專利名稱：來(lái)源于淡水魚蝦加工副產(chǎn)物的生物活性肽及其制備方法
來(lái)源于淡水魚蝦加工副產(chǎn)物的生物活性肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是涉及一種來(lái)源于淡水魚蝦的具有生理活性的功能肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
自古以來(lái)，淡水生物資源就是人類食物的重要來(lái)源。近數(shù)十年來(lái)，人類對(duì)水產(chǎn)品的需求有了很大增長(zhǎng)。在20世紀(jì)70年代，人類所利用的總動(dòng)物蛋白質(zhì)(包括飼料用的魚粉)中，約有80 87.5% (鮮品計(jì)算)來(lái)源于淡水生物資源。淡水魚蝦是人們喜愛的食品，它們不但富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、礦物質(zhì)和維生素等人類必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且味道鮮美，其蛋白質(zhì)和脂肪都比其他動(dòng)物性肉類易于被人體消化吸收。沼蝦，是我國(guó)養(yǎng)殖量最大的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，各大水系均能生長(zhǎng)。江蘇里下河地區(qū)是我國(guó)羅氏沼蝦最為集中的養(yǎng)殖區(qū)域，其沼蝦加工業(yè)十分發(fā)達(dá)。在蝦仁加工過(guò)程中，產(chǎn)生了大量蝦殼下腳料，蝦頭、蝦殼約占整個(gè) 蝦重的30 40%。蝦頭、蝦殼富含蛋白質(zhì)、甲殼素、膽堿、磷脂、膽固醇、蝦青素、蝦紅素以及磷、鈣、鐵、錳、鋅、銅等多種礦質(zhì)元素，其中的多種物質(zhì)對(duì)人體都十分有益:每IOOg蝦殼含39.3g蛋白質(zhì)，大大高于鱔魚、對(duì)蝦、鯧魚、帶魚等水產(chǎn)品以及牛肉、豬肉、雞肉等肉制品；每10(^蝦殼含鈣20000mg，素有“鈣王”之稱，可預(yù)防由缺鈣引起的骨質(zhì)疏松癥，對(duì)缺鈣兒童也極其有益；每IOOg蝦殼含磷1005mg，經(jīng)常食用，可降低血壓和膽固醇，抗骨質(zhì)疏松，開胃健脾；蝦青素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗氧化劑，并且有助于消除因時(shí)差反應(yīng)而產(chǎn)生的“時(shí)差癥”;此外，蝦殼還具有鎮(zhèn)靜作用，常用來(lái)治療神經(jīng)衰弱以及植物神經(jīng)功能紊亂癥。以往這些下腳料基本是直接扔掉，不僅浪費(fèi)了資源，而且污染環(huán)境，近年來(lái)很多蝦殼被用于殼聚糖的提取，或者是烘干粉碎后作為飼料，也有一些調(diào)味品企業(yè)，利用蝦頭釀制蝦味醬，但這些利用都沒有充分實(shí)現(xiàn)資源的高值化加工。如何深度開發(fā)這些下腳料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，不僅對(duì)于淡水魚蝦下腳料的綜合利用和環(huán)境保護(hù)有重要意義，而且可以提高淡水魚蝦資源的利用率和提高企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。淡水生物中不但蛋白質(zhì)含量豐富，而且在長(zhǎng)期特異閉鎖環(huán)境中進(jìn)化的蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)、功能與陸地動(dòng)植物有較大的差異，因此是生產(chǎn)功能活性物質(zhì)很好的特定的蛋白質(zhì)資源。日本、歐美等國(guó)把淡水生物中功能活性物質(zhì)系列產(chǎn)品的研究與開發(fā)作為發(fā)展淡水保健食品和藥物的一個(gè)重要方向。酶水解蛋白質(zhì)具有反應(yīng)條件溫和、水解過(guò)程易控制、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。酶水解魚蛋白不僅含有豐富的必需氨基酸、小肽、微量元素、微生物等多種小分子營(yíng)養(yǎng)成分，具有生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)，而其也含有?；撬?、生物活性肽等多種活性成分，具有顯著的保健功效，能滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)與保健的雙重追求。