.一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，所述方法包括如下步驟: (1)稱取荷葉粉，加入一定量的水調(diào)勻，在水浴下浸提20-60min，然后微波提取I分鐘，微波功率為220W，微波提取完成后，過(guò)濾，除渣； (2)常壓脫氣，調(diào)節(jié)pH值； (3)加入蓮子風(fēng)味酶，在水浴下進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后趁熱過(guò)濾除渣； (4)調(diào)味:在步驟(3)得到的液體中加入維生素C和蔗糖，然后過(guò)濾、滅菌、冷卻、罐裝，從而得到增香去苦的荷葉飲料； 其中，在步驟(3)中加入的蓮子風(fēng)味酶是從蓮子中得到的β-葡萄糖苷酶，其酶活力為2-20 U，其提取方法如下: 稱取蓮子，加入聚乙烯聚吡咯烷酮和預(yù)冷至4°C的鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液，冰浴上研磨成漿，5°C下11000 rpm離心7分鐘，取上清液，用同一緩沖溶液定容至50 mL，得粗酶液，然后經(jīng)分離純化即得所述蓮子風(fēng)味酶。
2.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:步驟(I)中的荷葉粉與水的質(zhì)量比為1:60-200。
3.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:步驟(I)中的水浴溫度為60-100°C。
4.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:步驟(I)中的浸提時(shí)間為20-60 min。
5.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:步驟(2)中的常壓脫氣溫度為80-95°C，脫氣后，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至3-6。
6.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:步驟(3)中的水浴酶解反應(yīng)溫度為40-50°C，時(shí)間為0.5-1.5 h。
7.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:步驟(4)中的調(diào)味是以步驟(3)得到的液體的質(zhì)量為基準(zhǔn)，向其中加入0.02% -0.10%的維生素C和1-4%的蔗糖。
8.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:在蓮子風(fēng)味酶的提取方法中，蓮子與聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量比為2-10:1，蓮子與緩沖液的質(zhì)量比為1:5-10。
9.如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:在蓮子風(fēng)味酶的提取方法中，所述鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液的PH為2.2-3.8。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，其特征在于:在蓮子風(fēng)味酶的提取方法中，所述鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液的pH為3.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶法生產(chǎn)增香去苦荷葉飲料的方法，包括如下步驟(1)稱取荷葉粉，加入一定量的水調(diào)勻，水浴浸提，浸提完成后，微波提取，過(guò)濾，除渣；(2)常壓脫氣，調(diào)節(jié)pH值；(3)加入蓮子風(fēng)味酶，在水浴下進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后趁熱過(guò)濾除渣；(4)調(diào)味在荷葉飲料中加入維生素C和蔗糖，然后過(guò)濾、滅菌、冷卻、罐裝，從而得到增香去苦的荷葉飲料。通過(guò)對(duì)所得飲料進(jìn)行感官評(píng)定和指標(biāo)檢測(cè)，證明可得到香氣濃郁、嗅感柔和的荷葉飲料。本發(fā)明所述方法通過(guò)荷葉中的功能物質(zhì)浸提，極大地改善了飲料品質(zhì)，且進(jìn)一步經(jīng)過(guò)風(fēng)味酶處理后，具有更濃厚、醇正、柔和的香氣和嗅感，具有良好的市場(chǎng)化前景和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A23L2/38GK103190675SQ20131014248
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者楊凌唐, 汪華 申請(qǐng)人:洪湖市晨光實(shí)業(yè)有限公司