它還可以廣泛用作海鮮調(diào)味料、膨化食品和方便、保健食品的基料，除滿足一般消費(fèi)者家庭需要外，還適合生長(zhǎng)期的嬰幼兒、病后體質(zhì)虛弱者及高血壓患者作強(qiáng)化食品的輔料，其產(chǎn)品能以粉狀、液體和糊狀等多種形態(tài)存在，便于按照不同生理狀態(tài)人群、不同作業(yè)條件下人群的營(yíng)養(yǎng)特征和市場(chǎng)需求情況，與其它食品基料充分混合在一起，重新加工成豐富多彩的淡水工程食品，具有很好的發(fā)展前景，市場(chǎng)潛力巨大。目前利用生物催化技術(shù)獲得生物活性肽產(chǎn)品已經(jīng)成為健康保健食品添加劑領(lǐng)域的開發(fā)熱點(diǎn)。日本對(duì)來(lái)自水產(chǎn)品的生物活性多肽進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)其序列中含有降血壓、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等活性的多種肽段。(I)日本早在10年前就開始著手研究從魚體廢棄物中提取生物活性蛋白，1993年日本化成公司開發(fā)了從魚鱗(日本專利JP593000和JP5155900)及從鮭魚魚皮中提取生物活性肽的工藝(日本專利:JP2001200000) ；(2)美國(guó)專利US2002164681使用木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等對(duì)魚皮蛋白進(jìn)行酶解后得到生物相容性很高的生物活性蛋白肽；(3)歐洲專利EP682873使用胃蛋白酶、胰蛋白酶從魚肉加工廢棄物中制得生物活性肽。因此，根據(jù)底物的特性和對(duì)水解產(chǎn)物品質(zhì)、生物活性的要求，對(duì)食品蛋白酶進(jìn)行高活性定向催化的篩選與優(yōu)化，以專一高效的多酶復(fù)合體建立先進(jìn)的生物催化及轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，用以生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)型調(diào)味品和功能性蛋白粉，將是蛋白類食品添加劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種來(lái)源于淡水魚蝦的生物活性功能肽。本發(fā)明以廉價(jià)易得的淡水魚蝦加工副產(chǎn)物為原料，采用復(fù)合酶體系催化技術(shù)分步水解原料，經(jīng)過(guò)分離純化后得到具有清除自由基及還原力的生物活性多肽。得到的生物活性功能肽進(jìn)一步可加工成口服液、膠囊、片劑等，同時(shí)還可得到富含多不飽和脂肪酸的蝦油，達(dá)到變廢為寶、綜合高效利用淡水資源的目的。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種簡(jiǎn)單有效的制備上述功能肽的方法。詳細(xì)內(nèi)容如下:一、原料的準(zhǔn)備首先將淡水魚蝦的加工副產(chǎn)物如蝦頭、蝦殼等洗凈，用刀式混合研磨儀粉碎并均質(zhì)化制成糜；然后加入一定量的去離子水，煮沸約30min，冷卻至室溫；煮沸的目的有兩個(gè):一是可以殺死微生物，二是煮熟后的原料更易被水解，有利于提高回收率。二、復(fù)合酶催化反應(yīng)1、第一步水解將煮沸冷至室溫的樣品分兩組，分別調(diào)節(jié)pH值至6 8。第一組加入蛋白酶A(來(lái)自 Aspergillus oryzae)、蛋白酶 P (來(lái)自 Aspergillus Melleus)、蛋白酶 M(來(lái)自Aspergillus oryzae)中的一種或幾種，酶:底物=1: 2000 10000 (W/W);第二組不加酶，作為對(duì)照；然后在30 60°C條件下反應(yīng)2 8h，2、第二步水解第一步水解結(jié)束后，調(diào)節(jié)兩組反應(yīng)體系的pH值至6 8。第一組加入蛋白酶 C160(來(lái)自 Bacillus stearothermophilus)、蛋白酶 ProteAX G(來(lái)自 Aspergillusoryzae)、肽酶R(來(lái)自Rhizopus oryzae)中的一種或幾種，酶:底物=1: 2000 10000 (W/W);第二組不加酶，作為對(duì)照；然后在45 75°C條件下反應(yīng)2 8h，；

反應(yīng)結(jié)束,水解液在沸水浴中處理IOmin終止酶的反應(yīng)；
冷卻至室溫，加入溶劑如正己烷提取漂浮的油層，分離有機(jī)相與水相，水相10000 20000g冷凍離心20 30min，得到的上清液無(wú)菌過(guò)濾后，冷藏保存?zhèn)溆谩?br> 三、水解物的分離與純化
采用GE healthcare AKTA explorer快速蛋白純化系統(tǒng)，以凝膠為填料對(duì)水解物進(jìn)行分離純化，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)洗脫液的吸收值，并收集不同峰的洗脫液；
測(cè)定不同峰的洗脫液的清除自由基能力和還原能力。
清除自由基能力的測(cè)定:采用ABTS法，Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。
還原能力的測(cè)定:采用FRAP(Ferric_reducing antioxidant power)法測(cè)定。
技術(shù)效果
在淡水魚蝦加工過(guò)程中存在大量的下腳料，目前這些下腳料主要是用來(lái)生產(chǎn)殼聚糖，其附加值很低，造成大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。本發(fā)明正好利用這些優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源而具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明以淡水魚蝦加工下腳料為原料，原料廉價(jià)易得；實(shí)現(xiàn)淡水生物資源的高效增值利用，節(jié)約了成本；
2、本發(fā)明所使用的酶屬于食品級(jí)的酶，安全性高；
3、本發(fā)明采用復(fù)合酶催化技術(shù)，分步水解，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶解過(guò)程和時(shí)間的控制，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率與生物活性功能大大提高；
4、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

I)圖1中，左圖是水解前后清除 自由基能力的測(cè)定的圖，右圖是還原力測(cè)定的圖。
2)圖2是凝膠過(guò)濾分離的片段的紫外吸收?qǐng)D譜。
3)圖3中，左圖是ABTS法測(cè)定清除自由基能力的圖，右圖是FRAP法測(cè)定還原力的圖。
4)圖4是肽類水解物的質(zhì)譜分析的圖譜(上面為Frac II，下面為Frac III)。
具體實(shí)施方式
下面以羅氏沼蝦為例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
1、首先將新鮮的羅氏沼蝦蝦頭、蝦殼解凍，洗凈，用研磨儀粉碎均質(zhì)成糜；
2、加入I倍羅氏沼蝦濕重的去離子水，煮沸20min，然后冷卻至室溫；樣品分兩組，第一組加酶，第二組不加酶作為對(duì)照；
3、調(diào)節(jié)兩組樣品的pH值至7.5，第一組按照羅氏沼蝦濕重:酶=I: 8000 (W/W)加入蛋白酶 A(來(lái)自 Aspergillus oryzae)、蛋白酶 P (來(lái)自 Aspergillus Melleus)；
4、45°C、IOOrpm 反應(yīng) 6h ；
5、反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)整兩組樣品的pH值至7.5，第一組按照羅氏沼蝦濕重:酶=1: 8000 (W/W)加入蛋白酶 C160 (來(lái)自 Bacillus stearothermophi lus)、蛋白酶 ProteAXG(來(lái)自 Aspergillus oryzae)；
6、6CTC、IOOrpm 反應(yīng) 6h ；
7、反應(yīng)結(jié)束后,沸水浴處理IOmin,終止反應(yīng)；
8、向反應(yīng)體系中加入等體積的正己烷，45°C萃取30min，分離有機(jī)相和水相；9、水相20000g離心20min,得到的上清液采用凝膠過(guò)濾層析,層析條件如下:(I)米用 GE healthcare AKTA explorer 快速蛋白純化系統(tǒng)，SephadexG-25(16mmX25mm)柱；(2)樣品先用 0.22 μ m 濾膜過(guò)濾(Millipore)；(3)上樣0.5mL，其蛋白含量10mg/mL，用Milli Q水作為流動(dòng)相洗脫，洗脫速率1mT,/mi η ；(4)分別在280nm和215nm處檢測(cè)洗脫液的吸收率，并收集不同峰的洗脫液；(5)不同峰的洗脫液各取lmL，冷凍干燥后分別檢測(cè)所得水解物的清除自由基能力和還原能力；經(jīng)過(guò)上述步驟的分離純化,最終分離出四個(gè)不同峰(Frac 1、Frac I1、Frac III和Frac IV)的肽類水解物。對(duì)得到的不同的肽類水解物進(jìn)行分析檢測(cè):1、肽含量測(cè)定:米用Lowry法和OPA(o-phthaldialdehyde)法,BSA和甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定水解液中肽含量；2、清除自由基能力的測(cè)定:采用ABTS法，Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定；3、還原能力的測(cè)定:采用 FRAP (Ferric-reducing antioxidant power)法測(cè)定；4、質(zhì)譜分析:MALD1-T0F/MS (matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry)分析妝的分子量。各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下:1、加工副產(chǎn)物水解前后清除自由基和還原力的比較見說(shuō)明書附圖中的圖12、凝膠過(guò)濾分離的片段的紫外吸收見說(shuō)明書附圖中的圖2各Fraction的肽含量如下:FracI:0.12mM/mg/mlFracI1:0.62mM/mg/mlFracII1:0.86mM/mg/mlFracIV:0.07mM/mg/ml3、肽類水解物的清除自由基和還原力的測(cè)定見說(shuō)明書附圖中的圖34、肽類水解物的質(zhì)譜分析見說(shuō)明書附圖中的圖4根據(jù)分析檢測(cè)結(jié)果得到:Frac II具有很強(qiáng)的還原力，其分子量主要分布在1000 5000Da ；Frac III具有很強(qiáng)的清除自由基的能力，其分子量小于1000Da。
權(quán)利要求
1.一種生物活性功能肽。
2.權(quán)利要求1所述的生物活性功能肽來(lái)源淡水魚蝦。
3.權(quán)利要求2所述的生物活性功能肽，所用原料來(lái)自淡水魚蝦加工副產(chǎn)物如:蝦頭、蝦殼。
4.權(quán)利要求1所述的生物活性功能肽的制備過(guò)程應(yīng)包括如下步驟: (1)原料的清洗、蒸煮； (2)兩步蛋白酶或肽酶的復(fù)合催化水解反應(yīng)； (3)脫脂； (4)水解液的離心分離，得到上清液； (5)上清液的凝膠過(guò)濾層析。
5.權(quán)利要求4所述的步驟得到的具有很強(qiáng)的清除自由基能力的生物活性功能肽的分子量小于lOOODa。
6.權(quán)利要求4所述的步驟得到的具有很強(qiáng)的還原力的生物活性功能肽分子量范圍是1000 5000Da。
7.權(quán)利要求4所述其制備過(guò)程中所用的酶為以下的一種或幾種:蛋白酶A(來(lái)自Aspergillus oryzae)、蛋白酶P(來(lái)自 Aspergillus Melleus)、蛋白酶M(來(lái)自 Aspergillusoryzae)、蛋白酶 C 160 (來(lái)自 Bacillus stearothermophi lus)、蛋白酶 ProteAX G(來(lái)自Aspergillus oryzae)及妝酶 R(來(lái)自 Rhizopus oryzae)
8.權(quán)利要求4所 述，得到的水解物經(jīng)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行分離純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來(lái)源于淡水魚蝦加工副產(chǎn)物的生物活性功能肽及其制備方法。采用該法得到的肽類水解物，具有清除自由基的能力、并具有很強(qiáng)的還原力，可廣泛用于保健食品、功能性食品、化妝品等產(chǎn)品中，具有廣闊的市場(chǎng)前景；本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單可行，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23J1/04GK103168912SQ20131014295
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日 公開號(hào)201310142951.8
發(fā)明者戚國(guó)祥, 居向東, 孫媛霞 申請(qǐng)人:江蘇戚伍水產(chǎn)發(fā)展股份有限公司, 孫媛霞